基因工程步驟

1、基因工程步驟 一、學習目標一、學習目標 簡述基因工程原理及基本操作過程簡述基因工程原理及基本操作過程 二、學習重點和難點二、學習重點和難點 1 1、基因工程基本操作程序的四個步驟（重點）、基因工程基本操作程序的四個步驟（重點） 2 2、從基因文庫中獲取目的基因（難點）、從基因文庫中獲取目的基因（難點） 3 3、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因（難點）技術擴增目的基因（難點） 1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程步驟 啟動子啟動子終止子終止子 基因工程步驟 非編碼區(qū)非編碼區(qū) 非編碼區(qū)非編碼區(qū) 編碼區(qū)編碼區(qū) 與與RNARNA聚合酶聚合酶 結合位點結合位點 外顯子

2、外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子 1 12 23 34 45 5 轉轉 錄錄 mRNAmRNA前體前體 成熟成熟mRNAmRNA 加加 工工 切除內(nèi)含子轉錄部分切除內(nèi)含子轉錄部分 基因工程步驟 原核細胞的基因結構原核細胞的基因結構 非編碼區(qū)非編碼區(qū) 非編碼區(qū)非編碼區(qū) 編碼區(qū)編碼區(qū) 編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點 啟動子啟動子 終止子終止子 能轉錄相應的信使能轉錄相應的信使RNARNA，能編碼蛋白質(zhì)，能編碼蛋白質(zhì) 基因工程步驟 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 目的基因的獲取 基因表達載體的構建 將目的基因?qū)胧荏w細胞 目的基因的檢測與鑒定

3、 基因工程步驟 一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取 用用3 3分鐘閱讀分鐘閱讀P8-11P8-11，并思考下列問題，然后用，并思考下列問題，然后用 2 2分鐘與同桌交流、討論。分鐘與同桌交流、討論。 1 1、獲取目的基因的常用方法有哪些、獲取目的基因的常用方法有哪些? ? 2 2、何謂基因文庫？其類型有哪幾種？、何謂基因文庫？其類型有哪幾種？ 3 3、如何構建基因文庫？、如何構建基因文庫？ 4 4、何謂、何謂PCRPCR技術？其原理、條件和過程是怎樣的？技術？其原理、條件和過程是怎樣的？ 基因工程步驟 一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取 基因工程步驟 3 3、基因文庫、基因文庫 又稱又稱D

4、NADNA文庫，將含有某種生物不同基因的許多文庫，將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片段，片段， 導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不 同的基因，所有受體菌的集合即為該生物的基因文庫。同的基因，所有受體菌的集合即為該生物的基因文庫。 基因文庫由基因文庫由外源外源DNADNA片段、載體片段、載體和和宿主宿主組成。組成。 按外源按外源DNADNA片段的來源分基因文庫分為：片段的來源分基因文庫分為： 基因組基因組DNADNA文庫：包含了某物種的所有的基因文庫：包含了某物種的所有的基因 部分基因文庫：只包含了部分基因文庫（如

5、部分基因文庫：只包含了部分基因文庫（如cDNAcDNA文庫）文庫） 基因工程步驟 基因工程步驟 1 1）載體）載體DNADNA片段的制備片段的制備 DNADNA分離純化分離純化限制酶切限制酶切 2 2）供體）供體DNADNA片段的制備片段的制備 總總DNADNA分離純化分離純化酶切法酶切法分離特定大小分離特定大小DNADNA片段片段 3 3）載體與基因組）載體與基因組DNADNA片段的連接片段的連接 4 4）重組）重組DNADNA轉化受體細胞轉化受體細胞 4.4.基因文庫的構建基因文庫的構建 基因工程步驟 基因組文庫的構建基因組文庫的構建 通過對受體菌通過對受體菌 的培養(yǎng)而儲存的培養(yǎng)而儲存 基

