不同氮素形態(tài)對(duì)專用小麥苗期氨同化關(guān)鍵酶活性的影響.

1、麥類作物學(xué)報(bào) 2008, 28(5 :836-840Journal o f T riticeae Crops不同氮素形態(tài)對(duì)專用小麥苗期氨同化關(guān)鍵酶活性的影響 王小純 1, 程振云 1, 何 建國(guó) 2, 熊淑萍 2, 馬新明 2(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院 , 河南鄭州 450002； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 , 河南 鄭州 450002摘要 :為了給專用小麥氮素利用效率的提高提供依據(jù) , 采用砂基水培方法 , 研 究了強(qiáng)筋小 麥豫麥 34、 鄭 麥 9023、 鄭農(nóng) 16, 中筋小麥豫麥 49 和弱 筋小麥 豫麥50一葉一 心期葉 片的 氨同化 關(guān)鍵 酶 (谷氨 酰胺合 成酶 ,GS； 谷

2、氨酸合成酶 , GO GA T 活性和不同氮素形態(tài) (NH 2-N 、 N H 4+-N 和NO -3-N 對(duì)四 葉一心期氨同化關(guān)鍵酶活性 的影響 。 結(jié)果表明 , 一葉一心期 , 不同類型專用小麥 GS 總活性表現(xiàn)為 :弱筋 型 中筋型 強(qiáng)筋型 。 胞質(zhì)型GS(GS1活性高于質(zhì)體型G S(GS2。不同品種 間G S1活性差 異小,GS2活 性 差異極 顯著 , 且強(qiáng) 筋型 中筋型 弱筋型 。 GOG A T 活性表現(xiàn)為弱筋型和中筋型略高 于強(qiáng)筋型 。四葉心期 , 強(qiáng)筋型品種 和弱筋型 品種GS活性以硝態(tài)氮處理最高,中筋型品種以尿素處理最高。同時(shí),GS1活性均 呈下降趨勢(shì) , 不受品種和氮素形

3、態(tài)的影響；GS2受品種和氮素形態(tài)影響較大。NH 4+-N下,中筋型和弱筋型小麥GS2活性均提高,強(qiáng)筋小麥均下降；NH 2-N下,中筋小麥豫麥49的GS2活性持續(xù)提升,豫麥34的GS2活性保持平衡 , 其他品種均降低 ; NO -3-N下，強(qiáng)筋型和中筋型品種的GS2活性均下降，弱筋小麥增加。說明弱筋小麥GS2活性對(duì)氮的敏感性最強(qiáng),其次是中筋型小麥，強(qiáng)筋小麥GS2受氮素的激活效應(yīng)最弱。關(guān)鍵詞 :小麥 ； 氮素形態(tài) ； 谷氨酰胺合成酶 (GS ； 谷氨酸合成酶 (GO GA T中圖分類號(hào)：S512. 1; S311文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào)：1009-1041(2008 05-0836-05Effect

4、s of Nitrogen Forms on the A ctivities of Key Enzymes for N H 4+A ssimilation at Seedling Stag e of Different Wheat Cultivars with Specia-l End U seWANG Xiao -chun 1, CHENG Zhen -yun 1, HE Jian -guo 2, XIONG Shu -ping 2,MA Xin -ming 2(1. College of Life Science, H en an Agricu ltural U nivers ity, Z

5、hen gzhou, Henan 45002, China; 2. Colleg e of Agronomy,Henan Agricultural University, Zhengzh ou, H enan 45002, Ch inaAbstract：With nutrient solution culture metho d, the activities of key enzymes for amm onia assimila -tion (g lutamine synthetase and Glu synthetase in w heat leaves at o ne and a ha

6、lf leaves stag e w ere car -r ied out w ith stro ng -g luten w heat cultivars ofYumai 34, Zheng mai 9023and Zhengnong 16, and me -dium -gluten w heat cultiv ar ofYumai 49, and w eak -g luten w heat cultivar of Yum ai 50; the effects of nitrog en form s, NO 3-, NH 4+and urea on the enzy me activities

