基因工程抗體課件

1、基因工程抗體1 基因工程抗體 （genetic engineering antibody） 基因工程抗體2 n隨著DNA重組技術(shù)以及其它分子生物學(xué) 技術(shù)的發(fā)展，人們利用基因工程技術(shù)來 制備抗體分子，這種抗體分子稱為基因 工程抗體，這是分子水平的抗體。 基因工程抗體3 優(yōu)點(diǎn) n是按人類設(shè)計(jì)所重新組裝的新型抗體分 子，可保留或增加天然抗體的特異性和 主要生物學(xué)活性，去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu) （如Fc片段），從而可克服單克隆抗體 在臨床應(yīng)用方面的缺陷（如鼠源單克隆 抗體在人體內(nèi)使用會(huì)引起抗體產(chǎn)生而降 低其效果，F(xiàn)c片段的無效性和副作用） 基因工程抗體4 基因工程抗體的制備過程 n首先是獲得抗體基因片段，可

2、從B細(xì)胞 DNA庫中篩選；用探針從雜交瘤細(xì)胞、 免疫脾細(xì)胞的DNA庫或cDNA庫中篩選； 或以PCR法直接擴(kuò)增等。 n然后將抗體基因片段導(dǎo)入真核細(xì)胞（如 雜交瘤細(xì)胞）或原核細(xì)胞（如大腸桿 菌），使之表達(dá)具有免疫活性的抗體片 段。 基因工程抗體5 目前基因工程抗體有 n嵌合抗體（chimeric antibody） n重構(gòu)抗體（reshaping antibody） n單鏈抗體（single-chain antibody） nIg相關(guān)分子 n噬菌體抗體（phage antibody） n全套抗體（the immunoglobulin repertoire）基 因庫 基因工程抗體6 （一）嵌合抗體

3、（chimeric antibody） n嵌合抗體是指在同一抗體分子中含有不 同種屬來源抗體片段的抗體，又稱雜種 抗體。 n迄今構(gòu)建的嵌合抗體多為“鼠人”類 型，也就是抗體的Fab或F(ab)2來源于鼠 類，而Fc片段來源于人類。 基因工程抗體7 嵌合抗體制備過程簡介 n將小鼠雜交瘤細(xì)胞的免疫球蛋白(Ig)VH基因與人Ig的 CH基因連接 n導(dǎo)入骨髓瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合重鏈 n再將小鼠雜交瘤細(xì)胞的Ig VL基因與人的CL基因相連 n轉(zhuǎn)染含嵌合重鏈的小鼠骨髓瘤細(xì)胞 n篩選分泌鼠人嵌合抗體的骨髓瘤細(xì)胞 所分泌的嵌合抗體與原雜交瘤細(xì)胞分 泌的抗體特異性和親和力相同，但減 少了抗體中的鼠源性成分 基因

4、工程抗體8 （二）重構(gòu)抗體（reshaping antibody） n目的：為進(jìn)一步減少鼠源蛋白在嵌合抗 體內(nèi)的含量 n改造：將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗 體Fab骨架區(qū)的編碼基因中，再將此DNA 片段與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染 雜交瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合的V區(qū)抗體。 基因工程抗體9 n本質(zhì)：實(shí)際上也就是在人抗體可變區(qū)序 列內(nèi)嵌入鼠源抗體的高變區(qū)基因序列， 通過這種置換為人類抗體提供了一個(gè)新 的抗原結(jié)合部位。 基因工程抗體10 （三）單鏈抗體（single-chain antibody） n又稱FV分子。 n目的：基因工程手段構(gòu)建更小的具有結(jié) 合抗原能力的抗體片段，即FV分子或單 鏈抗體蛋

5、白。 n本質(zhì)：是由VL區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基 酸序列經(jīng)肽連接物（linker）連接而成。 此外肽連接物還可將藥物、毒素或同位 素與單鏈抗體蛋白相融合。 基因工程抗體11 優(yōu)點(diǎn) n這類抗體具有分子量小，作為外源性蛋 白的免疫原性較低；在血清中比完整的 單克隆抗體或F(ab)2片段能更快地被清 除；無Fc片段，體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可避免非特 異性殺傷；能進(jìn)入實(shí)體瘤周圍的微循環(huán) 等優(yōu)點(diǎn)。 基因工程抗體12 （四）Ig相關(guān)分子 n原理：可將抗體分子的部分片段（如V區(qū) 或C區(qū)）連接到與抗體無關(guān)的序列上（如 毒素），就可創(chuàng)造出一些Ig相關(guān)分子 基因工程抗體13 n可將有治療作用的毒素或化療藥物取代抗體 的Fc片段

6、，通過高變區(qū)結(jié)合特異性抗原，連 接上的毒素可直接運(yùn)送到靶細(xì)胞表面，起 “生物導(dǎo)彈”的作用。 nByrn構(gòu)建的“CD4免疫粘附素”即是這一類 抗體分子，他是將CD4基因與IgG1 C區(qū)在體 外重組而表達(dá)出的Ig相關(guān)分子，它可封閉人 HIV gp120蛋白與CD4 T細(xì)胞的結(jié)合，在治 療人的愛滋病上具有潛在價(jià)值。 基因工程抗體14 （五）噬菌體抗體（phage antibody） n噬菌體表面展示技術(shù)（phage display technology）。 n是將已知特異性的抗體分子的所有V區(qū)基 因在噬菌體中構(gòu)建成基因庫，用噬菌體 感染細(xì)菌，模擬免疫選擇過程，具有相 應(yīng)特異性的重鏈和輕鏈可變區(qū)即可在

7、噬 菌體表面呈現(xiàn)出來。 基因工程抗體15 展望 n基因工程抗體由于將抗體基因置于人的操作之 下，抗體分子的大小、親和力的高低、對(duì)細(xì)胞 毒性的強(qiáng)弱，以及是否接上其它有用的分子等 都可根據(jù)治療和診斷的要求進(jìn)行設(shè)計(jì)，這是雜 交瘤技術(shù)所不及的，因此有著強(qiáng)大的生命力。 n從構(gòu)建的人和動(dòng)物抗體基因總文庫中篩選和表 達(dá)針對(duì)任一抗原的抗體基因，將結(jié)束僅依靠免 疫獲得抗體的狀況。 基因工程抗體16 催化抗體（催化抗體（catalytic antibody） n催化抗體也叫抗體酶（abzyme），是具 有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體 的高度選擇性和酶的高效催化性 n1986年Lerner和Schultz兩個(gè)研

8、究小組各 自獨(dú)立發(fā)表了他們關(guān)于抗體酶的第一篇 報(bào)告以來，抗體酶的研究已取得了相當(dāng) 廣泛的成功。 基因工程抗體17 n催化抗體制備技術(shù)的開發(fā)預(yù)示著可以人 為生產(chǎn)適應(yīng)各種用途的，特別是自然界 不存在的高效催化劑，對(duì)生物學(xué)、化學(xué) 和醫(yī)藥等多種學(xué)科有重要的理論意義和 實(shí)用價(jià)值。 基因工程抗體18 （二）催化抗體的制備 n催化抗體（抗體酶）技術(shù)是化學(xué)和免疫 生物學(xué)的研究成果在分子水平交叉滲透 的產(chǎn)物，是將抗體的極其多樣性和酶分 子的巨大催化能力結(jié)合在一起的蛋白質(zhì) 分子設(shè)計(jì)的新方法，故而顯示出較高的 理論和實(shí)用價(jià)值，成為酶工程領(lǐng)域中的 研究熱點(diǎn)。 基因工程抗體19 n在親和性和結(jié)合特異性方面，抗 體抗原的

9、相互作用與酶-底物的 相互作用相似。 基因工程抗體20 n抗體與處于穩(wěn)定、低能構(gòu)型的抗原作用，而酶 與處于不穩(wěn)定、高能的過渡態(tài)底物結(jié)合。酶結(jié) 合能量幫助打開底物分子的化學(xué)鍵。 n抗體酶的結(jié)構(gòu)應(yīng)該與底物過渡態(tài)互補(bǔ)。但這種 過渡態(tài)往往只存在短時(shí)間，所以研究者必須先 制備底物過渡態(tài)的穩(wěn)定低能類似物，然后制備 抗體酶。 基因工程抗體21 目前制備催化抗體有以下四種方法： n1細(xì)胞融合法 n2抗體結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)修飾法 n3引入輔助因子法 n4基因工程抗體技術(shù) 基因工程抗體22 1細(xì)胞融合法 n首先通過化學(xué)反應(yīng)合成反應(yīng)物的過渡態(tài) 類似物，這類類似物通常是半抗原，經(jīng) 與載體蛋白偶聯(lián)，研制針對(duì)該過渡態(tài)類 似物的

10、特異單抗，亦即抗體酶。 n這種單抗與反應(yīng)物的過渡態(tài)結(jié)合降低了 反應(yīng)的活化能，從而加速該反應(yīng)的進(jìn)行。 如催化碳酸脂水解的抗體MOPC167即以 此法制備。 基因工程抗體23 2抗體結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)修飾法 n對(duì)抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和 的方法在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功 能的基團(tuán)。 n游離巰基就是適合的基團(tuán)之一，它具有高親核 性，易于氧化，及能通過二硫化物進(jìn)行交換反 應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點(diǎn)。 基因工程抗體24 3引入輔助因子法 n很多天然酶活性中心都含有金屬離子。Lerner 等將金屬離子引入抗體酶，成功地催化了肽鍵 的選擇性水解。 n用三乙撐胺Co3+鹽作為金屬離子輔因子，所用 半抗原分子帶有一肽鍵。且通過羧酸根及仲胺 基與金屬離子相連。將此半抗原通過共價(jià)鍵連 接在載體蛋白上免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體，在金 屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體 酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵， 其轉(zhuǎn)化數(shù)達(dá)6104。 基因工程抗體25 4基因工程抗體技術(shù) n該技術(shù)在抗體酶制備中具有誘人的前景。 應(yīng)用噬菌體抗體展示技術(shù)或全套抗體基 因庫，并輔以計(jì)算機(jī)模擬，為篩選特定 目的高效催化抗體提供了豐富的資源和 技術(shù)支撐。 基因工程抗體26 （三）催化抗體的應(yīng)用 n用病毒特異蛋白質(zhì)片段的過渡態(tài)模擬物 免疫動(dòng)物，產(chǎn)生能特異水解病毒蛋