6、因基因 基因工程步驟 cDNAcDNA文庫的構建文庫的構建 （反轉錄法）反轉錄法） 目的基因的目的基因的mRNAmRNA 單鏈單鏈DNADNA 反轉錄酶反轉錄酶 DNADNA聚合酶聚合酶 雙鏈雙鏈DNA(DNA(目的基因目的基因) ) 接到載體接到載體 基因工程步驟 小小大大 無無有有 無無 有有 某種生物的部分基因某種生物的部分基因 某種生物的全部基因某種生物的全部基因 可以可以 部分基因可以部分基因可以 基因工程步驟 思考：思考：怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基 因？因？ 根據(jù)基因的有關信息如根據(jù)基因的有關信息如根據(jù)基因的轉錄根據(jù)基因的轉錄 產(chǎn)物產(chǎn)物

7、mRNAmRNA、基因的核苷酸序列、基因翻譯產(chǎn)、基因的核苷酸序列、基因翻譯產(chǎn) 物蛋白質(zhì)物蛋白質(zhì)等來獲取目的基因。等來獲取目的基因。 基因工程步驟 2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因 PCRPCR 基因工程步驟 概念概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項在生物，是一項在生物 _復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件：條件：_ _ _、 _ _ 、 _ 原理：原理：_ 方式：方式：以以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循環(huán)的次數(shù)）為擴增循環(huán)的次數(shù)） 結果：結果： 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應 體外體外 特定特定DNADNA片段片段 DNADNA雙鏈復制雙

8、鏈復制 已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列( (前提條件前提條件) ) 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 成對引物成對引物 DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶） 指數(shù)指數(shù)2 2n n 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬 倍地擴增倍地擴增 基因工程步驟 過程：過程： a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_ b b、退火（、退火（復性復性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部_

9、。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下， 合成與模板互補的合成與模板互補的_。 氫鍵氫鍵 單鏈單鏈DNADNA 雙鏈雙鏈 DNADNA鏈鏈 基因工程步驟 PCRPCR的基本反應步驟的基本反應步驟 變性變性 90-9590-95C C 延伸延伸 70-7570-75C C 退火退火 55-6055-60C C PCRPCR總結：總結： 基因工程步驟 基因比較小基因比較小, ,已知核苷酸序列，直接利已知核苷酸序列，直接利 用用DNADNA合成儀用化學方法合成，不需要模板。合成儀用化學方法合成，不需要模板。 基因工程步驟 從基因文庫中獲取從基因文

10、庫中獲取 利用利用PCRPCR技術擴增技術擴增 利用化學方法人工合成利用化學方法人工合成 歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法 基因工程步驟 二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建 核心核心 基因工程步驟 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子 一個切口一個切口 兩個黏性末端兩個黏性末端 兩個切口兩個切口 獲得目的基因獲得目的基因 DNA DNA 連接酶連接酶 重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒） 同一種同一種 限制酶限制酶 1 1、基因表達載體的構建方法、基因表達載體的構建方法 基因工程步驟 2.2.基因表達載體的目的基因表達載體的目的 （1 1）使目的基因在受體細胞

11、中穩(wěn)定存在）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在 并可以遺傳給下一代并可以遺傳給下一代 （2 2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 基因工程步驟 b b、 思考：它們有什么作用？ 基因工程步驟 表達載體為什么一定要有啟動子？表達載體為什么一定要有啟動子？ （1 1）生物之間進行基因交流，只有使）生物之間進行基因交流，只有使 用受體生物自身基因的啟動子才能有用受體生物自身基因的啟動子才能有 利于基因的表達。利于基因的表達。 （2 2）通過）通過cDNAcDNA文庫獲得的目的基因沒文庫獲得的目的基因沒 有啟動子，只將編碼序列導入受體細有啟動子，只將編碼序列導入受體細 胞無法

