酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤課件

1、酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤1 酶的生產(chǎn)與分離純化酶的生產(chǎn)與分離純化 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤2 組織提取組織提取 發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn) 化學(xué)及生物合成化學(xué)及生物合成 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤3 集中壟斷，市場(chǎng)全球化集中壟斷，市場(chǎng)全球化： 丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）美國杰能科 （Genencor）、芬蘭科特和丹麥丹尼斯克 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤4 國際以液體、顆粒為主。 國內(nèi)糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶三大類 重要產(chǎn)品系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內(nèi)尚 未投入生產(chǎn); 我國7家。 應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大 食品工業(yè)占62% 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤5 酶的發(fā)酵生產(chǎn)：酶的發(fā)酵生產(chǎn)： 經(jīng)過預(yù)先

2、設(shè)計(jì)，通過人工操作控制，利用經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操作控制，利用 細(xì)胞的生命活動(dòng)，產(chǎn)生人們所需要酶的過細(xì)胞的生命活動(dòng)，產(chǎn)生人們所需要酶的過 程程 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤6 能用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞需能用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞需具備如下幾個(gè)具備如下幾個(gè) 條件條件： （1）產(chǎn)酶量高）產(chǎn)酶量高 （2）容易培養(yǎng)和管理）容易培養(yǎng)和管理 （3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好 （4）利于酶的分離純化）利于酶的分離純化 （5）安全可靠）安全可靠 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤7 為什么利用微生物產(chǎn)酶？為什么利用微生物產(chǎn)酶？ (1) 種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。 (2) 生

3、長繁殖快，易提取酶生長繁殖快，易提取酶. (3) 培養(yǎng)基來源廣泛、價(jià)格便宜。培養(yǎng)基來源廣泛、價(jià)格便宜。 (4) 微電腦，連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。微電腦，連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。 (5) 利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)， 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤8 產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量、發(fā)酵條件、工藝。產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量、發(fā)酵條件、工藝。 主要包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。主要包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤9 （1）枯草芽孢桿菌）枯草芽孢桿菌 細(xì)菌屬細(xì)菌屬 菌落粗糙，不透明菌落粗糙，不透明 生產(chǎn)生產(chǎn)-淀粉酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖

4、酶，堿性磷酸葡聚糖酶，堿性磷酸 酶等。酶等。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤10 （2） 大腸桿菌大腸桿菌 陰性，無芽孢陰性，無芽孢 菌落光滑菌落光滑 用于谷氨酸脫羧酶，天用于谷氨酸脫羧酶，天 門冬氨酸酶等門冬氨酸酶等胞內(nèi)酶胞內(nèi)酶 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤11 （3）黑曲霉）黑曲霉 屬于真菌屬屬于真菌屬 糖化酶、淀粉酶、酸糖化酶、淀粉酶、酸 性蛋白酶、果膠酶等。性蛋白酶、果膠酶等。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤12 （4） 米曲霉米曲霉 糖化酶、蛋白酶糖化酶、蛋白酶 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤13 （5）根霉）根霉 主要用于糖化酶、淀主要用于糖化酶、淀 粉酶、轉(zhuǎn)化酶等生產(chǎn)粉酶、轉(zhuǎn)化酶等生產(chǎn) 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤

5、14 （6）毛霉）毛霉 蛋白酶、糖化酶、淀蛋白酶、糖化酶、淀 粉酶、脂肪酶等。粉酶、脂肪酶等。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤15 （7）鏈霉菌）鏈霉菌 葡萄糖異構(gòu)酶、青葡萄糖異構(gòu)酶、青 霉素?；?、纖維霉素?；?、纖維 素酶、幾丁質(zhì)酶等素酶、幾丁質(zhì)酶等 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤16 （8）啤酒酵母）啤酒酵母 轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶 丙酮酸脫羧酶丙酮酸脫羧酶 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤17 產(chǎn)酶菌株的選育產(chǎn)酶菌株的選育 主要依據(jù)主要依據(jù)酶催化的反應(yīng)性質(zhì)酶催化的反應(yīng)性質(zhì)、作用底物的特異作用底物的特異 性性、底物和產(chǎn)物的特性底物和產(chǎn)物的特性以及以及酶在細(xì)胞中所處的位酶在細(xì)胞中所處的位 置置。 胞外酶胞外酶：菌落周圍的：菌

6、落周圍的透明圈、顏色變化來篩選透明圈、顏色變化來篩選。 胞內(nèi)酶胞內(nèi)酶：若酶作用底物分子量小可透過細(xì)胞膜，：若酶作用底物分子量小可透過細(xì)胞膜， 將酶反應(yīng)的產(chǎn)物作為底物，加在培養(yǎng)基中，根據(jù)將酶反應(yīng)的產(chǎn)物作為底物，加在培養(yǎng)基中，根據(jù) 菌落顏色變化菌落顏色變化。 而多數(shù)胞內(nèi)酶產(chǎn)生菌的篩選：細(xì)胞破碎物做酶源，而多數(shù)胞內(nèi)酶產(chǎn)生菌的篩選：細(xì)胞破碎物做酶源， 經(jīng)酶反應(yīng)后，根據(jù)經(jīng)酶反應(yīng)后，根據(jù)酶反應(yīng)產(chǎn)物的特點(diǎn)來篩選酶反應(yīng)產(chǎn)物的特點(diǎn)來篩選（輔（輔 酶酶NADNAD）。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤18 選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)培養(yǎng)基設(shè)計(jì) 選擇合適的發(fā)酵方式選擇合適的發(fā)酵方式 發(fā)酵過程

7、的各種參數(shù)控制發(fā)酵過程的各種參數(shù)控制 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤19 保藏細(xì)胞保藏細(xì)胞 細(xì)胞活化細(xì)胞活化 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)原生質(zhì)體原生質(zhì)體固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng) 發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵 分離純化分離純化 酶酶 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤20 主要是碳源、氮源，其次是無機(jī)鹽、生長因子主要是碳源、氮源，其次是無機(jī)鹽、生長因子 和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤21 （1）碳源）碳源 當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能 利用利用有機(jī)碳有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。的異養(yǎng)型微生物。 吃點(diǎn)啥？吃點(diǎn)啥？ 酶的生產(chǎn)與分離純

8、化瑤瑤22 有機(jī)碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中有機(jī)碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中 二是野生的原料二是野生的原料 以石油產(chǎn)品中以石油產(chǎn)品中1216碳的成分碳的成分 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤23 考慮考慮營養(yǎng)要求營養(yǎng)要求、誘導(dǎo)作用誘導(dǎo)作用、分解代謝分解代謝 物阻遏作用物阻遏作用。 淀粉酶生產(chǎn)用淀粉酶生產(chǎn)用淀粉淀粉不用不用果糖果糖 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤24 （2）氮源）氮源 有機(jī)氮源和無機(jī)氮源有機(jī)氮源和無機(jī)氮源 一般來說，動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、一般來說，動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、 異養(yǎng)型微生物、自養(yǎng)型微生物。異養(yǎng)型微生物、自養(yǎng)型微生物。 有機(jī)氮源和無機(jī)氮源配合有機(jī)氮源和無機(jī)氮源配合 我有我要求我有我要求 酶

9、的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤25 只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量?jī)H為有胨時(shí)只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量?jī)H為有胨時(shí) 的的30% 只用有機(jī)氮源而不用無機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低只用有機(jī)氮源而不用無機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低 使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%3%的無機(jī)氮的無機(jī)氮 源。源。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤26 （3） 碳氮比碳氮比 一般蛋白酶 (包括酸性、中性和堿性蛋白 酶)低; 淀粉酶(包括淀粉酶、糖化酶、淀 粉酶等) 高, 在糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮 比是最高的。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤27 （4） 無機(jī)鹽無機(jī)鹽 常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽 作

10、為作為磷源磷源，以硫酸鎂為硫源和，以硫酸鎂為硫源和鎂源鎂源。 鈣鈣 灰色鏈霉菌中性蛋白酶灰色鏈霉菌中性蛋白酶 pH77.5 pH57。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤28 鈉離子鈉離子 控制細(xì)胞滲透壓酶產(chǎn)量增加，以磷酸氫二鈉及控制細(xì)胞滲透壓酶產(chǎn)量增加，以磷酸氫二鈉及 硝酸鈉等形式，例如米曲霉硝酸鈉等形式，例如米曲霉淀粉酶淀粉酶 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤29 （5）生長因子）生長因子 微量的物質(zhì)，或生長素。微量的物質(zhì)，或生長素。 某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶。某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶。 有你才有你才 健康！健康！ 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤30 （6） 產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑 產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑 一是

11、誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑能表面活性劑能 增加細(xì)胞的通透性，改善氧的傳遞速度，保護(hù)增加細(xì)胞的通透性，改善氧的傳遞速度，保護(hù) 酶的活性。酶的活性。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤31 發(fā)酵方式的選擇發(fā)酵方式的選擇 固態(tài)發(fā)酵法固態(tài)發(fā)酵法 液體深層發(fā)酵法液體深層發(fā)酵法 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤32 一般來說，培養(yǎng)基成分中碳一般來說，培養(yǎng)基成分中碳/氮氮(C/N)比高，比高， 發(fā)酵液，發(fā)酵液，pH低；低；C/N低，低，pH高。高。 添加緩沖液；調(diào)節(jié)通風(fēng)量添加緩沖液；調(diào)節(jié)通風(fēng)量.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初 始始pH；pH過高糖或淀粉來調(diào)節(jié)，過高糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低氮過低氮

12、 調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤33 一般細(xì)菌為一般細(xì)菌為37 ，霉菌和放線菌為，霉菌和放線菌為2830 ，而生，而生 產(chǎn)糖化酶的最適溫度為產(chǎn)糖化酶的最適溫度為3740 。 微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度 發(fā)酵初期發(fā)酵初期 菌體繁殖旺盛時(shí)菌體繁殖旺盛時(shí) 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤34 溶解氧而定。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生溶解氧而定。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生 物都為好氣性微生物，采用自動(dòng)測(cè)定和記物都為好氣性微生物，采用自動(dòng)測(cè)定和記 錄溶解氧的儀表。錄溶解氧的儀表。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤35 有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)

13、與菌體均勻接觸， 提高新陳代謝。打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成提高新陳代謝。打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成 湍流，提高溶氧量，增加空氣利用。湍流，提高溶氧量，增加空氣利用。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤36 泡沫阻礙了泡沫阻礙了CO2的排除，影響溶氧量的排除，影響溶氧量 機(jī)械消泡，消泡劑機(jī)械消泡，消泡劑 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤37 1、-淀粉酶的生產(chǎn)淀粉酶的生產(chǎn) 生產(chǎn)菌種：細(xì)菌和曲霉，如枯草芽孢桿菌、生產(chǎn)菌種：細(xì)菌和曲霉，如枯草芽孢桿菌、 黑曲霉等。黑曲霉等。 發(fā)酵方法：霉菌，固體曲法；細(xì)菌，液體發(fā)酵方法：霉菌，固體曲法；細(xì)菌，液體 深層發(fā)酵。深層發(fā)酵。 回收方法：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀和淀粉吸回收方法：鹽析、

14、有機(jī)溶劑沉淀和淀粉吸 附等。附等。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤38 2、果膠酶的生產(chǎn)、果膠酶的生產(chǎn) 生產(chǎn)菌種：真菌如曲霉菌、青霉菌，細(xì)菌生產(chǎn)菌種：真菌如曲霉菌、青霉菌，細(xì)菌 如枯草芽孢桿菌、歐氏桿菌。如枯草芽孢桿菌、歐氏桿菌。 發(fā)酵：固體曲法和液體深層發(fā)酵發(fā)酵：固體曲法和液體深層發(fā)酵 回收：水提后加入乙醇沉淀?；厥眨核岷蠹尤胍掖汲恋?。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤39 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤40 酶的純化酶的純化 特定的一種酶在細(xì)胞中的含量很少 酶可以通過測(cè)定活力加以跟蹤 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤41 1、可靠和快速的測(cè)活方法；、可靠和快速的測(cè)活方法； 2、酶原料的選擇；、酶原料的選擇； 3、酶的提??；

15、、酶的提??； 4、酶的提純；、酶的提純； 5、酶的純度檢驗(yàn)。、酶的純度檢驗(yàn)。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤42 酶酶 提提 取取 分分 離離 純純 化化 技技 術(shù)術(shù) 路路 線線 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng) 動(dòng)物器官動(dòng)物器官植物組織植物組織 微生物微生物 提取提取 胞內(nèi)酶胞內(nèi)酶胞外酶胞外酶 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 研磨研磨 酶分離純化酶分離純化 離心分離，過濾分離，沉淀分離心分離，過濾分離，沉淀分 離，層析分離，電泳分離，萃離，層析分離，電泳分離，萃 取分離，結(jié)晶分離等。取分離，結(jié)晶分離等。 酶濃縮酶濃縮 酶貯存酶貯存 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤43 機(jī)械破碎機(jī)械破碎 搗碎法搗碎法 研磨法研磨法 勻漿法勻漿法 物理破碎物

16、理破碎 溫度差破碎法溫度差破碎法 壓力差破碎法壓力差破碎法 超聲波破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎化學(xué)破碎 有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑： 甲苯、丙酮甲苯、丙酮 丁醇、氯仿丁醇、氯仿 表面活性劑：表面活性劑： Triton、Tween 酶促破碎酶促破碎 自溶法自溶法 外加酶制劑法外加酶制劑法 通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切 力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。 使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破 壞壞 對(duì)細(xì)胞膜的作用對(duì)細(xì)胞膜的作用 通過細(xì)胞本身的酶系或外通過細(xì)胞本身的酶系或外 加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使 細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞， 細(xì)胞

17、破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤44 (1) 機(jī)械 (勻漿) 法 (2) 超聲波法 處理的主要問題是超聲空穴局部過熱引 起酶活性喪失，時(shí)間應(yīng)盡可能短，容器 周圍以冰浴冷卻處理。 生物組織的破 碎 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤45 (3) 凍融法 生物組織冰凍后，胞液結(jié)成冰晶，使 細(xì)胞壁脹破。 加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基 磺酰氟)絡(luò)合劑EDTA、還原劑DTT (二硫 蘇糖醇)。 (4) 滲透壓法 (5) 酶消化法 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤46 有機(jī)溶劑處理 表面活性劑處理 與細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細(xì)胞 膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤4

18、7 鹽溶液提取 酸溶液提取 堿溶液提取 有機(jī)溶劑提取 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤48 溫度：一般在00C100C。 pH：在酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH。 緩沖液：0.15mol/L氯化鈉、 0.020.05mol/L磷酸 提取液體積：一般為原料體積的1-5倍。 保護(hù)劑：底物、輔酶、某些抗氧化劑、底物、輔酶、某些抗氧化劑、 表面活性劑表面活性劑等。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤49 酶的主要提取方法酶的主要提取方法 提取方法提取方法使用的溶劑或溶液使用的溶劑或溶液提取對(duì)象提取對(duì)象 鹽溶液提取鹽溶液提取 0.020.020.5mol/L0.5mol/L的的 鹽溶液鹽溶液 在低濃度鹽溶液中溶在低

19、濃度鹽溶液中溶 解度較大的酶解度較大的酶 酸溶液提取酸溶液提取 PH2PH26 6的水溶液的水溶液在稀酸溶液中溶解度在稀酸溶液中溶解度 大，且穩(wěn)定性較好的大，且穩(wěn)定性較好的 酶酶 堿溶液提取堿溶液提取 PH8PH81212的水溶液的水溶液稀堿溶液中溶解度大稀堿溶液中溶解度大 且穩(wěn)定性較好的酶且穩(wěn)定性較好的酶 有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取 可與水混溶的有機(jī)可與水混溶的有機(jī) 溶劑溶劑 與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含 有較多非極性基團(tuán)的有較多非極性基團(tuán)的 酶酶 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤50 1 1、沉淀分離、沉淀分離 2 2、離心分離、離心分離 3 3、萃取分離萃取分離 4 4、層析分離、層析分離

20、Go Go Go Go 5 5、電泳分離、電泳分離 Go 6 6、過濾與膜分離過濾與膜分離 Go 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤51 1 1、沉淀分離、沉淀分離 溶解度降低溶解度降低從溶液中沉淀析出沉淀析出 沉淀分離方法沉淀分離方法 分離原理分離原理 鹽析沉淀法鹽析沉淀法 蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同，在酶液中添加一 定濃度的中性鹽 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法 等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn) 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 沉淀法沉淀法 有機(jī)溶劑中的溶解度不同 復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法 在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來， 選擇性變性選擇性變性 沉淀法沉淀法 選擇一定的條件使酶

21、液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影 響所需的酶 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤52 p介電常數(shù)降低介電常數(shù)降低、使酶蛋白脫水酶蛋白脫水 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤53 溫度 pH 離子強(qiáng)度 蛋白質(zhì)濃度 p 常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、乙醇、丙酮、 異丙醇、甲醇等異丙醇、甲醇等 。 必須與水完全混溶; 不與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)； 要有較好的沉淀效應(yīng)； 溶劑蒸汽要無毒，且不易燃。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤54 陰陰 極極 陽陽 極極 pH=pI pHpI 帶正電荷帶正電荷帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷凈電荷為零凈電荷為零 導(dǎo)電率導(dǎo)電率溶解度溶解度滲透壓滲透壓粘度粘度 達(dá)到最低達(dá)到最低 等電點(diǎn)沉淀

