粉防己堿干預大鼠急性缺血再灌注腎損傷中的細胞凋亡變化.

1、粉防己堿干預大鼠急性缺血再灌注 腎 損傷中的細胞凋亡變化由于急性缺血 - 再灌注腎損傷時組織細胞凋亡明顯增多，國外一些學者 已經(jīng)開始使用某些藥物抑制細胞凋亡水平以減輕組織損傷 Am J Physiol,1996,271:F477 。中藥粉防己堿是一種傳統(tǒng)利水滲濕藥，對急性缺血 性再灌注腎損傷有保護性作用南京醫(yī)科大學學報，1998，18：5，然而有關該藥在急性缺血再灌注腎損傷中的作用以及與細胞凋亡關系的研究至今尚未見 報道。為此，我們制備了急性缺血再灌注腎損傷的模型，采用腎組織光鏡檢 查、DNA片段分析及原位末端轉移酶標記（TUNEL等技術，以探討粉防己堿干預 急性缺血 - 再灌注腎損傷過程中細

2、胞凋亡的變化。一、材料與方法1. 動物分組與處理：雄性SD大鼠，隨機分為用藥與對照組，鉗夾大鼠雙側 腎蒂 45分鐘制備腎缺血動物模型，按不同再灌注時間 （12、 24、 48和 72小時） 再分為四組。分別于模型制備術前 30 分鐘及制備后 4、 22、 46、 70 小時灌胃藥 液粉防己堿（以pH 7.4磷酸鹽緩沖液新鮮配制，濃度 20 mg/ml），對照組以磷 酸鹽緩沖液 0.3 ml/100g 替代。分別于各時間段宰殺大鼠留取腎臟標本。一部分4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用做 TUNEL標記及HE染色。另一部分用于腎 組織DNA片斷分析。2. 方法：采用TUNEL法定量分析腎組織細胞凋亡，

3、按 BoehringerMannheim公司In Situ Cell Detection Kit,AP,試劑盒方法進行，并在計算機像分析系統(tǒng)的高倍視野（X 400）下，每片隨機取10個視野，計數(shù)所有陽性顯色 的細胞核。同時設立陽性對照（標記前DNA酶處理）、陰性對照組（標記液中只含 dNTP標記緩沖液而不加TdT酶溶液）。腎細胞DNA片段分析則采用瓊脂糖凝膠 電泳法。組織學變化觀察：取HE切片在計算機像分析系統(tǒng)的高倍視野（X 400） 下，隨機觀察病變最明顯的皮髓交界處 100個腎小管的組織形態(tài)，并計數(shù)其中 損傷腎小管數(shù)。二、結果1. 腎組織DNA片段分析：缺血再灌注后腎組織 DNA的電泳呈現(xiàn)

4、180 bp及其 倍體的梯形條帶。2. 組織學的觀察結果：病變腎組織可見腎小管上皮細胞核固縮、核碎裂、 核貼膜、核消失；細胞漿濃縮、染色嗜酸性增強；細胞分解為數(shù)塊；部分腎小 管輪廓結構消失，有些管腔內蛋白管型形成等，但無炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。各組 大鼠腎小管的損傷程度見表 1。表 1 用藥組與對照組皮髓交界損傷腎小管數(shù)的比較 （s）再灌注時間用藥組對照組P值12小時37.67 11.02(6)59.33 2.94(6)v 0.00524小時33.33 6.62(6)49.83 9.37(6)v 0.0148小時15.17 3.49(6)27.67 2.88(6)v 0.00172小時4.67 1.

5、15(3)11.67 2.89(3)v 0.05注：括號內為大鼠數(shù)3.TUNEL實驗結果：見表 2表2用藥組、對照組、正常組大鼠腎小管細胞凋亡水平 (個/視野)的比較( s)再灌注時 間正常組對照組用藥組3.67 0.72(3)12小時24.45 2.81(6) *16.88 0.56(6) 24小時20.45 1.38(6) *14.32 1.78(6) 48小時13.80 1.37(6) *9.12 1.03(6) 72小時9.50 0.79(3) *5.67 0.68(3) 括號內為每組大鼠數(shù)；與正常組比，* P v0.001 ;與對照組比， P v0.005 , P v 0.001三、

6、討論近年來，細胞凋亡在急性缺血-再灌注腎損傷病理生理中的作用已經(jīng)引起了腎臟病學術界的極大關注。中藥粉防己堿對急性缺血再灌注腎損傷 的保護性作用，能夠明顯降低血清肌酐和尿素氮水平，改善腎小球濾過率與腎 血漿流量。我們采用鉗夾大鼠雙側腎蒂45分鐘，制備了缺血再灌注腎損傷模型，從腎組織HE染色切片中觀察到，急性缺血再灌注腎損傷時腎小管損傷以皮 髓交界處最為明顯；粉防己堿用藥組腎小管損傷程度明顯低于對照組，從形態(tài) 學角度證實了中藥粉防己堿對于急性缺血再灌注腎損傷的保護性作用。同時， 腎組織HE染色切片中觀察到的受損腎小管上皮細胞形態(tài)學變化與Gobe G等New con cept and therape

7、utic strategies.New York:ChurchillLivi ngsto ne Press,1995:143描述的細胞凋亡的形態(tài)學特征相一致，因而提示，細胞凋亡是缺血再灌注腎損傷時細胞死亡的形式。進一步采用TUNE法定量分析腎小管的細胞凋亡水平，結果表明正常大鼠腎組織細胞凋亡水平很低， 缺血再灌注1272小時各時相凋亡細胞均顯著增多(P均v 0.001)，而用藥組 腎小管上皮細胞凋亡水平卻明顯低于對照組 (P均v 0.005)，因而提示粉防己堿 在急性缺血性腎損傷過程中可通過降低腎小管上皮細胞凋亡，達到減輕腎組織 細胞損傷、促進腎組織修復的作用。腎組織 DNA片段分析則發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腎 組織并不出現(xiàn)DNA弟形，而缺血再灌注后腎組織出現(xiàn)了特征性的 DNA弟形格 局。有關粉防已堿減少腎