儀器分析與生物應(yīng)用：圓二色儀

1、圓二色儀,一、基本原理 二、應(yīng)用領(lǐng)域 三、基本操作規(guī)程 四、注意事項(xiàng),圓二色儀 Circular Dichroism（CD）,Jasco715,圓二色儀,圓二色儀是用來檢測(cè)生物大分子蛋白質(zhì)、多肽、核酸等在溶液下的構(gòu)象。 多肽和蛋白質(zhì):-螺旋、-折疊; 多聚核苷酸及核酸:單股、雙股、三股螺旋 糖:螺旋結(jié)構(gòu) 各類生物大分子特定的構(gòu)象是生物功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。測(cè)定生物大分子的這種結(jié)構(gòu)并聯(lián)系功能研究它們的變化，對(duì)了解這些分子如何表現(xiàn)功能有重要作用。 圓二色光譜法及其儀器已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、配位化學(xué)和藥物化學(xué)等領(lǐng)域,成為研究有機(jī)化合物的立體構(gòu)型的一個(gè)重要方法。,光束,光學(xué)活性樣品,各向異性差異吸

2、收,CD信號(hào),圓二色光譜,圓二色儀結(jié)構(gòu)示意圖,一、基本原理:,1、平面偏振光 2、圓偏振光 3、橢圓偏振光 4、圓二色光譜,平面偏振光 的電向量 E,起偏振器,自然光的電向量 E,將自然光通過一個(gè)起偏振器,出來的就是平面偏振光 起偏振器(尼科爾棱鏡): 只允許某一偏振面的光通過，而將其余偏振面的光都擋住的光學(xué)元件,1、平面偏振光 振動(dòng)方向在同一平面內(nèi)的電磁波為平面偏振光。,2、圓偏振光,兩束互相垂直，振幅相等的平面偏振光，其位相相差四分之一波長(zhǎng)時(shí)，其合成矢量E的末端軌跡沿著螺旋形旋轉(zhuǎn)，如果對(duì)著光的傳播方向觀察，電矢量E的末端軌跡為一圓，這就是圓偏振光。,實(shí)線表示兩個(gè)互相垂直的波，其位相相差1/

3、4波長(zhǎng)；虛線表示疊加而成的圓偏振；中間長(zhǎng)線箭頭所指為光波傳播方向；測(cè)向指向虛線的箭頭表示疊加后的電向量。,左、右圓偏振光,平面偏振光可分解為振幅、頻率相同,旋轉(zhuǎn)向相反的兩圓偏振光。 電矢量按順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的圓偏振光稱為右圓偏振光（R） 電矢量按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的圓偏振光稱為左圓偏振光（L） 兩束振幅、頻率相同,旋轉(zhuǎn)方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光,3、橢圓偏振光 兩束偏振光的振幅(強(qiáng)度) 不相同,則合成的將是一束橢圓偏振光。,圓偏振光的合成 (a),(b)振幅相等的左、右圓偏振光合成平面偏振光； (c),(d)振幅不相等的左、右圓偏振光合成橢圓偏振光,4、 圓二色性,圓二色性(circ

4、ular dichroism, CD):光學(xué)活性物質(zhì)將平面偏振光改變成橢圓偏振光的效應(yīng) 是利用不對(duì)稱性分子對(duì)左右圓偏振光吸收的不同來進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析 對(duì)左、右旋圓偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值A(chǔ) (Al - Ad) 圓二色性的存在使通過該物質(zhì)傳播的平面偏振光變?yōu)闄E圓偏振光,且只在發(fā)生吸收的波長(zhǎng)處才能觀察到。所形成的橢圓的橢圓率為: = tg- 1 短軸/長(zhǎng)軸,圓二色性及其定量關(guān)系,當(dāng)左、右圓偏振光進(jìn)入物質(zhì)時(shí)，光學(xué)活性物質(zhì)對(duì)左、右偏振光的吸收值 EL 和 ER 不同，其差值 E=EL-ER 就是圓二色性 ELER 0，CD 為 “” ELER 0, CD 為 “” 常用橢圓度 或摩爾橢圓度 來表

