第3章愈傷組織培養(yǎng)

1、第3章愈傷組織培養(yǎng) 第三章 愈傷組織培養(yǎng) 第3章愈傷組織培養(yǎng) 本章內(nèi)容本章內(nèi)容 一、植物的組織培養(yǎng)一、植物的組織培養(yǎng) 二、愈傷組織培養(yǎng)二、愈傷組織培養(yǎng) 三、植物脫毒及快速繁殖技術(shù)三、植物脫毒及快速繁殖技術(shù) 四、器官培養(yǎng)四、器官培養(yǎng) 第3章愈傷組織培養(yǎng) 組織培養(yǎng)常見的概念組織培養(yǎng)常見的概念 1.外植體（外植體（explant）：從植物體上分離下來的用于 離體培養(yǎng)的材料。 2.分化（分化（differentiation）：細(xì)胞在分裂過程中發(fā)生 結(jié)構(gòu)和功能上結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在個(gè)發(fā)育中形成各類組 織和器官完成整個(gè)生活周期。 3.脫分化（脫分化（dedifferentiation）:已分化好的細(xì)

2、胞已分化好的細(xì)胞在 人工誘導(dǎo)條件下，恢復(fù)分生能力，回復(fù)到分化組織 狀態(tài)的過程。 4.再分化（再分化（redifferentiation）:脫分化后具有分生能 力的細(xì)胞再經(jīng)過與原來相同的分化過程，重新形成 各類組織和器官的過程。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 5.愈傷組織（愈傷組織（callus）:在離體培養(yǎng)過程中形成的 具有分生能力的一團(tuán)不規(guī)則細(xì)胞，多在外植體切 面上產(chǎn)生。 6.胚狀體（胚狀體（embroid）:對(duì)應(yīng)于胚（embryo）， 在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一種形似胚（具有明顯的 根端和芽端），功能與胚相同的結(jié)構(gòu)。胚狀體原 始細(xì)胞特征：原生質(zhì)濃厚，細(xì)胞核較大，處于細(xì) 胞質(zhì)中央。 7.人工種子人工種子(

3、artificial seed): 指將植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚包埋在含有營(yíng) 養(yǎng)成分和保護(hù)功能的物質(zhì)中,在適宜條件下發(fā)芽出 苗的顆粒體。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 第一部分、植物組織培養(yǎng) 第3章愈傷組織培養(yǎng) 一、植物組織培養(yǎng)的概念 廣義：又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離 出符合需要的組織、器官或細(xì)胞、原生質(zhì) 體等，通過無菌操作，在人工控制條件下 進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具 有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。 狹義：組培指用植物各部分組織，如形成 層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進(jìn)行培 養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各 器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再 經(jīng)過再分化形成再生植物。 第3章愈傷組織

4、培養(yǎng) 二、植物組織培養(yǎng)的重要意義： 加速無性繁殖； 獲取脫毒苗; 擴(kuò)大變異范圍； 加速親本材料的純化。一般選育自交系需 46代花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株，染色體 加倍后即為純合二倍體。 種質(zhì)資源的試管保存。 為基因工程的全面實(shí)施人工控制遺傳方向 打下基礎(chǔ)。 第3章愈傷組織培養(yǎng) (1)克服遠(yuǎn)緣雜交后代不育性和雜交不親和 性。 (2)通過原生質(zhì)體融合獲得體細(xì)胞雜種和胞 質(zhì)雜種。 (3)倍性育種：通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體； 通過花粉和花藥培養(yǎng)進(jìn)行單倍體育種。 (4)結(jié)合誘變育種在試管內(nèi)進(jìn)行優(yōu)良變異的 誘導(dǎo)、選擇和繁殖。 主要體現(xiàn)在： 第3章愈傷組織培養(yǎng) 三三、植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)、植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)

5、 l植物細(xì)胞的全能性： 指每個(gè)植物細(xì)胞都具有形成完整植株的潛 在能力，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞都具有全套的遺傳 基因，無論是性細(xì)胞還是體細(xì)胞在特定條 件下可以進(jìn)行表達(dá)。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 五、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用五、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用 1.無性系快速繁殖 ； 2.花藥培養(yǎng)和花粉單倍體育種加快育種過程； 3.藥用植物的工廠化生產(chǎn)（如人參）； 4.種質(zhì)的保存和基因庫(kù)的建立； 5.突變體的篩選培育。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 第二部分、外植體的選擇和培養(yǎng)第二部分、外植體的選擇和培養(yǎng) 一、外植體的選擇: 外植體部位; 取材季節(jié); 器官和生理狀態(tài)和發(fā)育年齡; 外植體的大小。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 二、外植體的滅菌 總的原則