7、 w ere studied in the four th leaf full ex -pended stag e. T he result show ed that at one and a half leaves stag e, the to tal GS activ ities show ed as： w eak -g luten w heat cultivarmedium-gluten w heat cultivarstrong -g luten w heat cultivars. T he ac -tivities o f GS1w ere higher than that of G

8、S2, and the differences of the activities of GS1among differ -ent cultivars w er e very little w hereas that of GS2w er e very larg e as strong -gluten w heat cultiv ars medium -g luten w heat cultivar w eak -gluten w heat cultiv ar. T he activities of GOGAT of w eak and middle g luten w heat cultiv

9、ars w er e slig htly higher than that o f stro ng -g luten w heat cultiv ar s. At the fo urth leaf full expended stag e, as to strong and w eak gluten w heat cultivars, the GS activities of NO 3-treatments w ere the hig hest; as to m edium -gluten w heat cultiv ar , the GS activities of urea tr eatm

10、ent w ere the highest. A t the same time, theGS1activ ities decrease in all treatment. Cultivars* 收稿日期 :2008-03-13修回日期 :2008-07-02基金項(xiàng)目 :教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目 (20040466003 ; 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771266 。作者簡(jiǎn)介 :王小純 (1966- , 教授 , 博士 , 主要從事植物分子生物學(xué)研究。 E - mail:xiaochun. w 163. comand N for ms had no effect on GS1but mo re e

11、ffect on GS2. NH 4+co uld increased the GS2activity o f medium and w eak g luten w heat cultivars w hile decreased that of strong -gluten w heat cultivars; urea could increased the GS2activ ity of m edium -g luten w heat cultivars, maintained that of Yumai34in constant level, w hile decr eased that

12、o f w eak -g luten w heat cultivar and other strong -gluten w heat cu-l tivars; N O 3-increased the GS2activ ity of w eak -gluten w heat cultivar w hile decreased that o f stro ng and medium-g luten w heat cultiv ar s. The results show ed that w eak -g luten w heat cultivar w as m ore sensitiv e to

13、N for m w hile str ong -g luten w heat cultivars w er e m ore insensitive to N for m, and medium -gluten w heat cultiv ar w as in the m edium.Key words:Wheat cultiv ar s for special end use; N forms; GS; GOGAT氮素是作物產(chǎn)量 和品質(zhì)形成的 重要影響因 子。植物對(duì)氮素的吸收利用不僅取決于植物自身 的特點(diǎn) , 還取決于生長(zhǎng)環(huán)境提供的各種氮源。高 等植 物 可以 直接 同 化利 用 的無 機(jī) 氮

14、是 氨 態(tài)氮 (NH 4+ , 氨態(tài)氮主要來源于硝態(tài)氮、 尿素和生物 固氮 15。高等植物體內(nèi) 95%以上的 NH 4+通過 谷氨酰胺合成酶 (GS /谷氨酸合 成酶 (GOGA T 循環(huán)進(jìn)行同化 6, 7, 其中 , GS 是該循環(huán)的關(guān)鍵酶 , 是無機(jī)氮 (氨態(tài) 氮 轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮 (氨基酸 的樞 紐。植物體內(nèi)有兩種 GS 同工酶 , 一種定位于葉 片 的 細(xì) 胞質(zhì) 和非 光 合 組 織 , 稱 為 胞質(zhì) 型 GS (GS1 ; 另一種定位于光合組織和根 的質(zhì)體中，稱質(zhì)體型GS(GS2。 GS1主要參與種子萌發(fā)時(shí)儲(chǔ) 存氮源的轉(zhuǎn)運(yùn)及葉片 衰老時(shí)氮源的再利用。GS2主要參與光呼吸產(chǎn)生的氨、硝酸還原

15、產(chǎn)生的氨(初級(jí) 氮 同化過程 5。對(duì)豆類、 煙草及玉米等的研究 表明 , GS 兩種同工 酶表達(dá) 受植 物 種類、 器 官組 織 9、 生育時(shí)期 10, 11、 光照條件及氮源 1217等的 影響 , 因此 , GS 成 為國(guó) 內(nèi)外調(diào) 節(jié)作物 無機(jī) 氮同 化、 提高氮素利用率研究的焦點(diǎn)。小 麥?zhǔn)侵袊?guó)重 要的糧食作物之一 , 小麥專用及其品質(zhì)問題日益 受到重視 , 但是不同專 用小麥 GS 同工酶表達(dá)特 點(diǎn)未曾見研究報(bào)道 ; 氮肥是調(diào)節(jié)小麥產(chǎn)量和品質(zhì) 的重要 栽培措施之一 , 但不同氮素形態(tài)如何影響 GS 的表達(dá)及氨的同化也未曾見報(bào)道。所 以本試 驗(yàn)以強(qiáng)筋、 中筋和弱筋型專用小麥品種為材料 ,

16、研 究不同基因型及不同氮 素形態(tài)對(duì)小麥苗期葉片氨 同化關(guān)鍵酶 (GS 、 GS 同工酶及 GOGAT 的影響 , 旨在為 專用小麥的早期鑒定提供分子指標(biāo) , 為提 高專用小麥氮肥利用效率提供理論依據(jù)。1材料與方法1. 1試驗(yàn)處理與設(shè)計(jì) 行 , 石英砂用蒸餾水洗凈后 , 于 150e 下滅菌 2小時(shí) , 而后 把等量的石英砂裝于底部有小洞的塑料 桶中 (高 15cm , 內(nèi)徑 18cm , 再把小桶置于 深 5 cm 的塑料托盤上 , 加水培養(yǎng)。試驗(yàn)二 :小麥生長(zhǎng)至一葉一心后取樣 , 把余下 的植株繼續(xù)用 H o ag land 改進(jìn)型 培養(yǎng)液培 養(yǎng) , 每 次向桶內(nèi)加等 量培養(yǎng)液 (氮 素濃度

17、為 15mmo l/ L, pH 為 6. 56. 8 。設(shè)酰胺態(tài)氮 (NH 2-N 、 銨 態(tài)氮 (NH 4+-N 和硝態(tài)氮 (NO 3-N 3 種氮素形 態(tài)處 理 , 其中 , NH 2-N 和 NH 4+-N 處理中加入施 氮量 10%的硝化抑制劑 ( 雙氰胺 13 。試驗(yàn)供試 品種均為強(qiáng)筋小麥豫麥 34、 鄭麥 9023、 鄭農(nóng) 16, 中筋小麥豫麥 49 和弱筋小麥豫麥 50, 對(duì)飽滿種 子進(jìn)行催芽 , 選露白一致的進(jìn)行穴播 , 在自然光照 條件下培養(yǎng) , 每處理重復(fù) 3次 , 每 3d 換一次營(yíng)養(yǎng) 液 , 換液前先用蒸餾水沖洗砂中營(yíng)養(yǎng) 液殘留。 1. 2 樣品采集和處理試驗(yàn)一于一葉

18、一心期取第一片完全展開葉 ; 試驗(yàn)二于第 4片葉完全展開期取第四片葉 , 取樣 后快速稱量 1. 000g 并迅 速放入 -70e 冰箱保 存。1. 3測(cè)定項(xiàng)目與方法1. 3. 1粗酶液制備 將冷凍樣品置于預(yù)冷的研 缽中 , 加入少許無菌石英砂 , 加入2. 5m L 的 100 mmo l/L T ris -H Cl 緩沖液 (pH 7. 6, 含 l mmo l/L Mg Cl 2、 l mmo l/L EDT A 和 10mm ol/L B -巰基乙 醇冰浴研磨成糊狀 , 勻漿液于 13000r/m in 離心20min, 上清液即為粗酶液。1.3. 2GS活性的測(cè)定 按TANG等17的

19、方法 測(cè)定粗酶提取液GS活性。一個(gè)GS活性單位定 義為每分鐘于37e催化1L mo1的C谷氨酰異 羥肟酸的產(chǎn)生所需要 的酶量?？?GS 活性計(jì)算以 15min 內(nèi)生成的產(chǎn)物 C -谷氨酰基 氧肟酸在 540 # 837 #第 5 期 王小純等 : 不同氮素形 態(tài)對(duì)專用小麥苗期氨同化關(guān)鍵酶活性的影響1. 3. 3 GS 同工酶的測(cè)定 采用非變性聚丙烯 酰胺凝膠電泳 (Native -PAGE 結(jié)合 三氯化鐵活性 染色顯示 GS 同工酶 15。照相后 , 利用捷達(dá)凝膠 電泳分析軟件依據(jù)積分光密度分析同工酶的相對(duì) 活 性 , 利用 DPS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。 1. 3. 4 GOGAT 活性的

20、測(cè)定 按林清華等16的 方法測(cè)定粗酶 提取液 GOGAT 活性。加入酶液 后立即加入 L - 谷氨酰胺啟 動(dòng)反應(yīng)。以30e下每分鐘反應(yīng)液減少1L moL的NADH所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位?？?NADH -GOGAT 活 性計(jì)算以每小時(shí)每克鮮重材料催化 NADH 減少 的 L mol 數(shù)表示。1. 3. 5 籽?？偟鞍踪|(zhì)含量的測(cè)定 對(duì)供試小麥采用M icr o -Visco -Amy Io -Graph分析儀（德國(guó)Brabender公司生 產(chǎn),按1998年美國(guó)谷 物化學(xué) 協(xié)會(huì)年會(huì)上發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 測(cè)定 17。每個(gè)樣品測(cè)定 3次 , 取平均值。2 結(jié)果與分析2. 1 基因型對(duì)小麥一葉一心

21、期 GS 及其同工酶 活性的影響從表 1可以看出 , 一葉一心期 , 籽粒蛋白含量 越高的小麥品種 , 葉片 GS 活性 越低 , 其相關(guān)系數(shù) 為 -0. 967。不同筋型小麥品種間 , 葉片 GS 活性 表現(xiàn)為 :強(qiáng)筋小麥 中筋小麥 NH 2-N NH 4+-N, 且處理間 差異 達(dá) 顯 著水 平 ; 弱 筋 小麥 豫 麥 50表 現(xiàn) 為 :NO 3-NNH 4+-N NH 2-N, 處理 間達(dá) 顯著差 異水平 ; 中筋小麥豫麥 49在 NH 2-N 處理下 GS活性最高 , NH 4+-N 和 N O 3-N 處理差異 較小 , 并均顯著低于 NH 2-N 處理。不同專用小麥葉 片 GS

22、最高活性在各處理間表現(xiàn)為 :豫麥 50(NO -3-N, 0. 602 強(qiáng)筋型小麥 (N O 3-N, 0. 5360. 591 豫麥 49(NH 2-N, 0. 527 。表 2 氮素形態(tài)對(duì)不同專用小麥葉片 GS 活性的影響 (OD 值Table 2 Effects of N forms on leaf GS activity of different wheat cultiv ars f or special end use處理T reatment鄭農(nóng) 16Zhengn on g 16鄭麥 9023Zh en gmai 9023豫麥 34Yu mai 34 豫麥 49Yum ai49 豫麥

23、 50Yumai 50 銨鹽 NH 4+-N 0. 4190.4300. 5360. 4730. 573尿 素 NH 2-N 0. 4480. 5100. 5420. 5270. 368iH-mI ir#838#麥類作物學(xué)報(bào)第28卷GSlGS2NHf-bT2 3 4NHfNN07N24241:鄭農(nóng) 16; 2:鄭麥 9023; 3豫麥 34; 4:豫麥 49; 5:豫麥 50 1:Zhe ngnong 16; 2:Zhen gmai 9023; 3:Yum ai 34; 4:Yumai 49; 5:Yum ai 50圖2氮素形態(tài)對(duì)四葉 一心期小麥葉片GS同工酶的影響Fig. 2Effects

24、o f N fo rm s on leaf GS iso en zym es of differe nt w hea t cultiva rs a t the fourth expen ded leaf p eriod由圖 2可以看出 , 四葉一心期不同小麥品種 葉片 GS 也有 2種同工酶 , 其中 ,GS1 活性均呈降 低趨勢(shì) , 并以強(qiáng)筋型小麥降幅最大。 NH 4+-N 處 理下品種間 GS1 活性下降幅度相近 , 為 61. 4% 66. 9%; NH 2+-N 處 理 下 下 降 幅 度加 大 , 為 57.1%65. 8%; NO 3-N處理下GS1活性下降 幅度進(jìn)一步加大,為69

25、. 5%81. 0%。GS2活性因品種和氮素形 態(tài)不同表 現(xiàn)出較大的差異。NH 4+-N處理后，中筋小麥豫麥49和弱筋小麥豫 麥50的GS2活性均高于強(qiáng)筋小麥,與一葉一心 期 相 比 , 分 別提 高 40%和 152. 9%, 強(qiáng) 筋 品 種 間豫 麥 34的 降 幅 較 小 , 為 32.9%; NH 2-N處理后,中筋小麥豫麥49的GS2活性繼續(xù)提升,增幅為15. 9%,豫麥 34的GS2活性較一葉一心期基本持平,其他強(qiáng)筋品種仍處下 降狀態(tài),弱筋品種也 下降34. 1%; NO 3-N處理 下,強(qiáng)筋型和中筋型品種間 GS2活性均為下降趨 勢(shì),其 中 , 強(qiáng) 筋 品 種 豫 麥 34的 降

26、 幅 最 小 , 為 48. 2%, 弱筋小麥 呈增加態(tài)勢(shì) , 增幅 75.3%。上述結(jié)果表明,不同氮素形態(tài)對(duì)GS2的激活效應(yīng)不 等,相對(duì)而言,弱筋小麥GS2對(duì)氮素形態(tài)的敏感 性最強(qiáng)，順序 為:N H 4+-N NO 3-N NH 2-N,其次是中筋 型小麥,依次為NH 4+-NNH 2-N NO -3-N,強(qiáng)筋小麥GS2受氮素的激活效應(yīng)最弱,但在強(qiáng)筋小麥中豫麥34GS2對(duì)氮素相對(duì)敏感,依次為:NH 2-NNH 4+-NNO - 3-N 。2. 3基 因 型 和 氮 素 形 態(tài) 對(duì) 小 麥 苗 期 葉 片 GOGAT 活性的影響一葉一心期 , 不同基因型小麥葉片 GOGAT 活性和 GS 活性

27、表現(xiàn)一致 （表 2 , 即 強(qiáng)筋小麥 （鄭 農(nóng) 16、 鄭麥 9023、 豫麥 34 小于中 筋小 麥 （豫麥 49 和弱筋小麥 （豫麥 50 , 但強(qiáng)筋小麥品種間及 中筋和弱筋小麥品種 間的差異較小。四葉一心 期 , 除 豫麥 34外 , 其他品種葉片 GOGAT 活性都 降低。不同氮素處理對(duì) GOGAT 活性影 響不同 , 但差異不顯著。 NO 3-N 處理下 , 弱筋小麥豫麥 50GOGAT 活性最大 , 中 筋小麥豫麥 49次之 , 強(qiáng) 筋小麥鄭麥 9023最低。 NH 2-N 處理 下 , 中筋小 麥豫麥49的 GOGAT 活性最大 , 強(qiáng)筋小麥次之 , 弱筋小麥豫麥 50最 低。

28、NH 4+-N 處理GOGAT 活性沒有規(guī)律性。表 3氮素形態(tài)對(duì)專用小麥 G OG AT 活性的影響 L mol #g -1#h -1（F W Table 3Eff ects of N f orms on leaf GOGAT activity of diff erent wheat cultivars for special end use生育時(shí)期 Gr ow th phase處理T reatmen t鄭農(nóng) 16Zhen gnong16鄭麥 9023Zhengm ai9023豫麥 34Yumai34豫麥 49Yum ai49豫麥 50 Yumai50一葉一心 1.5leaves水培 Hyd

29、rop on ics 0. 1290. 1290. 1190. 1410. 14四葉一心 4. 5leaves NH 4+-N 0. 0870. 0780. 1330. 1240. 132 NH 2-N 0. 0950. 1020. 1240. 1350.090 NO 3-N 0. 0940. 0820. 1180. 1240. 133小麥從種子萌動(dòng)到三葉期經(jīng)歷從異養(yǎng)到自養(yǎng) 過程 , 前期主要依靠自身儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)的轉(zhuǎn)化進(jìn) 行生長(zhǎng) , 各種酶催化 的底物來自于 種子。 GS 主要同化胚乳儲(chǔ)存蛋 白降解以及氨基酸分解代謝所 產(chǎn)生的游離氨 12, 13, 絲瓜和甜瓜種子在無外源氮 萌發(fā)時(shí) , GS

30、 和 GOGAT 活性隨時(shí)間 增加先升高 后降低 5、 8, 說明隨著 儲(chǔ)存氮源 的耗盡氨同化關(guān)鍵酶活性降低。本試驗(yàn)中，異養(yǎng)期不同專用小麥GS1基因型差異 較小 , GS2 基因型差異較 大 , 且 強(qiáng)筋小麥 中筋小麥 弱筋小麥。該期小麥葉片GS2同工酶活性和籽粒蛋白含量呈正比，由于小 麥籽粒含氮量在相同的生長(zhǎng)環(huán)境下 主要取決于基 因型，因而較高的GS2同工酶活性可以作為選育 強(qiáng)筋小麥品種的指 標(biāo)。不同專用品種 GS 活性和GS 同工酶積分光密度總和 之間表現(xiàn)不一 致 , 可能與自身物質(zhì)降解供氮及GS1、 GS2 單獨(dú)催化能 力有關(guān) , 需要進(jìn)一步深入研究。植物根系吸收的無機(jī)氮以 NO 3-為

31、主 , 運(yùn)輸至葉片后還原為 NH 4+, 后者被 GS同化為谷氨 酰胺。 GS/GOGAT 循環(huán)是植物體內(nèi)將無機(jī)氮轉(zhuǎn) 化成有機(jī)氮的主要途 徑 16。作物幼苗 GS 的活性 受供氮量和氮素形態(tài)的影響 14, 15, 但不同形態(tài)氮 素供應(yīng)對(duì)作物的影響較為復(fù)雜。甜瓜在子葉發(fā)育 的前 7d 外源氮素對(duì) GS 活性促進(jìn) 作用較?。辉诮z瓜子種子萌發(fā)和子葉發(fā)育時(shí),外源氮對(duì)GS1的誘導(dǎo)作用大于GS2;劉永華認(rèn)為 , 強(qiáng)光下硝態(tài)氮較銨 態(tài)氮更能促進(jìn)番茄 GS 活性 10, 李澤松等發(fā)現(xiàn)銨 態(tài)氮 較 硝態(tài) 氮 和 Gln 更能 促進(jìn) 水稻根 GS 和 GOGAT 活性 , 因?yàn)?NO 3-能夠誘導(dǎo) GS 同工酶基

32、 因表達(dá) , 促進(jìn) GS 酶活性提高 17; 黃勤妮等認(rèn)為 , NH 4+-N 不但 可以誘導(dǎo)根中GS2-m RNA的轉(zhuǎn)錄,而且可以激活GS216。本研究發(fā)現(xiàn),進(jìn)入 自養(yǎng)期后，不同基因型小麥對(duì)氮素形態(tài)反應(yīng)不同，氮素形態(tài)主要通過改變GS2的 表達(dá)進(jìn)而影響GS活性。比較不同專用小麥葉片 GS2最高活性的處理表現(xiàn)為：豫麥 34(NH 2-N 豫麥 49(NH 4+-N 豫麥 50(NH 4+-N 鄭麥 9023(NH 2-N 鄭農(nóng)16(N O 3-N ,說明不同氮素形態(tài)對(duì)不同基因 型小麥品種GS2的誘導(dǎo)效果 不同。與其他研究 者的結(jié)果不完全一致 , 可能是材料不同 (如水稻 和處理方法 (如氮素浸泡

33、 第一葉片 不同所致。本 試驗(yàn)采用砂基水培法以異養(yǎng)與自養(yǎng)期小麥功能葉 片為研究 對(duì)象 , 更符合小麥的真實(shí)生長(zhǎng)情況。不 同氮素形態(tài)對(duì)不同小麥品種苗期誘導(dǎo)所表現(xiàn) 出的 差異 , 可能與小麥基因型與氮素的互作有關(guān) , 具體 機(jī)理需要進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn) ：1 L ea PJ, Irel RJ. Nitrog en metab olism in h igher plan ts C / S ingh B K. PlantAmino Acids , Biochemistry and Biotechnol -ogyC. M arcel Dekk er, New York, 1999:1-47.2 Lam

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