5、示 （ALAR)d AL和AR為經(jīng)介質(zhì)吸收后左右圓偏振光的振幅， d為介質(zhì)長(zhǎng)度。,圓二色光譜,圓二色儀結(jié)構(gòu)示意圖,5、圓二色光譜 對(duì)R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象。這種吸收程度的不同與波長(zhǎng)的關(guān)系稱圓二色譜，是一種測(cè)定分子不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的光譜法。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，也可用來測(cè)定核酸和多糖的立體結(jié)構(gòu)。,蛋白質(zhì)的圓二色譜,在蛋白質(zhì)分子中，肽鏈的不同部分可分別形成 -螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角等特定的立體結(jié)構(gòu)。這些立體結(jié)構(gòu)都是不對(duì)稱的 蛋白質(zhì)的肽鍵在紫外185240納米處有光吸收，因此它在這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)有圓二色性 典型的蛋白質(zhì)的紫外圓二色譜： 螺旋的譜:雙負(fù)峰形的，-折疊:單負(fù)

6、峰形的，無規(guī)卷曲在波長(zhǎng)很短的地方出單峰,600,700,800,500,紅,橙,黃,綠,藍(lán),紫,近紫外,遠(yuǎn)紫外,400,300,245,380,宇宙線, 射線,X射線,遠(yuǎn)紫外,紫外,nm,紅外,微波,可見,nm,能量增加,波長(zhǎng)增加,光 譜,320,185,遠(yuǎn)紫外區(qū)：（185245nm）,是肽鍵的吸收峰范圍，該區(qū)域反映蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象。蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象可以初分為4種形式， 螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。,多聚L賴氨酸在不同構(gòu)象條件下的標(biāo)準(zhǔn)圓二色譜 1 為100的螺旋，pH=11.5 2 為100的折疊，pH=11.5 加熱至50后或加1SDS 3 為100的無規(guī)卷曲，pH=4-5,近紫外區(qū)蛋白質(zhì)處

7、于天然狀態(tài)時(shí)，圓二色性曲線是：190 nm左右為正峰，205 - 235nm范圍內(nèi)為負(fù)槽。 對(duì)圓二色譜的計(jì)算可以求得各種結(jié)構(gòu)的含量，推斷分子的主鏈構(gòu)象。,近紫外區(qū)：（245320nm）,蛋白質(zhì)含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它們?cè)?40350納米處有光吸收,當(dāng)它們處于分子不對(duì)稱環(huán)境中時(shí)也表現(xiàn)出圓二色性。這一范圍的圓二色性反映蛋白質(zhì)分子中上述氨基酸殘基環(huán)境的性質(zhì)。 二硫鍵一般都是不對(duì)稱的，它在圓二色性光譜上，于195-200nm和250-260處有譜峰；色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸殘基的側(cè)鏈其譜峰在230-310nm之間，色氨酸殘基側(cè)鏈的譜峰一般集中在290-310nm之間，但有時(shí)也會(huì)向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)從

8、而與酪氨酸殘基側(cè)鏈的譜峰重疊。在250-260nm之間，苯環(huán)的譜峰又與二硫鍵的譜峰重疊。這一區(qū)域的 CD 譜能給出“局域”側(cè)鏈間相互的信息,能敏感的反映出蛋白質(zhì)構(gòu)象的細(xì)微化,300nm的區(qū)域，包括可見區(qū)域 對(duì) CD 譜的貢獻(xiàn)主要來自血紅素一類含有金屬離子的生色團(tuán)，這一段的CD 譜對(duì)金屬離子的氧化態(tài)、配位體以及鏈鏈相互作用均是敏感的。,儀器不同掃描功能,波長(zhǎng)掃描 單波長(zhǎng)變溫掃描 不同波長(zhǎng)變溫掃描,二. 圓二色儀應(yīng)用領(lǐng)域,蛋白質(zhì)折疊研究 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究 DNA/RNA相互作用 酶動(dòng)力學(xué)研究 有機(jī)立體化學(xué)研究 光化學(xué)物質(zhì)純度檢測(cè) 藥物量的分析,天然有機(jī)化學(xué) 生化和大分子 金屬?gòu)?fù)合物化學(xué) 醫(yī)學(xué) 農(nóng)業(yè)化

9、學(xué) 物理化學(xué) 快速掃描實(shí)驗(yàn),應(yīng)用范圍,主要用于天然有機(jī)化學(xué)與立體有機(jī)化學(xué)，物理化學(xué)，生物化學(xué)與宏觀大分子，金屬絡(luò)合物，聚合物化學(xué)、熱變性和化學(xué)變性研究等相關(guān)的科學(xué)研究。面向?qū)W科 ： 化學(xué)、化工、材料、環(huán)境、生物、藥學(xué)、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品、生命科學(xué)等。,實(shí)驗(yàn)室常用分析領(lǐng)域：,分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用： 測(cè)定生物大分子的空間結(jié)構(gòu)。分析基因工程產(chǎn)物及其基因定點(diǎn)突變后蛋白質(zhì)構(gòu)象變化：如基因定點(diǎn)突變后引起蛋白質(zhì)氨基酸變化，從而構(gòu)象發(fā)生改變。通過圓二色儀揭示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的基本信息。,化學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：,分析不同物理化學(xué)因素：如不同的溫度條件;不同種類和不同濃度的有機(jī)溶劑，對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響作用。,高

10、分子材料科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：,高分子材料例如蠶絲蛋白，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度。對(duì)蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)分析，可為未來研究新型材料，合成材料提供典范，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在國(guó)防航天等領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前途。,實(shí)驗(yàn)舉例： 分析基因點(diǎn)突變后蛋白質(zhì)構(gòu)象變化 分析不同物理化學(xué)因素對(duì)構(gòu)象的改變作用 小分子的構(gòu)型分析,1 分析基因定點(diǎn)突變后蛋白質(zhì)構(gòu)象變化 例如：基因點(diǎn)突變后 蛋白質(zhì)氨基酸變化 構(gòu)象改變 通過圓二色儀揭示,發(fā)表文章一,J.of Protein Chemistry,Vol.18,No.5,1999 Methanol-Induced Unfolding and Refolding of Cutochrome

11、b5 and Its P40V Mutant Monitored by UV-Visible,CD,and Fluorescence Spectra 應(yīng)用紫外，CD，熒光光譜分析甲醇誘導(dǎo)的細(xì)胞 色素b5及其突變體P40V的去折疊和重新折疊現(xiàn)象,甲醇濃度（0-62） 兩個(gè)負(fù)峰（208nm和218nm)， 相對(duì)強(qiáng)度有所改變。 -螺旋含量未增加,正常細(xì)胞色素b5與脫輔基細(xì)胞色素b5的比較,甲醇濃度（0-62） 兩個(gè)負(fù)峰逐漸變成217nm 附 近的一個(gè)寬峰。 -螺旋含量增加,正常細(xì)胞色素b5,脫輔基蛋白細(xì)胞色素b5,-50,-100,10,0 62,0 62,細(xì)胞色素 b5在 250500nm區(qū)域內(nèi)

12、CD譜圖,當(dāng)甲醇濃度逐漸增加時(shí)，色氨酸和酪氨酸的吸收峰（270nm和298nm)強(qiáng)度逐漸降低直至最終消失，表明這兩個(gè)芳香性氨基酸殘基周圍的環(huán)境發(fā)生了變化。同時(shí)，血紅素鐵六配位、低自旋的特征譜帶（391nm的正峰和418的負(fù)峰）也逐漸降低，表明血紅素從疏水腔內(nèi)脫出。,2 分析不同理化因素對(duì)構(gòu)象的改變作用,影響蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的因素： 化學(xué)因素：酸、堿；有機(jī)溶劑(如乙醇、乙醚、丙酮 等)；重金屬鹽類；脲、胍；表面活性劑等。 物理因素：溫度(熱、冷)、紫外線照射、高壓等。 這些變化不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，即肽鏈的共價(jià)鍵并未斷開。變性作用的實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)的改變或破壞。,Thermal Dena

13、turation of Cyt b5V61y,細(xì)胞色素b5 在不同溫度（2595度）條件下的 CD 光譜,細(xì)胞色素b5 在不同濃度（062） 甲醇條件下的 CD 光譜,50,100,100,0 62,發(fā)表文章二,Eur.J.Biochem.268,6600-6606(2001)FEBS 2001 The natural silk spinning process A nucleation-dependent aggregation mechanism? 天然蠶絲自旋過程依賴于成核作用的凝聚機(jī)制？,時(shí)間和晶種對(duì)蠶絲絲心蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,圖A 是不加晶種時(shí)，絲心蛋白的構(gòu)象隨時(shí)間的變化，在較短時(shí)

14、間里(0-18小時(shí))表現(xiàn)為在-198nm處的負(fù)峰，主要為random coil構(gòu)象；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)被197nm處的正峰以及217nm處的負(fù)峰取代，主要為-sheet構(gòu)象。,圖B為加入晶種時(shí)，絲心蛋白的構(gòu)象隨時(shí)間的變化，同樣表現(xiàn)為隨時(shí)間的增加，構(gòu)象由random coil向-sheet的轉(zhuǎn)變。但是加入晶種后，構(gòu)象轉(zhuǎn)變的速率明顯加快，比如，不加晶種時(shí)，需74小時(shí)達(dá)到的構(gòu)象轉(zhuǎn)變純度，加入20晶種僅需6個(gè)小時(shí),發(fā)表文章三,復(fù)旦學(xué)報(bào) 41：113；2002 結(jié)核桿菌Ag85B的表達(dá)純化和結(jié)構(gòu)分析,Ag85B 的表達(dá)和分析,Ag85B基因的克隆和表達(dá) 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化和鑒定 純化產(chǎn)物 Ag85B 結(jié)構(gòu)

15、的初步分析 不同條件下Ag85B CD圖譜的變化,Ag85B 基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)和分析,Ag85B 的純度鑒定（HPLC分析結(jié)果）,Ag85B 質(zhì)譜分析結(jié)果,不同條件下Ag85B CD圖譜的變化,1、抗結(jié)核藥物INH對(duì)Ag85B結(jié)構(gòu)的影響 2、過氧化氫(H2O2)對(duì)Ag85B結(jié)構(gòu)的影響 3、熱變性對(duì)Ag85B結(jié)構(gòu)的影響,Ag85B的 CD 光譜,Helix:47.8 %; Beta: 26.4 %; Turn: 6.2 %; Random: 19.7 %,不同濃度的INH對(duì)Ag85B結(jié)構(gòu)的影響,過氧化氫對(duì)Ag85B結(jié)構(gòu)的影響,熱變性對(duì)Ag85B結(jié)構(gòu)的影響,CD,發(fā)表文章四,Structur

16、al Transformation of Cytochrome c and Apo Cytochrome c Induced by Sulfonated Polystyrene Gong, J.; Yao, P.; Duan, H.; Jiang, M.; Gu, S.; Chunyu,L.; Biomacromolecules; (Article); 2003; 4(5); 1293-1300. 磺化聚苯乙烯誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C和脫輔基細(xì)胞色素C的結(jié)構(gòu)變化,apo cyt c是脫輔基細(xì)胞色素c 38S-PS1是 磺化度為38%的 磺化聚苯乙烯,發(fā)表文章五,細(xì)胞色素c氧化酶可溶性結(jié)構(gòu)域中Val16

