聚合酶鏈式分子生物間的反應(yīng)

1、聚合酶鏈式分子生物間的反 應(yīng) PCRPCR技術(shù)技術(shù) 生命信息的放大生命信息的放大 生物芯片生物芯片 生命信息的集成生命信息的集成 20世紀生命科學(xué)的兩大成就世紀生命科學(xué)的兩大成就 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 解旋酶解鏈酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNA 解旋解鏈 合

2、成引物 子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 3 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 l1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變 性，與合適引物雜交，

3、用DNA聚合酶 延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可 克隆tRNA基因。 l但由于測序和引物合成的困難，以 及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克 隆基因成為可能，所以，Khorana的 設(shè)想被人們遺忘了 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 l1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） l基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制 l最初采用E-coli DNA聚合酶進行PCR，由于該酶 不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯 l耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行， 隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循 環(huán)儀 l1993年，

4、Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎 體外高效、快速、特異高效、快速、特異地擴增目的基因或DNA 片段的技術(shù)技術(shù)。 其原理類似于其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試的體內(nèi)復(fù)制，只是在試 管中給管中給DNA的體外合成提供一種合適條件的體外合成提供一種合適條件 模板模板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適聚合酶，合適 的緩沖液系統(tǒng)和的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度變性、復(fù)性及延伸的溫度 與時間等，使目的與時間等，使目的DNA得以迅速擴增得以迅速擴增 DNA的體內(nèi)復(fù)制：的體內(nèi)復(fù)制： 原料：原料：模板DNA（基因組基因組DNA）， 隨機小分子RNA引物，dNTPs 酶：

5、酶：DNA聚合酶，解旋酶，引發(fā)酶 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，37 反應(yīng)過程：反應(yīng)過程：模板DNA解旋、引發(fā)體的 形成、延長（三階段）（三階段） 產(chǎn)物：產(chǎn)物：模板DNA （基因組基因組DNA）拷 貝數(shù)增加一倍一倍 原料：原料：模板DNA（基因組基因組DNA ，cDNA） 一對特異性特異性寡核苷酸引物，dNTPs 酶：酶：Taq DNA聚合酶 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：合適的緩沖液，三種變化的 溫度（94，50-70，72 ），一定的循環(huán) 數(shù)（25-35） l反應(yīng)過程：反應(yīng)過程：DNA模板變性（解鏈）、 模板與引物退火 、引物延伸 （三階段，（三階段， 多循環(huán)）多循環(huán)） l產(chǎn)物：產(chǎn)物：目的DNA（特

6、異性）（特異性）拷貝數(shù)增加 倍 PCR： 與體內(nèi)DNA解鏈過程不同，PCR中作為模 板的雙鏈DNA是通過95左右的高溫使 其發(fā)生變性，形成單鏈DNA PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時的引 物（primer）,這兩個引物分別與待擴增模板DNA的 目標片段兩端的序列互補。在降低溫度的過程中， 通過控制退火條件，引物就能準確地與擴增區(qū)域 的兩端配對。 primers 引物短短，不易纏繞； 設(shè)計的引物是與模板DNA兩端序列互補； 引物的量遠大于遠大于模板分子的量，引物與模 板DNA形成雙鏈的幾率遠遠高于DNA分子自 身的復(fù)性。 在在PCR反應(yīng)體系中的反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體

7、聚合酶，能夠催化反應(yīng)體 系中游離的單核苷酸（系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物）由引物53方向，方向， 按堿基配對的原則延伸，形成兩條與模板按堿基配對的原則延伸，形成兩條與模板DNA互互 補的復(fù)制鏈。補的復(fù)制鏈。 Taq 酶酶dNTPS l新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板新合成的鏈又可作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。 耐高溫耐高溫: 93下反應(yīng)下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的后其殘留活性是原來的 60%，在，在95下反應(yīng)下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的后其殘留活性是原來的40%。 高度的擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴高度的擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴 增長度增長度(2.0Kb)。 熱變性

8、熱變性-復(fù)性復(fù)性-延伸延伸的過程就是一個PCR循環(huán) 每一循環(huán) 后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴增 DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個循環(huán)后，產(chǎn)量為2n 拷貝。而實際上，PCR的擴增倍數(shù)為（1+X）n，X為 擴增效率，平均為75% 熱變性熱變性-復(fù)性復(fù)性-延伸延伸 25-35 次循環(huán)次循環(huán) 百萬倍擴增百萬倍擴增 盡管PCR擴增DNA非常有效，但目的DNA序列 的指數(shù)擴增并不是一個無限制的過程。 在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶 的催化反應(yīng)趨于飽和，就會出現(xiàn)平臺效應(yīng) (Plateau) ，產(chǎn)物的量不再增加。 “平臺效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、 模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度

9、等多種因素。 PCR原理.flv 1、高度的敏感性 2、高度的特異性 3、操作簡便、快速 4、適用樣品廣泛 1、以DNA為模板的反應(yīng)：已經(jīng)建立了標準的 PCR反應(yīng)條件 成分 濃度 加量（ul） 終濃度 滅菌雙蒸水滅菌雙蒸水 X 10PCR 緩沖液緩沖液 見注見注1 5.0 見注見注2 MgCl 2 25mmol/L 2-8.0 dNTPs 10 mmol/L 1- 2.0 2-400 umol/L 引物引物A 20 umol/L 1-2.0 1umol/L 引物引物B 20 umol/L 1-2.0 1umol/L Taq酶酶 5U/ul 0.25 25U/ml 模板模板 石蠟油石蠟油 50-

10、100 注注1：100mmol/L Tris-HCl pH8.3(250C), 500mmol/L KCl, 注注2：10mmol/L Tris-HCl pH8.3(25oC), 50mmol/L KCl, PCR擴增儀擴增儀 必須具備下列基本條件 1、模板核酸（DNA/RNA） 2、人工合成的寡聚核苷酸引物 3、合適的緩沖體系 4、Mg2 5、脫氧核苷三磷酸 6、耐熱DNA聚合酶 7、溫度循環(huán)參數(shù)（變性、復(fù)性和延伸的溫度與時間 以及循環(huán)數(shù)） 血液血液 陳舊血痕陳舊血痕 組織塊或石蠟包埋組織組織塊或石蠟包埋組織 絨毛絨毛 毛發(fā)毛發(fā) 羊水脫落細胞羊水脫落細胞 尿尿 精斑精斑 咽拭子咽拭子 細菌、

11、病毒、真菌等病原體細菌、病毒、真菌等病原體 考古樣品考古樣品 DNA RNA mRNA cDNA 可以是DNA， 也可以是RNA 用于PCR模板的制備方法多種多樣，標本處 理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標 本中的核酸。 DNA模板的制備相對容易 在制備RNA模板時，要注意防止RNA降解。 細心地進行引物設(shè)計是細心地進行引物設(shè)計是PCR 中最重要的一步。引物決定中最重要的一步。引物決定PCR擴增產(chǎn)擴增產(chǎn) 物的特異性和長度。其設(shè)計與物的特異性和長度。其設(shè)計與PCR反應(yīng)的成敗關(guān)系密切。理想的引物對反應(yīng)的成敗關(guān)系密切。理想的引物對 只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。引物設(shè)計的基本要只同目

12、的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。引物設(shè)計的基本要 求是：求是： （1）引物長度：）引物長度：15-30bp，常用為，常用為20bp左右。左右。 （2）ATGC最好隨機分布，保證引物中最好隨機分布，保證引物中GC比例為比例為50%5%。 （3）避免兩條引物間或引物內(nèi)部互補，特別是）避免兩條引物間或引物內(nèi)部互補，特別是3端的互補。端的互補。 （4）兩引物的）兩引物的Tm值應(yīng)值應(yīng)5。 （5）引物與非特異擴增區(qū)序列的同源性）引物與非特異擴增區(qū)序列的同源性70%，特別是，特別是3端的端的8個堿基。個堿基。 （6）3端一定要與模板端一定要與模板DNA配對，其末尾最佳堿基應(yīng)選擇配對，其末尾最佳堿基應(yīng)選

13、擇G和和C。 （7）5端最多可游離十幾個堿基，可以修飾（如加限制酶位點、引入突變端最多可游離十幾個堿基，可以修飾（如加限制酶位點、引入突變 位點、作標記、加短序列起始或終止密碼子等）。位點、作標記、加短序列起始或終止密碼子等）。 檢測目的檢測目的DNA序列看是否有錯配區(qū)域，計算機程序分析可以幫助避序列看是否有錯配區(qū)域，計算機程序分析可以幫助避 免使用設(shè)計不合理的引物對。免使用設(shè)計不合理的引物對。 （1）當在引物）當在引物5端添加酶切位點時要考慮：端添加酶切位點時要考慮： a)該目的序列內(nèi)部不得含有相同的酶切位點 ；在 引物發(fā)出后才發(fā)現(xiàn)錯誤的事情本人就干過，在論 壇上也能看到這樣的粗心人。這樣的

14、錯誤會給將 來的克隆造成麻煩。 b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點 的外側(cè)再加上保護堿基，不同的酶對于保護堿基 的要求是不同的。如果不設(shè)計保護堿基，則多半 要用TA 克隆的方式連接到質(zhì)粒上，這時要注意Taq 酶的選擇。 （2）加入其它序列時：若想在目的序列上附 加上并不存在的序列，如限制位點和啟動 子序列，可以加入到引物5端而不影響特異 性。當計算引物Tm 值時并不包括這些序列， 但是應(yīng)該對其進行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu) 的檢測。 （3）有時候，對于引物設(shè)計僅了解有限的序列信息。 比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計兼并引 物。 兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同 堿基可能性的

15、不同序列的混合物。為了增加特異 性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿 基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有 的堿基配對，降低引物的退火溫度。特別要注意 的是：不要在引物的3端使用兼并堿基，因為3端 最后3 個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。 （4）PCR時的引物濃度：引物的濃度會影響 特異性。最佳的引物濃度一般在0.1 到 0.5M。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn) 物擴增、生成引物二聚體，使目的DNA片段 產(chǎn)率下降。 3、耐熱、耐熱DNA聚合酶聚合酶 （ Taq酶）酶） 催化一典型的催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為指總反應(yīng)體積為 100ul時時

16、)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低 則合成產(chǎn)物量減少。則合成產(chǎn)物量減少。 1. 具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，末端加具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，末端加A 2. 具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活性，而外切酶活性，而 無無35外切活性，它不具有外切活性，它不具有Klenow酶的酶的35 校對活性校對活性.引入突變（引入突變（ 0.25%） 35外切活性外切活性 校對校對 保真保真 dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的總稱， 是靶DNA 序列擴增的原料。dNTP 的穩(wěn)定 性研究表明，在50次循環(huán)中，50%的 dNTP是穩(wěn)定的。dNTP濃度根

17、據(jù)靶序列的 長度和組成而定，一般使用濃度在20- 200umol/L之間 常用的緩沖液體系為10-50mmol/LTris-HCl （pH8.3-8.8,20） PCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的 磷酸基團均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實 際濃度。而TaqDNA聚合酶需要的是游離 Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比 dNTP濃度高0.5-2.5mmol/L。 如前述 主要取決于模板DNA的濃度。 理論上25次循環(huán)后要PCR產(chǎn)物的積累達最大 實際因每步反應(yīng)不可能達100%效率，一般 以75%計算，因此30次是比較合理的循環(huán) 次數(shù) 循環(huán)次數(shù)太少產(chǎn)物量不夠；次數(shù)太多則非特 異性

18、產(chǎn)物增多 1、高溫啟動、高溫啟動 2、抑制劑（、抑制劑（inhibitor）與促進劑）與促進劑(enhancer) 3、易發(fā)生的問題及解決方法、易發(fā)生的問題及解決方法 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢 測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。 凝膠電泳分析凝膠電泳分析:PCR產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物電泳，EB（溴乙錠）染色紫外儀（溴乙錠）染色紫外儀 下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。(瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳/聚聚 丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺凝膠電泳 ) 酶切分析：根據(jù)酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相 應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲

19、得符合理論的片段，此法既應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既 能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異 性研究。性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)， 也是檢測產(chǎn)物堿基突變的有效方法。也是檢測產(chǎn)物堿基突變的有效方法。(Southern印跡雜印跡雜 交交/斑點雜交斑點雜交 ) 核酸序列分析：是檢測核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。產(chǎn)物特異性的最可靠方法。 M 1 2 正常結(jié)果：正常結(jié)果： Detecting Products: 出現(xiàn)的PCR擴增

20、條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條 帶更整齊，亮度更高。 引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有 同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的 性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重 新設(shè)計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因： 一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假 陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列 吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外， 所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均 應(yīng)一次性使用。必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外 線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片

21、段核酸污染， 這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?， 與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可 用巢式PCR方法來減輕或消除。 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物 的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及， PCR循環(huán)條件。尋 找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑 制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中 的組蛋白，在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。 模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn) 擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過 程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其 程序亦應(yīng) 固

22、定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析 是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是 有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是 否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散 的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩 條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不 對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單 位。 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做 瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩 引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一 條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物 合成單位協(xié)商解決。如一條引物

23、亮度高，一條亮度 低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度 小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部 分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理， 如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過 高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚 至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、 50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨 床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積 時，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變

24、性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變 性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異 性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模 板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計， 檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也 是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特 異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列， 其PCR擴增是不會成功的。 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致， 或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性 擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物 與靶序列不完全互補、 或引

25、物聚合形成二聚體。二 是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán) 次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源 的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)， 酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有： 必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的 酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。 適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性， 65左右退火與延伸)。 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯 樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì) 量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退 火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策 有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。 減少dNTP的濃

26、度。適當降低Mg2+濃 度。增 加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 非特異擴增非特異擴增 或或 產(chǎn)物呈片狀產(chǎn)物呈片狀 1 3 2 M 無產(chǎn)物無產(chǎn)物 或或 有引物二聚體有引物二聚體 1 2 M 3 反向PCR 錨定PCR 不對稱PCR 原位PCR RT-PCR 重組PCR 差異顯示PCR免疫PCR 實時定量PCR多重PCR 逆轉(zhuǎn)錄酶 聚合酶 mRNAmRNA cDNAcDNA 雜化雙鏈雜化雙鏈 PCR擴增 實時定量PCR(real-time PCR): 通過特定設(shè)計的PCR儀器來實時檢測PCR擴 增過程每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量，可以 很好的推算模板的起始濃度，這種工作方 式稱為實時定量PCR。 實時熒光定

27、量PCR: 實時定量PCR在檢測過程中通過檢測標記的 熒光信號的累積來實時監(jiān)測整個PCR進程， 最后通過標準曲線對未知模板進行定量分 析，故稱為實時熒光定量PCR。 由于熒光探針的引入，顯著提高了實驗的特異 性。探針設(shè)計一般應(yīng)符合以下條件： 探針長度應(yīng)在2040個堿基左右，保證結(jié)合特 異性。 GC堿基含量在40%60%，避免單核苷酸序列的 重復(fù)。 避免與引物發(fā)生雜交或重疊。 探針與模板結(jié)合穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié) 合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值 至少高出5。 另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性， 探針與引物的距離都對實驗結(jié)果有影響。 特 點 FQ-PCR不僅具有普通PC

28、R的高靈敏性， 而且由于熒光探針的應(yīng)用，可以通過光電 傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測PCR擴增過程中熒光信號 的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜 交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確 性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點。FQ-PCR只 須在加樣時打開一次蓋子，其后的過程完 全是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了 常規(guī)PCR操作中的諸多弊端。 1 1 病原體測定病原體測定 由于PCR技術(shù)的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的 進行。但由于其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出 現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性 結(jié)果，但并不能作為診斷依據(jù)，只有當一定數(shù)量的病原體 存在時才有臨床意義，因此經(jīng)模板

29、定量顯得特別重要。常 規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應(yīng)用，然而，PE公司研制 的FQ-PCR技術(shù)給解決這一問題提供了可能。目前該技術(shù)已 經(jīng)應(yīng)用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌和食品中 大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。 Morris等用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型 肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進行了研究。FQ-PCR技 術(shù)在保持巢式PCR高度敏感性的同時又能提高效率，因此 可作為一種檢測HCV的有效方法。同時，由于FQ-PCR可以 測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供 參考依據(jù)。 以前常規(guī)檢測大腸桿菌的方法，都因為繁瑣， 需要大量的PCR后處理過程及不能對

30、標本定量而受 到限制。美國Witham等1996年將FQ-PCR技術(shù)應(yīng)用 于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測研究。 針對不同血清變異型的大腸桿菌，他們設(shè)計應(yīng)用 不同的探針，從而提高了實驗特異性。他們同時 還對探針相對于引物的位置、反應(yīng)液中探針濃度、 鎂離子濃度等影響實驗的因素進行了優(yōu)化實驗， 以提高實驗的準確性和精確性。由于TaqMan系統(tǒng) 可以一次測量96管樣品，還可對模板進行準確定 量，又不需要進行電泳及EB染色后處理過程，實 際應(yīng)用方便，從而提高了實驗的參考價值和應(yīng)用 價值。因此該實驗方法是食品檢測方面的一個突 破。 2. 2. 腫瘤研究腫瘤研究 意大利Gelmini等用FQ-PCR技

31、術(shù)檢測乳腺癌標本c-erbB-2 基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以-肌動蛋白基因為參照 探索最佳實驗條件，當擴增循環(huán)數(shù)在2831之間時，RQ 與模板DNA有著較好的劑量依賴關(guān)系。他們在此條件下擴 增了c-erbB-2基因和-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)RQ都與各自 的模板DNA濃度存在著線性關(guān)系，雖然二者斜率不同，但 是各個實驗濃度下二者的RQ之比卻是恒定的。說明盡管 二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。他們將實驗數(shù)據(jù) 與Southern印跡結(jié)果和已報告的競爭性PCR結(jié)果比較都顯 示高度相關(guān)性（n=25，r=0.94，P0.01）。 3. 3. 基因表達研究基因表達研究 由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應(yīng)用，

32、對mRNA的檢測顯得較 以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、 快速、準確得多。為了探測骨髓基質(zhì)血小板生成因子 （TPO）在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因 子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血 （AA）和特發(fā)性血小板多癥（ET）等疾病過程中的病理生 理意義，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒在 ABI7700反應(yīng)系統(tǒng)測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓 基質(zhì)細胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法測定了骨髓和末 梢血的TPO濃度。結(jié)果顯示ITP和AA病人TPO mRNA水平明顯 升高，而ET病人的TPO

33、mRNA水平則正常，經(jīng)類固醇治療后 ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其 mRNA水 平有相關(guān)性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表達水平與 巨核細胞計數(shù)也有相關(guān)性。這個實驗對闡明TPO 的作用提 供了依據(jù)。 4. 4. 免疫組份分析免疫組份分析 對免疫對免疫T T細胞群體細胞群體V-V-組份進行分析是研究健康和疾病組份進行分析是研究健康和疾病 免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要手段，可通過流式細胞法或免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要手段，可通過流式細胞法或RFQ-PCRRFQ-PCR 法來進行。法來進行。19971997年年LangLang等用等用FQ-PCRFQ-PCR技術(shù)進行實驗，他們在技術(shù)進行實驗，他們在 反應(yīng)系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與