6、：采用各種方法包括物理方法物理方法和化學(xué)化學(xué) 方法方法去除外植體的表面微生物。 1、莖尖、莖段及葉片等的消毒： 用清潔劑清洗-75%酒精浸泡10-20sec-無菌水洗2- 3次-Naclo或升汞溶液泡10-30min-無菌水洗3-4次 2、果實(shí)和種子的消毒： 自來水沖洗10-30min-70%酒精漂洗-2%Naclo液浸 2030min-無菌水2-3次-取出種子培養(yǎng) 第3章愈傷組織培養(yǎng) 3、根及地下部器官的消毒： 自來水沖洗-純酒精漂洗-升汞浸5-10min 或2%Naclo液浸10-3min-無菌水洗3次。 4、花藥的消毒： 70%酒精浸泡數(shù)秒鐘-無菌水洗2-3次-漂 白粉上清液浸10min

7、-無菌水洗2-3次。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 三、外植體接種和培養(yǎng)三、外植體接種和培養(yǎng) 1、外植體的接種 （1）接種室的消毒:用70%酒精噴霧使細(xì)菌 和真菌孢子隨灰塵的沉降而沉降,再用紫外 燈照射20min；或用高錳酸鉀與甲醛蒸氣熏 蒸。超凈工作臺(tái)可用新吉爾滅或酒精擦洗， 其它一切器皿、衣物都要經(jīng)嚴(yán)格的滅菌才 能帶進(jìn)接種室。 （2）接種：左手拿試管或三角瓶，右手拿 接種針或鑷子接種，瓶口要靠近酒精燈火 焰、接種動(dòng)作要快，以免造成污染。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 2.培養(yǎng)方法 （1）根據(jù)外植體不同可分為： 胚胎培養(yǎng) 器官培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)； 第3章愈傷組織培養(yǎng) 1、胚胎培養(yǎng) 指以從胚珠

8、中分離出來的成熟或未成熟 胚為外植體的離體無菌培養(yǎng)。 2、器官培養(yǎng) 指以植物的根、莖、葉、花、果等器官為外植 體的離體無菌培養(yǎng)，如根的根尖和切段，莖的莖 尖、莖節(jié)和切段，葉的葉原基、葉片、葉柄、葉 鞘和子葉，花器的花瓣、雄蕊（花藥、花絲）、 胚珠、子房、果實(shí)等的離體無菌培養(yǎng)。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 3、組織培養(yǎng) 指以分離出植物各部位的組織（如分生組織、形 成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮、皮層、胚乳組織、 薄壁組織、髓部等），或已誘導(dǎo)的愈傷組織為外 植體的離體無菌培養(yǎng)。這是狹義的植物組織培養(yǎng)。 4、細(xì)胞培養(yǎng) 指以單個(gè)游離細(xì)胞（如用果酸酶從組織中分離的 體細(xì)胞，或花粉細(xì)胞，卵細(xì)胞）為接種體的離體 無菌培

9、養(yǎng)。 5、原生質(zhì)體培養(yǎng)。 指以除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體為外植體的離體無菌 培養(yǎng) 第3章愈傷組織培養(yǎng) （2）根據(jù)培養(yǎng)方式不同可分為： 固體培養(yǎng) 液體培養(yǎng) 半固體培養(yǎng) 雙層培養(yǎng)； 第3章愈傷組織培養(yǎng) 3.培養(yǎng)條件：溫度、濕度、光照、PH值、氧 和其它氣體； 4.外植體褐變及其防止： (1)培養(yǎng)基中加入抗氧化劑； (2)用抗氧化劑浸泡外植體后再接種； (3)減少光照強(qiáng)度或在黑暗條件下培養(yǎng)； (4)多次更換培養(yǎng)基達(dá)到稀釋釋效應(yīng)； (5)加入多胺類物質(zhì)，如精胺、亞精胺通過 刺激細(xì)胞分裂，加速組織生長(zhǎng)，減少褐化。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 四、影響植物組培的因素四、影響植物組培的因素 1.植物因素：(1)基因型，(

10、2)植物年齡，(3)組 織和器官的年齡，(4)植物的生理狀態(tài)，(5) 取材年份及生長(zhǎng)條件，(6)取材部位及大小。 2.培養(yǎng)基因素：無機(jī)鹽、有機(jī)化合物、植物 激素、天然提取物、瓊脂、PH值、滲透壓、 活性炭。 3.環(huán)境因素：(1)光照：包括光強(qiáng)、光質(zhì)、光 周期，(2)溫度，(3)濕度，(4)氣體。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 第二部分、愈傷組織培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng) 第3章愈傷組織培養(yǎng) 植物受傷后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁植物受傷后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁 細(xì)胞，通常分為胚性愈傷組織和非胚性愈細(xì)胞，通常分為胚性愈傷組織和非胚性愈 傷組織；傷組織； 在組織培養(yǎng)中，指在人工培養(yǎng)基上由外在組織培養(yǎng)中，指在人工培養(yǎng)基

11、上由外 植體長(zhǎng)出的一團(tuán)無序生長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞。植體長(zhǎng)出的一團(tuán)無序生長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞。 愈傷組織愈傷組織: 幾個(gè)相關(guān)概念 第3章愈傷組織培養(yǎng) 體細(xì)胞胚： 是由體細(xì)胞組織（一般指愈傷組織）經(jīng)培 養(yǎng)再分化形成； 形成過程：胚性愈傷組織形成后，有的在 胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上能直接形成體 細(xì)胞胚，如花生、小麥，但還有些情況， 必須將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞胚誘導(dǎo) 培養(yǎng)基上才能形成體胚。 性細(xì)胞胚： 是由性細(xì)胞（包括卵細(xì)胞和精細(xì)胞）再分 化形成。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 一、一、愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo) l 愈傷組織的誘導(dǎo)：愈傷組織的誘導(dǎo)：植物的組織、細(xì)胞植物的組織、細(xì)胞 在離體培養(yǎng)時(shí)，如果給予一定條件，使已在

12、離體培養(yǎng)時(shí)，如果給予一定條件，使已 分化成熟、即停止分裂的細(xì)胞經(jīng)脫分化又分化成熟、即停止分裂的細(xì)胞經(jīng)脫分化又 再重新分裂、增殖、生長(zhǎng)再重新分裂、增殖、生長(zhǎng)的的形成未分化的形成未分化的 愈傷組織的現(xiàn)象愈傷組織的現(xiàn)象過程。過程。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 1、誘導(dǎo)材料 一般來講，花藥、幼胚、莖尖培養(yǎng)容易形 成胚性愈傷組織或直接形成胚狀體，但莖、葉 片、葉柄等外植體在適宜的培養(yǎng)基上也能形成 胚性愈傷組織或胚狀體。 2、誘導(dǎo)條件 胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基一般只加生長(zhǎng)素， 并以2，4D效果最好。但植物不同或組織不 同，添加的濃度差別很大。如小麥幼胚培養(yǎng)適 宜 2，4D濃度為2mg/L，甘薯莖尖培養(yǎng)為0。 22。

13、0mg/L，因品種不同而不同 第3章愈傷組織培養(yǎng) 愈傷組織的形成大致經(jīng)過： 1、起始期（誘導(dǎo)期） 2、分裂期 3、形成期 但三個(gè)時(shí)期沒嚴(yán)格界限。 二、愈傷組織的形成二、愈傷組織的形成 第3章愈傷組織培養(yǎng) 1.起始期（誘導(dǎo)期） ： 指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期，當(dāng)外植 體已分化的活細(xì)胞在外源植物生長(zhǎng)物質(zhì)的 作用下，通過脫分化起動(dòng)而進(jìn)入分裂和形 成愈傷組織。 第3章愈傷組織培養(yǎng) l培養(yǎng)條件下的細(xì)胞脫分化 培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回 復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的 過程就是細(xì)胞脫分化 （dedifferentiationdedifferentiation） 第3章愈傷組織培養(yǎng) （1）、植物細(xì)胞的

14、分類： 莖尖、根尖及形成層細(xì)胞、始終保持分 裂能力 表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞，受到外界刺 激后可重新啟動(dòng)分裂 篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞 永久失去分裂能力 第3章愈傷組織培養(yǎng) （2）、）、 第3章愈傷組織培養(yǎng) （3 3）、誘導(dǎo)脫分化過程中細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變）、誘導(dǎo)脫分化過程中細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變 化：化： 細(xì)胞大小沒有多大變化；細(xì)胞大小沒有多大變化； 細(xì)胞質(zhì)顯著變濃；細(xì)胞質(zhì)顯著變濃； 大液泡消失；大液泡消失； RNA含量迅速增加，細(xì)胞核體積明顯含量迅速增加，細(xì)胞核體積明顯 增大增大并逐漸移位至細(xì)胞中央；并逐漸移位至細(xì)胞中央； 細(xì)胞器增加。細(xì)胞器增加。 第3章愈傷組織培養(yǎng) （4 4）、細(xì)胞脫分化

15、的重要特征：）、細(xì)胞脫分化的重要特征： 液泡蛋白體的出現(xiàn)液泡蛋白體的出現(xiàn) 質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體 第3章愈傷組織培養(yǎng) （5）、誘導(dǎo)期的長(zhǎng)短）、誘導(dǎo)期的長(zhǎng)短 誘導(dǎo)期因植物種類和外植體的生理狀況誘導(dǎo)期因植物種類和外植體的生理狀況 和外部因素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好和外部因素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好 幾天，新鮮的菊芋塊莖則只要幾天，新鮮的菊芋塊莖則只要22h，但菊芋，但菊芋 塊莖經(jīng)過塊莖經(jīng)過5個(gè)月的貯藏后，誘導(dǎo)期則須延長(zhǎng)個(gè)月的貯藏后，誘導(dǎo)期則須延長(zhǎng) 到到40h以上。以上。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 2、分裂期：、分裂期： 劃分：細(xì)胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時(shí)期劃分：細(xì)胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時(shí)