12、轉錄。胞無法轉錄。 基因工程步驟 終止子的作用是什么？終止子的作用是什么？ 終止子是位于基因尾端的一段特殊終止子是位于基因尾端的一段特殊 的的DNADNA片斷，能終止片斷，能終止mRNAmRNA的轉錄。的轉錄。 是為了鑒別受體細胞中是否含有目是為了鑒別受體細胞中是否含有目 的基因，從而將有目的基因的細胞篩選的基因，從而將有目的基因的細胞篩選 出來。出來。 標記基因有什么作用？標記基因有什么作用？ 基因工程步驟 三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞 2 2、方法、方法 將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)?植物細胞植物細胞 將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)?動物細胞動物細胞 將目的基因?qū)雽?/p>

13、目的基因?qū)?微生物細胞微生物細胞 農(nóng)桿菌轉化法農(nóng)桿菌轉化法 基因槍法基因槍法 花粉管通道法花粉管通道法 顯微注射法顯微注射法 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 基因工程步驟 （1）農(nóng)桿菌轉化法 特點：特點： 易感染雙子葉植物和裸子植物，易感染雙子葉植物和裸子植物， 對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能 力力 原理：原理： TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA可以轉移到受體細胞，并整可以轉移到受體細胞，并整 合到受體細胞染色體的合到受體細胞染色體的DNADNA上。上。 基因工程步驟 轉化過程: TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒 目的基因目的基因 構建 表 達 載 體 導入 植 物 細 胞 插入

14、植物細胞 染色DNA 表達 新 性 狀 轉入 農(nóng) 桿 菌 基因工程步驟 基因槍法又稱微彈轟基因槍法又稱微彈轟 擊法，是擊法，是利用壓縮氣體利用壓縮氣體 產(chǎn)生的動力產(chǎn)生的動力，將包裹在，將包裹在 金屬顆粒表面的表達載金屬顆粒表面的表達載 體體DNADNA打入受體細胞中打入受體細胞中， 使目的基因與其整合并使目的基因與其整合并 表達的方法。表達的方法。 （2）基因槍法 基因工程步驟 （3）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌植物花粉在柱頭上萌 發(fā)后，花粉管要穿過花柱發(fā)后，花粉管要穿過花柱 直通胚囊。花粉管通道法直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪?就是在植物受粉后，花粉就是在植物受粉后，花粉 形成的花粉管還未愈合前，

15、形成的花粉管還未愈合前， 剪去柱頭，然后，滴加剪去柱頭，然后，滴加 DNADNA（含目的基因），使（含目的基因），使 目的基因借助花粉管通道目的基因借助花粉管通道 進入受體細胞。進入受體細胞。 基因工程步驟 胚珠 花藥 花絲 柱頭 花柱 子房壁 子房 雄 蕊 雌 蕊 基因工程步驟 2 2、將目的基因?qū)雱游锛毎⒛康幕驅(qū)雱游锛毎?目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物 基因工程步驟 微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因： 繁殖快、多為單細胞、繁殖快、多為單細胞、 遺傳物質(zhì)相對少遺傳物質(zhì)相對少 過程

16、：過程： CaCa2+ 2+處理大 處理大 腸桿菌腸桿菌 感受態(tài)感受態(tài) 細胞細胞 表達載體表達載體 與感受態(tài)與感受態(tài) 細胞混合細胞混合 感受態(tài)感受態(tài) 細胞吸細胞吸 收收DNADNA 3.3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎?基因工程步驟 四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定 分子水平檢測分子水平檢測: : 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否轉錄是否轉錄 是否翻譯是否翻譯 個體生物學水平鑒定個體生物學水平鑒定 基因工程步驟 1 1、檢測轉基因生物染色體的、檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入 了目的基因了目的基因 首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基因生物的基因組DNADNA； （1 1）方法）方法: :DNADNA分子雜交分子雜交 （2 2）過程）過程: : 將含目的基因的將含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等 作標記作標記, ,以此做探針；以此做探針； 使探針和轉基因生物的基因組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交, ,若顯示若顯示 出雜交帶出雜交帶, ,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNAD