生化檢測基礎(chǔ)

1、 生生生生化化化化檢檢檢檢測測測測常常常常識識識識 目錄目錄 第一章第一章 生化檢測基本常識生化檢測基本常識 1.1 標本的獲得 （2） 第二章第二章 常規(guī)生化檢測項目簡介常規(guī)生化檢測項目簡介 2.1 生化項目的臨床意義 （2） 第三章第三章 生化儀參數(shù)測量原理生化儀參數(shù)測量原理 3.1 自動生化儀的分類（3） 3.2 分立式生化儀結(jié)構(gòu)（5） 3.3 生化檢驗的原理和方法 （6） 3.4 生化分析儀測定方法的分類及應用度的計算 （9） 3.5.測定值計算方程 （10） 3.6 定標參數(shù)和濃度的計算（17） 第四章第四章 幾個重要概念幾個重要概念 51 試劑空白（21） 52 樣本空白（21）

2、53 水空白 （21） 54 樣本 （21） 55 質(zhì)控物質(zhì)（21） 56 底物控制（21） 第一章第一章生化檢測基本常識生化檢測基本常識 生化檢測是醫(yī)院檢驗科（或化驗室）常用的檢測手段，通常以人的血清為標本，通過測量血清 中各生化成份的含量，為臨床診斷提供依據(jù)。 1.1 標本的獲得 一般要求病人空腹時采靜脈血（全血） 。全血經(jīng)過離心機離心，分層為血清和血細胞，正常情況下， 上層顏色淺且透明（血清） ，下層顏色深且不透明（血細胞） 。有的血清較為特殊，或分層不明顯 （融血） ，或血清不透明（脂血，呈牛奶狀） 。 第二章第二章 常規(guī)生化檢測項目簡介常規(guī)生化檢測項目簡介 2.1 生化項目的臨床意義

3、生化項目的臨床意義 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alt）：）：又稱為谷丙轉(zhuǎn)氨酶（gpt）是衡量肝功能的重要指標，許多低端 醫(yī)療機構(gòu)在做體檢時僅測此一項生化項目。正常人一般在 40u/l 以內(nèi)。干粉試劑復溶后為單試 劑，液體試劑一般為雙試劑，應用動力學法可計算結(jié)果。 蛋白：蛋白：通常測白蛋白（alb）和總蛋白（tp） ，終點法。一般用單試劑，有的 tp 試劑為雙試劑， 可用兩點終點法測。蛋白質(zhì)是血清的主要成份，大部份由肝細胞合成。通過蛋白的測定可以協(xié) 助某些疾病的診斷。 血糖：血糖：血液中的葡萄糖簡稱血糖（glu） 。常用于糖尿病的診斷。正常人空腹血糖一般為 3.96.1mmol/l。市

4、場上單、雙試劑的商品化試劑盒都有，可用終點法（單試劑）或兩點終點法 測量（雙試劑） 。 門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ast）：又稱為谷草轉(zhuǎn)氨酶（got） ，主要用于心肌和肝膽疾病及骨骼肌 病的診斷。是肝功能測試的常用指標之一。正常人一般在 40u/l 以內(nèi)。同 alt 一樣，無論單、 雙試劑，用動力學法可計算結(jié)果。 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（alp）：主要用于肝膽疾病及骨骼病的診斷。是肝功能測試的常用指標之一。正 常人一般在 240u/l 以內(nèi)。用動力學法計算結(jié)果。 -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（ggt）：）：主要用于肝膽疾病診斷。是肝功能測試的常用指標之一。正常人一 般在 50u/

5、l 以內(nèi)。用動力學法計算結(jié)果。 膽紅素（膽紅素（bil）：）：膽紅素的測定，能準確反映黃疸的程度，判斷黃疸的類型。一般測量總膽紅素 （tbil）和直接膽紅素（dbil） 。 甘油三酯（甘油三酯（tg）：）：其含量測定是血脂分析的重要內(nèi)容之一。 總膽固醇（總膽固醇（chol）：）：是游離膽固醇和膽固醇酯的總稱，其測定對高脂蛋白血癥和冠心病的診 斷及發(fā)病機理的研究有一定意義。 高密度脂蛋白膽固醇（高密度脂蛋白膽固醇（hdl-c）：）：主要在肝臟中合成，是血清中顆粒數(shù)最多的脂蛋白。其含量 是冠心病診斷的重要依據(jù)之一。 肌酐（肌酐（crea）：）：是肌酸代謝的最終產(chǎn)物，由腎臟排出。是腎功能的重要指標之