17、2突變體對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響 采用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變技術(shù)和CD等技術(shù)考察與癌癥相關(guān)的Vall62的突變體對(duì)細(xì)胞色素c氧化酶可溶性結(jié)構(gòu)域的影響。 應(yīng)用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建并獲得了SDII的突變體蛋白 CD譜構(gòu)象特征的改變，暗示突變體可能破壞了一些-折疊或增加了-螺旋的成分。 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào) 2003.10，No.10；17331737,野生型蛋白的CD譜表現(xiàn)為215nm的單負(fù)峰，是典型的折疊特征 突變體的 CD 呈現(xiàn)出雙負(fù)峰特征,CD對(duì)小分子的構(gòu)型分析,通過對(duì)激素、抗生素和藥物的結(jié)構(gòu)分析可進(jìn)一步了解這些藥物的分子藥理機(jī)理，從而設(shè)計(jì)新的藥物。,樣品： 木脂素 分子量300-500,

18、三、基本操作規(guī)程,（一） 開 機(jī) （二） 測(cè)量 （三） 分析 （四） 關(guān)機(jī),（一）開 機(jī),1. 先通氮?dú)?，流?5L/min，時(shí)間約5分鐘。以清除 光學(xué)系統(tǒng)中的空氣。當(dāng)測(cè)量波長(zhǎng)小于200 nm 時(shí) , 光會(huì)被殘存的少量氧氣所吸收,在此情況下應(yīng)加大 氮?dú)饬髁?，以抵消氧氣的吸收。具體如下： 200185nm 1015 L/min 185180nm 1520 L/min 180nm 20100 L/min,2. 先開電源 “ Power1” (紅燈)能聽到光源的點(diǎn)火聲，光源亮后，再開“Power 2”（綠燈）。 3. 啟動(dòng)J715驅(qū)動(dòng)程序：雙擊Hardware Manager像標(biāo)，儀器自檢。全部 “

19、OK” 即正常。,（二） 測(cè)量,儀器通過自檢，開機(jī)等30分鐘穩(wěn)定后，則可以進(jìn)行測(cè)量。 1. 選擇測(cè)量方式 2. 設(shè)測(cè)量參數(shù) 3. 設(shè)實(shí)驗(yàn)注釋,1、計(jì)算光學(xué)常數(shù) 2、扣減背景、平滑噪音。 3、變換圖的標(biāo)尺。 4、拷貝CD圖到寫字板。 .,標(biāo)準(zhǔn)分析軟件：,二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件：,根據(jù) CD 測(cè)定結(jié)果，采用 “Yang” 經(jīng)驗(yàn) 公式，計(jì)算得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。,（四）關(guān)機(jī),1、先退出標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量程序菜單 2、再退出 J715 驅(qū)動(dòng)程序 3、先關(guān)“Power2”(綠燈)， 再關(guān)“Power 1” (紅燈) 4、等 5 分鐘，關(guān)氮?dú)狻?四、圓二色儀分析要求,（一）蛋白質(zhì)分析的前提條件 （二）注意事項(xiàng),（一）蛋

20、白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的前提條件,1、蛋白質(zhì)分析鑒定的重要性 2、樣品的純度要求 3、樣品的濃度要求 4、參照液的參數(shù),1、蛋白質(zhì)分析鑒定的重要性 關(guān)于基因工程產(chǎn)品純度和生物活性的評(píng)價(jià)，對(duì)于臨床應(yīng)用極為重要。根據(jù)FDA（美國(guó)食品藥物管理局），USP（美國(guó)藥典質(zhì)量）和國(guó)際藥檢標(biāo)準(zhǔn)，基因工程產(chǎn)品的純度要求必須大于97（國(guó)內(nèi)目前規(guī)定95以上）。藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不可任意降低，任何不純和污染都會(huì)帶來健康上的問題。,2、 樣品的純度要求： HPLC層析，主峰面積 95 SDS-PAGE電泳后，銀染色一條帶， 掃描主峰 95 基因工程產(chǎn)品的比活性符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。,3、樣品濃度要求： 蛋白濃度：遠(yuǎn)紫外區(qū)：1530 ug/ml 近紫外區(qū)：150300ug/ml 用