16、期 分裂期是指細(xì)胞通過一分為二的分裂，不斷增分裂期是指細(xì)胞通過一分為二的分裂，不斷增 生子細(xì)胞的過程。外植體的細(xì)胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)，生子細(xì)胞的過程。外植體的細(xì)胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)， 其外層細(xì)胞開始迅速分裂，使細(xì)胞脫分化。其外層細(xì)胞開始迅速分裂，使細(xì)胞脫分化。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 分裂期主要表現(xiàn)如下分裂期主要表現(xiàn)如下： 1. 細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。如胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。如胡蘿卜培養(yǎng)7天后，細(xì)天后，細(xì) 胞數(shù)可增加胞數(shù)可增加10倍；倍； 2. 每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。這是由于細(xì)胞鮮重的增每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。這是由于細(xì)胞鮮重的增 加不如細(xì)胞數(shù)目的增加快的緣故；加不如細(xì)胞數(shù)目的增加快的緣故； 3. 細(xì)胞體

17、積小，內(nèi)無液泡，如同根尖和莖尖的分生細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡，如同根尖和莖尖的分生 組織細(xì)胞特性；組織細(xì)胞特性； 4 細(xì)胞的核和核仁增大到最大；細(xì)胞的核和核仁增大到最大； 5. 細(xì)胞中細(xì)胞中RNA含量減少，而含量減少，而DNA含量保持不變；含量保持不變； 6. 隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長(zhǎng)，細(xì)胞的總干重、隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長(zhǎng)，細(xì)胞的總干重、 蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細(xì)胞壁的合成極蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細(xì)胞壁的合成極 快?？?。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 分裂期的愈傷組織的共同特征是：分裂期的愈傷組織的共同特征是： 細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織 的結(jié)構(gòu)，維持

18、其不分化的狀態(tài)。的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 3、形成期：從愈傷組織到器官發(fā)生、形成期：從愈傷組織到器官發(fā)生 形成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形形成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形 成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。 進(jìn)入形成期后，細(xì)胞的平均大小相對(duì)穩(wěn)定，進(jìn)入形成期后，細(xì)胞的平均大小相對(duì)穩(wěn)定， 不再減少，細(xì)胞分裂由原來局限在組織外緣的平不再減少，細(xì)胞分裂由原來局限在組織外緣的平 周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂，結(jié)周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂，結(jié) 果形成瘤狀或片狀的擬分生組織果形成瘤狀或片狀的擬分生組織 （meristemoi

19、d），稱做分生組織結(jié)節(jié)。），稱做分生組織結(jié)節(jié)。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長(zhǎng)分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長(zhǎng) 中心，或者進(jìn)一步分化為維管組織結(jié)節(jié)中心，或者進(jìn)一步分化為維管組織結(jié)節(jié) 由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細(xì)胞作平周分裂由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細(xì)胞作平周分裂 成為形成層狀細(xì)胞，并形成了部分維管組成為形成層狀細(xì)胞，并形成了部分維管組 織如管胞、纖維細(xì)胞等，但不形成維管系織如管胞、纖維細(xì)胞等，但不形成維管系 統(tǒng)。統(tǒng)。 由于此期細(xì)胞分裂已基本停止，細(xì)胞內(nèi)由于此期細(xì)胞分裂已基本停止，細(xì)胞內(nèi) 發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不 同形態(tài)和功能的細(xì)胞，

20、因此有人又將此期同形態(tài)和功能的細(xì)胞，因此有人又將此期 稱為分化期。稱為分化期。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 三、愈傷組織類型及特征三、愈傷組織類型及特征 物理結(jié)構(gòu)上可分為：物理結(jié)構(gòu)上可分為： 1.結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密， 多為淡黃色或白色，易于再生芽多為淡黃色或白色，易于再生芽 2.結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系 建立。建立。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 生理狀態(tài)上可分為： 1、胚性愈傷組織胚性愈傷組織（Embryonenic callus）: 容易形成體胚 特點(diǎn)：表面光滑，組織結(jié)構(gòu)緊湊，細(xì)胞小、再 生能力強(qiáng) 2、非

21、胚性愈傷組織非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì) 胞大 一般，非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較高，可達(dá)到 100，即100的外植體可以形成愈傷組織；而 胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較低。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 四、影響愈傷組織形成的因素四、影響愈傷組織形成的因素 1、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（激素）：影響最大，培養(yǎng)基 中加入生長(zhǎng)素類有效，尤其2，4D； 2、氮源：NH4+、氨基酸、酰胺等有機(jī)酸也能促進(jìn) 愈傷組織的發(fā)生； 3、植物基因型的影響：主要考慮不同植物，或 同一植物不同品種（不同基因型） 4、植物的來源和年齡：生長(zhǎng)點(diǎn)、幼胚、花藥、 花粉等容易形成胚性愈傷組織； 5、其它因素：包括培養(yǎng)溫度、光照時(shí)間和強(qiáng)度 第3章

22、愈傷組織培養(yǎng) 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)水稻愈傷組織的誘導(dǎo) 第3章愈傷組織培養(yǎng) 花生愈傷組織的誘導(dǎo)花生愈傷組織的誘導(dǎo) 西北大學(xué)西北大學(xué) 郝浩永郝浩永 結(jié)論結(jié)論 第3章愈傷組織培養(yǎng) 白蘆筍花藥愈傷組織誘導(dǎo)白蘆筍花藥愈傷組織誘導(dǎo) 福建省熱帶作物科學(xué)研究所福建省熱帶作物科學(xué)研究所 得出結(jié)果：得出結(jié)果： 光照利于愈傷光照利于愈傷 組織的形成組織的形成 第3章愈傷組織培養(yǎng) 愈傷組織的增殖生長(zhǎng)：只發(fā)生在不與瓊脂接觸的表 面，而與瓊脂接觸的一面極少細(xì)胞增殖，只是細(xì)胞 分化形成緊密的組織塊，它是愈傷組織表面或近表 面瘤狀物生長(zhǎng)的結(jié)果。 五、愈傷組織的生長(zhǎng)五、愈傷組織的生長(zhǎng) 愈傷組織的質(zhì)地：松脆和堅(jiān)實(shí)兩類，可互相轉(zhuǎn)變。

23、 轉(zhuǎn)變方法是： （1）、加入高濃度的生長(zhǎng)物質(zhì)高濃度的生長(zhǎng)物質(zhì)，可使堅(jiān)實(shí)的愈傷 組織變?yōu)樗纱唷?（2）、 反之，減低或除去生長(zhǎng)物質(zhì)減低或除去生長(zhǎng)物質(zhì)，則松脆的愈 傷組織可以轉(zhuǎn)變?yōu)閳?jiān)實(shí)。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng) ：定期（定期（24周）將愈傷組織分成周）將愈傷組織分成 小塊，接種到新鮮的原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)以小塊，接種到新鮮的原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)以 維持愈傷組織生長(zhǎng)維持愈傷組織生長(zhǎng)的方法。的方法。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 六、愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式六、愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式 q外植體外植體 脫分化脫分化 愈傷組織愈傷組織 再分化再分化 根、根、 芽、胚狀體芽、胚狀體 發(fā)育發(fā)育 完整植株完整植株

24、 q在植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中，從外植體形在植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)中，從外植體形 成器官或細(xì)胞無性系的形態(tài)發(fā)生，有兩成器官或細(xì)胞無性系的形態(tài)發(fā)生，有兩 種方式：種方式：不定芽方式不定芽方式 和和胚狀體方式胚狀體方式 第3章愈傷組織培養(yǎng) 1 1、不定芽方式、不定芽方式 定義：指細(xì)胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過定義：指細(xì)胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過 形成不定芽再生成植株形成不定芽再生成植株 。它具。它具有三個(gè)有三個(gè) 不同生長(zhǎng)階段不同生長(zhǎng)階段 ： 外植體脫分化形成愈傷組織外植體脫分化形成愈傷組織 愈傷組織中形成一些分生細(xì)胞愈傷組織中形成一些分生細(xì)胞 1)1) 形成器官原基，從而分化出芽或根。形成器官原基，從而分化出芽

25、或根。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 愈傷組織的器官發(fā)生順序的四種情況：愈傷組織的器官發(fā)生順序的四種情況： 無根的芽或無芽的根；無根的芽或無芽的根； 先形成芽，再出根先形成芽，再出根，多數(shù)植物屬這種情況；多數(shù)植物屬這種情況； 先產(chǎn)生根，再出芽；先產(chǎn)生根，再出芽； 不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起 來形成一株小植株來形成一株小植株 。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 第3章愈傷組織培養(yǎng) 2 2、胚狀體方式、胚狀體方式 定義：指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、定義：指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、 胚根、胚軸的胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)（胚狀體）胚狀結(jié)構(gòu)（胚狀體），進(jìn)而，進(jìn)而 長(zhǎng)成完整植

26、株長(zhǎng)成完整植株 ?？煞秩齻€(gè)不同發(fā)育階段：可分三個(gè)不同發(fā)育階段： 外植體脫分化形成愈傷組織；外植體脫分化形成愈傷組織； 胚狀體形成胚狀體形成 ； 1)1) 胚狀體再發(fā)育成完整植株。胚狀體再發(fā)育成完整植株。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 3 3、胚狀體與不定芽的區(qū)別、胚狀體與不定芽的區(qū)別 胚狀體來自單個(gè)細(xì)胞，具有明顯的兩極性：分化胚狀體來自單個(gè)細(xì)胞，具有明顯的兩極性：分化 根端和苗端根端和苗端，而不定芽或不定根都為單向極性。而不定芽或不定根都為單向極性。 胚狀體形成的小植株與周圍組織無結(jié)構(gòu)聯(lián)系胚狀體形成的小植株與周圍組織無結(jié)構(gòu)聯(lián)系 ；而而 不定芽或不定根往往總是與母體愈傷組織的維管不定芽或不定根往往總是與母

27、體愈傷組織的維管 組織相聯(lián)系。組織相聯(lián)系。 胚狀體的維管組織的分布是呈獨(dú)立的胚狀體的維管組織的分布是呈獨(dú)立的“Y”字形，字形， 而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象。而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 七、愈傷組織形態(tài)發(fā)生的調(diào)控七、愈傷組織形態(tài)發(fā)生的調(diào)控 細(xì)胞和愈傷組織的形態(tài)發(fā)生，主細(xì)胞和愈傷組織的形態(tài)發(fā)生，主 要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境 等三大類因素的調(diào)控。等三大類因素的調(diào)控。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 來源于不同植物或同一種植物不同部位的來源于不同植物或同一種植物不同部位的 愈傷組織，在顏色、結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)習(xí)性上都可愈傷組織，在顏色、結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)習(xí)性上都可 能

28、存在差異，生理功能上可能具有胚性，或能存在差異，生理功能上可能具有胚性，或 是不具有胚性，在不同的實(shí)驗(yàn)中由于目的的是不具有胚性，在不同的實(shí)驗(yàn)中由于目的的 不同，對(duì)愈傷組織狀態(tài)的要求也不完全相同，不同，對(duì)愈傷組織狀態(tài)的要求也不完全相同， 但優(yōu)良的愈傷組織通常必須具備以下但優(yōu)良的愈傷組織通常必須具備以下4個(gè)特性個(gè)特性 中的中的2-3個(gè)。個(gè)。 七、愈傷組織形態(tài)發(fā)生的調(diào)控七、愈傷組織形態(tài)發(fā)生的調(diào)控 第3章愈傷組織培養(yǎng) l 1 1、具有高度的胚性或再分化能力，易得到、具有高度的胚性或再分化能力，易得到 再生植物。再生植物。 l2 2、容易散碎，可用于建立優(yōu)良的懸浮系和分、容易散碎，可用于建立優(yōu)良的懸浮系

29、和分 離出全能性的原生質(zhì)體。離出全能性的原生質(zhì)體。 l3 3、具有旺盛的自我增殖能力，便于大規(guī)模的、具有旺盛的自我增殖能力，便于大規(guī)模的 無性系培養(yǎng)。無性系培養(yǎng)。 l4 4、經(jīng)過長(zhǎng)期繼代保存而不喪失胚性。、經(jīng)過長(zhǎng)期繼代保存而不喪失胚性。 優(yōu)良的愈傷組織需具備的相關(guān)特性優(yōu)良的愈傷組織需具備的相關(guān)特性 第3章愈傷組織培養(yǎng) 1 1、材料本身、材料本身 遺傳型遺傳型 ：不同植物種不同植物種 ；同種植物的不同亞種或品同種植物的不同亞種或品 種差異很大種差異很大 ； 取材的器官和部位取材的器官和部位 : 通常同一種植物的不同器官或通常同一種植物的不同器官或 組織所形成的愈傷組織，無論在生理上或形態(tài)上，組織

30、所形成的愈傷組織，無論在生理上或形態(tài)上， 其差別均不大其差別均不大, ,但因植物不同而異；但因植物不同而異； 年齡年齡: :年齡較幼的外植體，不僅易于誘導(dǎo)形成愈傷年齡較幼的外植體，不僅易于誘導(dǎo)形成愈傷 組織，而且也容易誘導(dǎo)分化成植株組織，而且也容易誘導(dǎo)分化成植株. . 調(diào)控因素：調(diào)控因素： 第3章愈傷組織培養(yǎng) l年齡年齡： 年齡較幼的外植體。年齡較幼的外植體。 愈傷組織的年齡也有明顯影響。愈傷組織的年齡也有明顯影響。 愈傷組織的繼代次數(shù)（即愈傷組織的總愈傷組織的繼代次數(shù)（即愈傷組織的總 年齡）年齡） 。 不同植物之間分化能力喪失的程度差異不同植物之間分化能力喪失的程度差異 很大。很大。 第3章

31、愈傷組織培養(yǎng) 2 2、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 激素激素 20世紀(jì)世紀(jì)50年代初，年代初，Skoog和崔徴和崔徴 （1951，1952）發(fā)現(xiàn)腺嘌呤）發(fā)現(xiàn)腺嘌呤/IAA的比的比 例是控制芽和根形成的重要條件之一例是控制芽和根形成的重要條件之一 。 Skoog和和Miller(1957)進(jìn)一步提出了芽進(jìn)一步提出了芽 和根的形成主要受生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素和根的形成主要受生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素 兩類物質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)的理論。兩類物質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)的理論。 生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比 例小時(shí)則產(chǎn)生苗，比例大例小時(shí)則產(chǎn)生苗，比例大 時(shí)則生根，而兩種激素的時(shí)則生根，而兩種激素的 比例適中時(shí)，則產(chǎn)生

32、無結(jié)比例適中時(shí)，則產(chǎn)生無結(jié) 構(gòu)的愈傷組織。構(gòu)的愈傷組織。 第3章愈傷組織培養(yǎng) Hilderbrandt等（等（1967）研究發(fā)現(xiàn)激動(dòng)素）研究發(fā)現(xiàn)激動(dòng)素 促進(jìn)芽的形成并非濃度越高越好，而是有促進(jìn)芽的形成并非濃度越高越好，而是有 一合適范圍一合適范圍 。 不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，對(duì)生根和長(zhǎng)芽不同生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，對(duì)生根和長(zhǎng)芽 的效果是不同的。的效果是不同的。 生根：生根：NAANAA比比IAAIAA好；好； 壯根：壯根：IAAIAA比比NAANAA好；好；2,4-D2,4-D對(duì)生根不利對(duì)生根不利 長(zhǎng)芽：長(zhǎng)芽：BABA比比KTKT效力大效力大 ABAABA，GAGA3 3對(duì)芽的分化有促進(jìn)作用對(duì)芽的

33、分化有促進(jìn)作用 第3章愈傷組織培養(yǎng) 2 2）無機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素）無機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素 一般的合成培養(yǎng)基都含有能滿足離體組一般的合成培養(yǎng)基都含有能滿足離體組 織生長(zhǎng)所必需的元素，即：織生長(zhǎng)所必需的元素，即： C、H、O、 N、P、K、S、Ca、Mg、Fe、B、Mn、 Cu、Zn、Mo、Cl等等16種必需元素種必需元素 。 但各種類型的植物、器官所需要的每種但各種類型的植物、器官所需要的每種 元素的量，特別是大量元素是有區(qū)別的元素的量，特別是大量元素是有區(qū)別的 。 對(duì)離子的形式也有不同要求。對(duì)離子的形式也有不同要求。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 3 3）有機(jī)成分）有機(jī)成分 在培養(yǎng)基中加入了足夠的糖、硫胺素、在培養(yǎng)基中加

34、入了足夠的糖、硫胺素、 煙酸、吡哆醇、肌醇和甘氨酸，可以滿煙酸、吡哆醇、肌醇和甘氨酸，可以滿 足愈傷組織的生長(zhǎng)和分化的要求。足愈傷組織的生長(zhǎng)和分化的要求。 糖的種類和濃度，糖的種類和濃度， 在組織培養(yǎng)過程中加一些植物器官的汁在組織培養(yǎng)過程中加一些植物器官的汁 液，有助分化：一些生理活性物質(zhì)，或液，有助分化：一些生理活性物質(zhì)，或 是一些未知的微量成分。是一些未知的微量成分。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 4 4）物理性質(zhì)）物理性質(zhì) 培養(yǎng)基的物理性質(zhì)對(duì)器官分化對(duì)形態(tài)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)對(duì)器官分化對(duì)形態(tài) 發(fā)生有明顯的影響。發(fā)生有明顯的影響。 培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的pH值對(duì)芽的分化也有一定的值對(duì)芽的分化也有一定的 影響影

35、響 ，通常把通常把pH調(diào)整到調(diào)整到5.66.0范圍。范圍。 培養(yǎng)基中的滲透壓。培養(yǎng)基中的滲透壓。 低：不利于發(fā)育；低：不利于發(fā)育； 高：細(xì)胞易破裂高：細(xì)胞易破裂 第3章愈傷組織培養(yǎng) 3 3、培養(yǎng)環(huán)境條件、培養(yǎng)環(huán)境條件 光照光照 光對(duì)器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)，各種植光對(duì)器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)，各種植 物的器官發(fā)生對(duì)光的要求是不同的。物的器官發(fā)生對(duì)光的要求是不同的。 光照長(zhǎng)度對(duì)有正常光周期反應(yīng)的植物的器光照長(zhǎng)度對(duì)有正常光周期反應(yīng)的植物的器 官發(fā)生有明顯影響。官發(fā)生有明顯影響。 光質(zhì)對(duì)器官分化的影響，近年來也日漸引光質(zhì)對(duì)器官分化的影響，近年來也日漸引 起人們的重視起人們的重視 第3章愈傷組織培養(yǎng)

36、溫度溫度 在組織培養(yǎng)中，一般都采用在組織培養(yǎng)中，一般都采用2428的恒溫的恒溫 條件進(jìn)行外植體的培養(yǎng)。對(duì)一般植物來講，條件進(jìn)行外植體的培養(yǎng)。對(duì)一般植物來講， 可較好地形成芽和根，可較好地形成芽和根， 培養(yǎng)室的溫度最好能保持有一定的日夜溫差，培養(yǎng)室的溫度最好能保持有一定的日夜溫差， 這對(duì)器官的發(fā)生和生長(zhǎng)都是有利的。這對(duì)器官的發(fā)生和生長(zhǎng)都是有利的。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 第四節(jié)、植物脫毒及快速繁殖技術(shù)第四節(jié)、植物脫毒及快速繁殖技術(shù) 一、意義：一、意義： 能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性；能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性； 生產(chǎn)無病毒種苗，防止品種退化；生產(chǎn)無病毒種苗，防止品種退化； 快速繁殖新品種，使優(yōu)良品

37、種迅速應(yīng)用；快速繁殖新品種，使優(yōu)良品種迅速應(yīng)用； 節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率；節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率； 便于運(yùn)輸。便于運(yùn)輸。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 二、脫毒方法二、脫毒方法 熱處理脫毒 莖尖培養(yǎng)脫毒 愈傷組織培養(yǎng)脫毒 莖尖微體嫁接 化學(xué)療法脫毒 第3章愈傷組織培養(yǎng) （一）、熱處理脫毒（一）、熱處理脫毒 熱處理又稱溫治療法（熱處理又稱溫治療法（theomtherapy) 1、熱處理法的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用、熱處理法的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用 1889年印度尼西亞爪畦人發(fā)現(xiàn)，患枯萎年印度尼西亞爪畦人發(fā)現(xiàn)，患枯萎 病的病的甘蔗甘蔗（現(xiàn)證明為病毒?。?，放在（現(xiàn)證明為病毒?。旁?0-52 的熱水中保持的熱水中保持30

38、分鐘，甘蔗就可去病生長(zhǎng)良分鐘，甘蔗就可去病生長(zhǎng)良 好。好。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中 時(shí)，組織內(nèi)部的病毒受熱之后部分或全部鈍時(shí)，組織內(nèi)部的病毒受熱之后部分或全部鈍 化，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，化，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止， 而失去病毒的侵染能力；但寄主植物的組織而失去病毒的侵染能力；但寄主植物的組織 很少或不會(huì)受到傷害，反而可以加速植物細(xì)很少或不會(huì)受到傷害，反而可以加速植物細(xì) 胞的分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng)胞的分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng) 中取勝。中取勝。 2、原理：、原理： 第3章愈傷組織

39、培養(yǎng) （二）莖尖培養(yǎng)脫毒（二）莖尖培養(yǎng)脫毒 1、莖尖培養(yǎng)脫毒原理、莖尖培養(yǎng)脫毒原理 感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均 勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異， 越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染深度越低，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染深度越低， 生長(zhǎng)點(diǎn)（約生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.1-1mm區(qū)域）則幾乎不含或區(qū)域）則幾乎不含或 含病毒很少。含病毒很少。 第3章愈傷組織培養(yǎng) 2 2、脫毒基本理論假說、脫毒基本理論假說 能量競(jìng)爭(zhēng)：能量競(jìng)爭(zhēng)：DNA合成均需要消耗大量的能量合成均需要消耗大量的能量； 正常核蛋白合成占優(yōu)勢(shì)；正常核蛋白合成占優(yōu)勢(shì)； 傳導(dǎo)抑制

40、：分生組織中，維管組織還不健全，傳導(dǎo)抑制：分生組織中，維管組織還不健全， 抑制病毒通過維管束傳播；病毒只能通過胞間抑制病毒通過維管束傳播；病毒只能通過胞間 連絲傳遞，但趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生連絲傳遞，但趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生 長(zhǎng)速度長(zhǎng)速度； 激素抑制：分生組織中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素激素抑制：分生組織中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素 水平均很高；水平均很高； 其它：其它：酶缺乏；抑制因子酶缺乏；抑制因子 第3章愈傷組織培養(yǎng) （三）、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 通過植物的器官和組織的培養(yǎng)去分化誘通過植物的器官和組織的培養(yǎng)去分化誘 導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn) 生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無病毒苗。生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無病毒苗。 理論依據(jù)是愈傷組織細(xì)胞帶病原菌不均理論依據(jù)是愈傷組織細(xì)胞帶病原菌不均 一，部分細(xì)胞不帶病毒，由這些細(xì)胞再生的一，部分細(xì)胞不帶病毒，由這些細(xì)胞再生的 植株是無病毒的。植株是無病毒的。多次繼代的愈傷組織中病多次繼代的愈傷組織中病 毒繁殖速度下降毒繁殖速度下降