6、一。 尿素（尿素（urea）：是蛋白質(zhì)分解代謝的終產(chǎn)物。血尿素測定是腎功能的最敏感指標。 載脂蛋白載脂蛋白 a1(apoa1): 是高密度脂蛋白的主要組成成分，臨床上主要用于腦血管病風險度的估 計。 載脂蛋白載脂蛋白 b(apob): 是低密度脂蛋白的主要組成成分，臨床上主要用于冠心病的風險度的估計。 肌酸激酶（肌酸激酶（ck）：）：肌酸激酶通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中， 是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、atp 再生有直接關(guān)系的重要激酶?？捎糜谠缙谠\斷急性 心肌梗，常見肌病(如進行性肌營養(yǎng)不良發(fā)作期、病毒性心肌炎、多發(fā)性肌炎、擠壓綜合征等嚴 重肌肉損傷)及腦血管疾

7、病的診斷。 -羥丁酸脫氫酶（羥丁酸脫氫酶（hbdh）：）：與肌酸激酶相同，用于診斷心肌梗死。 -淀粉酶（淀粉酶（amy）：）：在臨床應用方面，-淀粉酶活力升高與急性胰腺炎、胰腺管道阻塞、腹 內(nèi)疾病、流行性腮腺炎及細菌性腮腺炎。 鈣、氯、鐵、鉀、鈉、鎂、磷：鈣、氯、鐵、鉀、鈉、鎂、磷：這 7 項都屬于離子組合，用于診斷人體中離子的含量。 常用檢測項目表常用檢測項目表 序號項目名稱縮寫組合參考值 1.白蛋白alb3555g/l 2.總蛋白tp6080g/l 3.堿性磷酸酶alp15112u/l 4.門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ast（got）837u/l 5.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶alt（gpt）065u/l 6

8、. -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 ggt050u/l 7.直接膽紅素db06umol/l 8.總膽紅素tb 肝功能 018umol/l 9.肌酐crea53115mol/l 10.尿酸ua210430umol/l 11.尿素urea 腎功能 2.56.4mmol/l 12.膽固醇chol3.66.5mmol/l 13.甘油三酯tg0.451.81mmol/l 14.高密度脂蛋白hdl0.91.68mmol/l 15.低密度脂蛋白ldl2.73.1mmol/l 16.載脂蛋白 a1apoa11.01.6g/l 17.載脂蛋白 bapob0.61.1g/l 18.脂蛋白lp（a） 血脂 030mg/dl 19.

9、肌酸激酶ck21190u/l 20.肌酸激酶同工酶ck-mb025u/l 21. -羥丁酸脫氫酶 hbdh70180u/l 22.乳酸脫氫酶ldh 心肌酶類 114240u/l 23.鈣ca2.02.6mmol/l 24.氯cl95105mmol/l 25.鐵fe930mol/l 26.鉀k3.55.5mmol/l 27.鎂mg0.61.1mmol/l 28.鈉na135145mmol/l 29.磷p 離子 0.81.6mmol/l 30. -淀粉酶 amy100220u/l 31.葡萄糖glu 其它 3.95.8mmol/l 第三章 生化儀參數(shù)測量原理 3.1 自動生化儀的分類自動生化儀的分

10、類 3.1.1 連續(xù)流動式自動化分析儀 連續(xù)流動式自動化分析儀也叫管道式分析儀，其特點是測定項目相同的各待測樣本與試劑 混合后的化學反應，是在同一管道中經(jīng)流動過程完成的。這類儀器一般可分為空氣分段系統(tǒng)式和 非分段系統(tǒng)式。所謂空氣分段系統(tǒng)是指在吸入管道的每一個樣品、試劑以及混合后的反應液之間， 均由一小段空氣間隔開；而非分段系統(tǒng)是靠試劑空白或緩沖液來間隔每個樣品的反應液。在管道 式分析儀中，以空氣分段系統(tǒng)式最多，且較典型，整套儀器是由樣品盤、比例泵、混合管、透析 器、恒溫器、比色計和記錄器幾個部件所組成。管道內(nèi)的圓圈表示氣泡，氣泡可將樣品及試劑分 隔為許多液柱，并起一定的攪拌作用。但氣泡影響比色

11、，必須在比色前除去。 將幾個單通道管道式分析儀結(jié)合起來，對一個樣品同時測定幾個項目。著名的有 12 通道分 析儀，命名為順序多項自動分析儀（sequential multiple auto analyzer）簡稱 sma12/60。同時發(fā)展 為 smac，c 為計算機（computer）的縮寫。這類大型分析儀至今仍有使用者。它對每個樣品可同 時分析 12 個項目，每小時可分析 60 個樣品。后來發(fā)現(xiàn)不加入空氣泡，更有利于結(jié)果的檢測，發(fā) 展為流動注射分析法（flow injection analysis） 。試劑的流動仍用比例泵驅(qū)動，樣品用轉(zhuǎn)動閥加入 液流，反應后比色檢測。 3.1.2 離心式生

12、化分析儀 離心式分析儀是 1969 年以后發(fā)展起來的一種分析儀，由 anderson 設(shè)計，其特點是化學反應 器裝在離心機的轉(zhuǎn)子位置，該圓形反應器稱為轉(zhuǎn)頭，先將樣品和試劑分別置與轉(zhuǎn)頭內(nèi)，當離心機 開動后，圓盤內(nèi)的樣品和試劑受離心力的作用而相互混合發(fā)生反應，最后流入圓盤外圈的比色槽 內(nèi)，通過比色計進行檢測。 離 心式分 析儀主 要由兩 部分組 成，一為 加樣部 分，二為 分析部 分。加樣 部分包 括樣品 盤、試劑 盤、吸樣臂（或管） 、試劑臂（加液器）和電子控制部分（鍵盤和顯示器等） 。加樣時轉(zhuǎn)頭置于加 樣部分。加樣完畢后將轉(zhuǎn)頭移至離心機上。分析部分，除安裝轉(zhuǎn)頭的離心機外，還有溫控和光學 檢測系

13、統(tǒng)，并有微機信息處理和顯示系統(tǒng)。 13 分立式生化分析儀 所謂分立式，是指按手工操作的方式編排程序，并以有節(jié)奏的機械操作代替手工，各環(huán)節(jié)用 傳送帶連接起來，按順序依次操作。分立式分析儀與管道式分析儀在結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別為：前者 各個樣品和試劑在各自的試管中起反應，而后者是在同一管道中起反應；前者采用由采樣器和加 液器組成的稀釋器來取樣和加試劑，而不用比例泵；前者一般沒有透析器，如要除蛋白質(zhì)等干擾， 需另行處理。恒溫器必須能容納需保溫的試管和試管架，所以比管道式分析儀的體積要大。除此 以外，其它部件與管道式的基本相似。分立式分析儀的基本結(jié)構(gòu)如下圖所示。depout 公司還推 出一種袋式分析儀，即試

14、管變?yōu)樗芰洗磻诖鼉?nèi)進行，也以袋作比色杯。這種袋只能一次性 使用。 3.1.3 干片式分析儀 干片式分析儀是 80 年代問世的。首先 eastman kodak 公司以其精湛的化學工藝造出了測定 血清中血糖、尿素、蛋白質(zhì)、膽固醇等的干式試劑片。當加上定量的血清后，在干片的前面產(chǎn)生 顏色反應，用反射光度計檢測即可進行定量。這類方法完全革除了液體試劑，故稱干化學法。 boehringer mannheim 公司推出了用全血的干征試劑。即將血細胞排除于濾膜之外，而血漿與試 劑發(fā)生反應后顯色檢測。 3.1.4 模塊式自動化系列 7600 系列全自動生化分析儀是日立公司于 1998 年開發(fā)出來的系列

15、分析儀。它是由各種不同 功能的模塊組合而成，功能模塊包括有樣本投入部、電解質(zhì)測定的 ise 模塊、常規(guī)實驗項目測定 的 d 模塊、特殊實驗項目測定的 p 模塊、復查樣本緩沖部和樣本收納部。根據(jù) d 模塊和 p 模塊 數(shù)目組合成不同型號的分析儀。 模塊組合式實驗室自動化系統(tǒng)包括： 樣品前處理系統(tǒng)，樣品輸送系統(tǒng)和樣品后處理系統(tǒng)（生化分析，電解質(zhì)分析，血液分析等） 。 樣品前處理系統(tǒng)由能獨立工作，不同功能的各模塊以同一標準來連接，通過計算機控制運行。由 樣品投入部，離心分離部，開栓部，在線分注部，非在線分注部，貼條碼部，蓋栓部，樣品分注 收存部，標本接收部等模塊構(gòu)成前處理系統(tǒng)，每一模塊既是系統(tǒng)的一部

16、分，又是獨立的單元，可 根據(jù)不同需要選擇使用，具有靈活性和擴展性。 后處理系統(tǒng)有電解質(zhì)分析系統(tǒng)，生化分析系統(tǒng)以及血液分析系統(tǒng)等。 16 全實驗室自動化分析系統(tǒng) 從檢驗標本處理開始，即標本的識別、傳輸、處理（分離血清等） 、分注、分類（按項目分 類） 、檢測和收費的自動化流水作業(yè)，到分析后自動儲存標本，檢驗結(jié)果的自動分析、報告與傳 送，自動提示異常值或危險值，申請檢驗醫(yī)師隨時查詢檢驗結(jié)果的全過程實現(xiàn)自動化、網(wǎng)絡(luò)化。 3.2 分立式生化儀結(jié)構(gòu)分立式生化儀結(jié)構(gòu) 全自動生化分析儀一般由以下部分構(gòu)成：探針系統(tǒng)、攪拌和沖洗系統(tǒng)、恒溫系統(tǒng)、反應盤、 光路系統(tǒng)構(gòu)成。 21 探針系統(tǒng) 液面檢測技術(shù)：通過檢測阻抗

17、或電容、電流的變化，感知到空氣和液面，可保證探 針的感應裝置至液面時會自動停止下降，即可增加速度也可減少污染，防止堵塞。 22 攪拌和沖洗系統(tǒng) 攪拌系統(tǒng)是讓樣品和試劑混合后迅速分布均勻，保障測試正常進行。常用的攪拌方 法為沖入空氣、攪拌、振蕩等，但是都容易產(chǎn)生氣泡和外溢等問題。目前最好的方法是 螺旋式攪拌棒附著特富龍涂層，一方面減少氣泡，另一方面減少攜帶和污染。 清洗系統(tǒng)一般包括試劑針的內(nèi)外臂清洗、樣本針的內(nèi)外臂清洗、比色杯的清洗。 23 恒溫系統(tǒng) 全自動生化儀一般都設(shè)有 30 和 37 度兩種溫度。目前常見的有水浴、空氣浴，最新 的是恒溫液循環(huán)加溫方式。 水浴的優(yōu)點是溫度均勻、穩(wěn)定；缺點是升

18、溫緩慢，開機預熱時間長，因水質(zhì)化（微 生物、礦物質(zhì)沉積）影響測定，因此要定期換水和比色杯。 空氣浴的優(yōu)點是升溫迅速，無需保養(yǎng)；缺點是溫度易受外界環(huán)境影響。 恒溫液循環(huán)加溫集干式空氣浴和水浴的優(yōu)點，即有水浴溫度穩(wěn)定、均勻的優(yōu)點，又 有空氣浴升溫迅速、無需維護保養(yǎng)的優(yōu)點。 24 反應盤 現(xiàn)在大多數(shù)采用硬質(zhì)玻璃比色杯（石英杯） ，其透光性好，易清潔，不易磨損。 25 光路系統(tǒng) 光源：光源分為鹵素燈和高壓閃爍氙燈。相對而言鹵素燈壽命長，價格低，是大部分 生化儀的首先。 3.3 生化檢驗的原理和方法生化檢驗的原理和方法 臨床生化檢驗，主要在技術(shù)方面的應用方面上探討生化檢驗新技術(shù)以及新的標記物的選擇 和評

19、價，用于幫助診斷，又稱“診斷生化” 。主要應用于下列技術(shù)：光譜技術(shù)、電化學分析技 術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)、抗原抗體特異性反應和標記技術(shù)、核酸擴增、雜交及序 列分析技術(shù)等，其中生化分析儀主要運用了光譜技術(shù)中的吸收光譜法和比濁法。分別介紹如下： 31 吸收光譜法 311 光譜范圍和電子躍遷 波長從 200nm400nm 的電磁輻射，稱為紫外光，波長從 400nm760nm 的電磁輻射，稱 為可見光。 312 吸收曲線 以波長（）為橫坐標，以吸光度為縱坐標而繪制出的一條曲線稱為吸收曲線。 在一段波長范圍內(nèi)，有最大吸收波長 max和最小吸收波長 min在最大吸收波長處測定可獲 得最大的測定靈

20、敏度。 313 吸光度的定義 一束強度為 io的平行單色光通過一 個含有濃度為 c 的吸光物質(zhì)、厚度為 l 的吸收池時，如 上圖，一些光子被吸收，光強從 io衰減為 it，則該溶液的吸光度 a 等于： 314lamber-beer 定律 a=cl 其中 為吸光系數(shù)，有兩種表示方法摩爾吸光系數(shù)和比吸光系數(shù)，摩爾吸光系數(shù)的意義為 1 摩 爾濃度的溶液在厚度為 1cm 時的吸光度，比吸光系數(shù)的意義為濃度為 1%（w/u）的溶液在厚度為 1cm 時的吸光度；c 為溶液的濃度；l 為吸收池的厚度（單位為 cm，亦稱光徑） 。 lamber-beer 定律的意義為：某溶液的吸光度等于該物質(zhì)的吸光系數(shù) 、濃

21、度 c 和光徑 l（cm） 的乘積，當光徑不變時，濃度和吸光度成正比，這是生化分析儀利用吸收光譜法進行定量測定的基 礎(chǔ)，見下圖： lamber-beer 定律成立的前提條 件是：（1）被吸收光為單色平行光， （2）待測 定溶液為稀溶液。 除特種蛋白外的大部分臨床生化項目，配以相應的試劑，均可利用吸收光譜法在生化分析儀上 進行測定。如： 酶類：包括 alt、ast、alp、acp、r-gt、a-hbdh、ldh、ck、ck-mb、a-amy、等。 底物/代謝產(chǎn)物類：包括 tg、tc、hdl-c、ldl-c、ua、urea、cr、glu、tp、alb、t- bil、d-bil、nh4+、co2 等

22、。 無機離子類：包括 ca、p、mg、cl 等。 32 比濁法 321 比濁法分兩類：透射比濁法和散射比濁法。 帶有小粒的懸浮液和膠體溶液都具有向四面八方散射入射光的性質(zhì)，當一束平行光通過含有懸 浮質(zhì)點的懸浮液或膠體溶液時，同時受到散射和吸收兩個因素的影響，使光的強度減弱。在光源的 光路方向上測量透射光（實際上還包括散射光）強度與入射光強度比值，并通過該比值測定出懸浮 液或膠體溶液中質(zhì)點的溶度，稱為投射比濁法；在光路的其他方向上測量散射光強度，從而測定出 懸浮液或膠體溶液中質(zhì)點的濃度，稱為散射比濁法。 322 測定原理 透射比濁法 一束強度為 i0的平行單色光通過一個含有懸浮質(zhì)點（顆粒大小與光

23、源波長接近）的懸浮液或膠 體溶液時，如上圖，其透射光強度 i 可用下式表示： i=ioe- l 式中,l 為懸浮液或膠體溶液在光前進方向上的長度， 為濁度系數(shù)，與懸浮質(zhì)點的濃度 c 成線 性關(guān)系。令 =2.3kc，則： 該式與 lamber-beer定律相似，這是生化分析儀利用投射比濁法進行定量測定的基礎(chǔ)，該法可以 與吸收光譜法共用一個檢測器，所以生化分析儀，不需增加任何部件，均可利用此法進行測定。大 部分特種蛋白，如載脂蛋白類（apoai,apob 等） 、補體類（c3，c4 等）免疫球蛋白類（igg,igm 等） 等，配以相應的試劑，可利用此法在生化分析儀上進行測定。 散射比濁法 一束強度

24、為 io平行單色光通過一個含有懸浮質(zhì)點（顆粒大小遠小于光源波長）的懸浮液或膠體溶液 時，如上圖，與入射光垂直方向上，其散射光強度 i 可用下式表示： 式中，n1,n2 分別表示質(zhì)點與介質(zhì)的折射率，v 表示單位 體積內(nèi)的質(zhì)點數(shù)，r 表示質(zhì)點半徑?？梢娚⑸涔鈴姸扰c懸浮質(zhì)點的濃度成正比，這是利用散射比濁法 進行定量測定的基礎(chǔ)，因另需在光路垂直方向上增加一檢測器，目前只有極少數(shù)生化分析儀可利用 散射比濁法進行定量測定，而幾乎所有的特種蛋白分析儀、免疫分析儀等都能利用散射比濁法進行 定量測定。 323 方法學分析 （1）散射比濁法與透射比濁法： 散射比濁法靈敏度高，線性范圍寬，但干擾因素多。 （2）比濁

25、法與吸收光譜法： 比濁法特異性差，靈敏度低。 3.43.4 生化分析儀測定方法的分類及應用度的計算生化分析儀測定方法的分類及應用度的計算 4.4.1 終點法 4.4.1 概述 指經(jīng)過一段時間（一般為 10 分鐘左右）的反應，整個反應達到平衡，由于反應的平衡常數(shù)很大， 可認為所有的被測定物已轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，反應液的吸光度不在增加（或降低） ，吸光度的增加（或降低） 程度與被測定物的濃度成正比。如下圖： 顆粒大小與光源波長接近 顆粒大小遠小于光源波長 如圖所示：t1 時刻加入試劑（體積為 v） ， t2 時刻加入樣本（體積為 s） ，然后攪拌并反應，之后測量反應液的吸光度，在 t3 時刻反應達到終 點

26、。t2 t3 為測定時間。 442 反應度 r（response）的計算 結(jié)果的計算包括三個部分：反應度 r（response）的計算、定標參數(shù)的計算和濃度（或活性）的 計算。這里僅介紹 r 的計算，定標參數(shù)的計算和濃度（或活性）的計算在后面專門討論。 1）單試劑單波長終點法 反應度 r=t3 時刻吸光度- t2 前一時刻吸 光度 （體積校正因子) 或 r=t3 時刻吸光度-單試劑空白吸光度。 2）雙試劑單波長終點法 t1 時刻加入第一試劑（體積為 v1） ，t2 時刻加入樣本（體積為 s） ，之后攪拌，t3 時刻加入第二 試劑（體積為 v2）并立即攪拌，t4 時刻反應打到終點。t3-t2 為

27、孵育時間，t4-t3 為測定時間。 反應度 r= t4 時刻吸光度-雙試劑空白吸光度 4.4.2 一級動力學 4.4.2 概述 一級動力學是指在被測物參與反應的條件下，在一定的反應時間內(nèi)，反應速度與反應物濃度的 一次方成正比，由于反應物在不斷的消耗，因此整個反應速度在不斷的減小，表現(xiàn)為吸光度的增加 （或降低）速度越來越小，由于這類反應達到平衡的時間很長，且平衡常數(shù)不算很大，必需在特定 時間段內(nèi)進行監(jiān)測，該段時間內(nèi)吸光度的增加（或）降低與被測定物的濃度成正比，見下圖。一級 動力學法又被稱為初速率法、固定時間法、二點動力學等。 如圖所示：t1 時刻加入試劑（體積為 v） ，之后測量試劑空白的吸光度

28、，t2 時刻加入樣本（體積 為 s） ，t3 時刻反應穩(wěn)定，t4 時刻停止對反應進行監(jiān)測；t2-t3 為延遲時間，t3-t4 為測定時間。 4.2.2 反應度 r 的計算（單、雙試劑相同） 反應度 r=t4 時刻吸光度t3 時刻吸光度 4.4.3 零級動力學法 4.4.31 概述 指反應速度與被測定物濃度的零次方成正比，也就是與被測定物濃度無關(guān)，因此，在整個反應 過程中，反應物可以勻速地生成某個產(chǎn)物，導致被測定溶液在某一波長下吸光度均勻地減小或增加， 減小或增加的速度（a/min）與被測物的活性或濃度成正比。零級動力學法即通常所說的動力學法， 也被稱為連續(xù)監(jiān)測法，主要用于酶活性的測定。 實際上

29、，由于底物濃度不可能足夠大，隨著反應的進行，底物消耗到一定的程度后，反應速度 不再與酶活性成正比，因此，零級動力學法是針對于特定時間段而言的，各試劑商對這段時間有嚴 格規(guī)定，見下圖中的 t3-tn: t1 時刻加入試劑（體積為 v） ，t2 時刻加如樣本（體 積為 s） ，t3 時刻反應穩(wěn)定，tn 時刻停止對反應進行監(jiān)測；t3 到 tn 之間的時間內(nèi)，吸光度勻速變化， 變化的速率和反應物的濃度成線性關(guān)系。t3-t2 為延遲時間 ，tn-t3 為測定時間。 432 反應度 r 的計算（單、雙試劑相同） 其中 n=t3 到 tn 間的數(shù)據(jù)個數(shù) ti=時間 ai=某一時間的吸光度 3.5.3.5.測

30、定值計算方程測定值計算方程 以下為各種方法學的測定值計算方程及監(jiān)察參數(shù)定以下為各種方法學的測定值計算方程及監(jiān)察參數(shù)定 三種基本方法的應用如下: - 終點法 - 兩點法 - 動力法 3.5.13.5.1 終點法終點法- -單試劑單試劑, , 單波長及樣本空白扣除單波長及樣本空白扣除 測定值 x 單位因子 截距 最後報告結(jié)果最後報告結(jié)果 = _ 斜率 每個終點, 儀器均測取三個讀數(shù)t0, t1 - 18及 t1. 測定值 = 因子 x abs (t1) - *rb1r 標準濃度 因子 = _ abs (t1) - *rb1r(試劑空白值) * rbl 試劑空白值, 可在定標數(shù)據(jù)程序內(nèi)查看 延時時間

31、 時間 t0 吸光度 (abs) 加入樣本 rblr abs (t1) t1-18” 3.5.23.5.2 反應控制反應控制 是用來監(jiān)察在終點法中反應是否己到終點. abs (t1) - abs ( 1) 反應控制反應控制 abs = abs (t1) - abs ( 1) = 0.3336 - 0.3319 = 0.0017 反應控制反應控制 終點法時：指反應終點的吸光度與前一點的吸光度差值要小于儀器給出的反應控制反應控制，否則反應到 達終點時會報警終點不穩(wěn)定。 固定時間法：判斷參與計算的兩點線性，例如： 時間 1 t1 吸光度 (abs) 加入樣本 兩測的吸光 度差值. abs 3.5.3

32、3.5.3 試劑試劑白白波動波動 試劑試劑白白波動波動是試劑本身在測讀時間內(nèi)的吸光度變化值. 3.5.43.5.4 兩點法（兩點法（i.r.)i.r.) 單試劑單試劑 測定值 x 單位因子 截距 最后報告結(jié)果最后報告結(jié)果 = _ 斜率 時間 吸光度 (abs) rgt 波動 rbl t0t1 時間 t0 吸光度 ( abs) abs (t1) 樣本或 標準 t1 abs (t0) 試劑空白 abs (t1) 試劑空白 abs (t0) 樣本或 標準 測定值測定值= 因子 x abs 樣本-rgt 波動 abs 樣本= abs 樣本 (t1) - abs 樣本(t0) rgt 波動 = abs

33、試劑空白= abs 試劑(t1) - abs 試劑(t0) 標準濃度 因子 = _ abs 標準 rgt 波動 3.5.53.5.5 兩點法（兩點法（i.ri.r）試劑）試劑 測定值測定值= 因子 x abs 樣本-rgt 波動 標準濃度 時間 吸光度 ( abs) t3 r1 t1 延遲時間 h20/std/ 樣本 t2 讀數(shù)時間加入 r2 延遲時間 rgt 漂移 abs 樣本/標本 abs (t2) abs (t3) r2 因子 = _ abs 標準 rgt 波動 起時極限起時極限 afp = abs (t0) - abs (t0 - 18) asp = abs (t1) - abs (t

34、1 - 18) 若比值不符合以下條件: afp 線性因子 x asp 起始極限 測結(jié)果會有報警反應不符合線性. 線性因子線性因子 afp 比值 _ =線性因數(shù) 時間 吸光度 ( abs) t0-18 t0 t1-18 t1 afp asp asp 3.5.63.5.6 底物消耗值底物消耗值 正反應 負反應 3.5.73.5.7 動力學因數(shù)的計算：動力學因數(shù)的計算： vt x 1000 時間 吸光度 ( abs) t0 t1 底物消耗極限 abs (t0) abs (t1) 沒有報警 報警底物耗盡 時間 吸光度 ( abs) t0 t1 底物消耗極限 abs (t0) abs (t1) 沒有警號

35、 報警底物耗 盡 因數(shù) = _ vs x o.t. x x t vt =反應總量 (樣本量 + 試劑量) vs= 樣本量 o.t.= 光徑的長度(cm). = 消光系數(shù) 1000= 單位轉(zhuǎn)換-由 ml 轉(zhuǎn)換為 ul 測定測定值值 = 因數(shù) x abs/ 分. = 因數(shù). x abs(t0) - abs(t1) x 60 /(t0)- (t1) 3.63.6 定標參數(shù)和濃度的計算定標參數(shù)和濃度的計算 3.6.1 定標參數(shù)的計算 定標方法分為兩大類，即線性定標和非線性定標，其中線性定標又包括單點線性定標 （又稱因數(shù)法） 、兩點線性定標（又稱線性法）和多點（大于 3 點）線性定標（又稱線性回 歸法）

36、 ，主要適用于比色法測定的項目；非線性定標主要適用于比濁法測定的項目，下面分 別予于介紹。 3.6.23.6.2 幾點說明幾點說明 （1）三種測定方法（終點法、固定時間法和動力學法）可以和上述的定標方法任意 對應。 （2）后面的定標公式中： r 表示反應度（詳見上文“r 的計算” ） c 表示標準液的濃度（或活性） 。 k、ro、a、b、c、d 表示定標參數(shù)。 標準液標準液 亦稱基準溶液，是濃度已經(jīng)準確測知的溶液。 3.6.33.6.3 線性定標線性定標 （1）單點線性定標 定標公式：r=kc，只有 1 個定標參數(shù)k， 定標曲線如下圖： 只需提供 1 個標準品。大多數(shù)酶學項目可以不定標而直接輸

37、入因數(shù)（輸入值 f=1/k） （2）兩點線性定標 定標公式：r=dc+b，有 2 個定標參數(shù)，k 和 b 其中 要求提供兩個標準品，c1、c2 為標準品 1 和 2 的濃度，r1、r2 為標準品 1 和 2 的反 應度。定標曲線如下圖： （3）多點線性定標 定標公式：r=kc+b,有兩個定標參數(shù)，k 和 b，其中： 要求提供 n（n3）個標準品，ci 為標準品 i 的濃度，ri 為標準品 i 的反應度。 313 非線性定標 （1）logistic-log4p 定標公式：有 4 個 參數(shù)，即 r0、k、a 和 b。 要求提供至少 4 個標準品，其中第一個標準品的濃度（活性）為零，其對應的 r 就

38、等 于 r0，用最速下降法+擬牛頓法求解。適用于隨著濃度增加，其反應度增加越來越小的定 標曲線，如圖： （2）logistic-log5p 定標公式：有 5 個定標參數(shù)即 r0、k、a 、 b 和 c。要求提供至少 5 個標準品，其中第 1 個標準品的濃度（活性）為零，其對應的 r 就 等于 r0,用最速下降法+擬牛頓法求解，使用范圍同 logistic-log4p，只是曲線擬和程度更 高。 （3）exponential5p 定標公式：r=r0+kexpalnc+b(lnc)2+c(lnc)3,有 5 個參數(shù) r0、k、a 、b 和 c 要求提 供至少 5 個標準品，其中第 1 個標準品的濃度（活性）為零，其對應的 r 就等于 r0,用最 速下降法+擬牛頓法求解。適用于濃度增加到一定程度后，其反應度增加越來越大的定標曲 線，如圖： （4）polynomial5p 定標公式：有 5 個參數(shù) r0、k、 a 、b 和 c 要求提供至少 5 個標準品，其中第 1 個標準品的濃度（活性）為零，其對應的 r 就等于 r0,用最速下降法+擬牛頓法求解。 （5）parabola 定標公式：r=ac2+bc+c,有 3 個參數(shù)，即 a、b 和 c。要求提供至少 3 個標準品，解 3 元線性方程組，用全選主元高斯消去法求解。 （6）