22、法等電點(diǎn)沉淀法 原因原因:在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈 電荷為零電荷為零, 顆粒無電荷間的排斥作用顆粒無電荷間的排斥作用,易凝集成大顆粒，易凝集成大顆粒， 因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出。因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出。 電泳分電泳分 離離 沉淀分離沉淀分離 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤55 pH=pI 溶解度最小溶解度最小 等電點(diǎn)沉淀與分離等電點(diǎn)沉淀與分離 大部或全部沉淀下來大部或全部沉淀下來 pHpI 蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)的分離 沉淀出來的蛋白質(zhì)可保持天然構(gòu)象，能再溶解沉淀出來的蛋白質(zhì)可保持天然構(gòu)象，能再溶解 于水并具有生物活性。

23、于水并具有生物活性。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤56 離心分離離心分離 離心力離心力使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離。 顆粒大小、密度和特性的不同顆粒大小、密度和特性的不同 離心的形式離心的形式： p 離心沉降 p 離心過濾 p 離心分離和超離心 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤57 超速離心機(jī)超速離心機(jī)高速離心機(jī)高速離心機(jī) 沉降離心機(jī)沉降離心機(jī) 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤58 萃取分離萃取分離 利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同。兩相中的溶解度不同。兩相一般互互 不相溶不相溶 有機(jī)溶劑萃取有機(jī)溶劑萃取 雙水相萃取雙水相萃取 超臨界萃取超臨界萃取 反膠束萃取反膠束萃取 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤59 常用的溶劑：醇、酮、丁

24、醇、苯酚等。常用的溶劑：醇、酮、丁醇、苯酚等。 萃取條件：萃取條件：00C100C。接觸時(shí)間盡可能短。接觸時(shí)間盡可能短。 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤60 p利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配選擇性分配。 p影響分配的因素：影響分配的因素： 雙水相的性質(zhì)、分離物質(zhì)的性質(zhì)、雙水相的性質(zhì)、分離物質(zhì)的性質(zhì)、 離子性質(zhì)、環(huán)境因素離子性質(zhì)、環(huán)境因素 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤61 利用混合物中各組分的利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使，使 各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，并以不同速各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，并以不同速 度移動(dòng)。度移動(dòng)。 酶的生產(chǎn)與分離

25、純化瑤瑤62 欲分離的混合溶液自柱頂欲分離的混合溶液自柱頂 加入加入 洗脫劑。洗脫劑。 解吸、吸附、再解吸、再解吸、吸附、再解吸、再 吸附吸附 吸附層析 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤63 洗脫劑的選擇洗脫劑的選擇 極性種類有：醇、酮、酚等醇、酮、酚等。 洗脫劑的選擇要注意下列各點(diǎn)：洗脫劑的選擇要注意下列各點(diǎn)： 洗脫劑不會(huì)與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，不會(huì)使吸附劑洗脫劑不會(huì)與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，不會(huì)使吸附劑 溶解；溶解； 洗脫劑對(duì)混合液中的各組分的溶解度大，粘度小，洗脫劑對(duì)混合液中的各組分的溶解度大，粘度小， 流動(dòng)性好流動(dòng)性好 純度純度 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤64 離子交換劑上的可解離基可解離基 團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)

26、各種離團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離 子的親和力不同子的親和力不同 陽離子交換劑陽離子交換劑 陰離子交換劑陰離子交換劑 離子交換層析離子交換層析 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤65 凝膠過濾凝膠過濾 分子篩層析分子篩層析 以各種多孔凝膠為固定 相，利用流動(dòng)相中所含 各種組分的相對(duì)分子質(zhì) 量不同 凝膠層凝膠層 析析 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤66 溶質(zhì)分子的大小 操作方便，不會(huì)使物質(zhì)變性，反復(fù)使用 凝膠層析劑的容量比較低 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤67 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤68 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤69 生物分子與配基之間所具 有的專一而又可

27、逆專一而又可逆的親和 力 酶與底物酶與底物 酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 抗原與抗體抗原與抗體 酶酶RNARNA與互補(bǔ)的與互補(bǔ)的RNARNA分子或分子或 片段片段RNARNA與互補(bǔ)的與互補(bǔ)的DNADNA分子分子 或片段或片段 親和層 析 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤70 根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析 可以分為： 共價(jià)親和層析共價(jià)親和層析 疏水層析疏水層析 金屬離子親和層析金屬離子親和層析免疫親和層析免疫親和層析 染料親和層析染料親和層析 凝集素親和層析凝集素親和層析 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤71 分配層析分配層析 利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同 固定相、流動(dòng)相固定相、流動(dòng)相 在流動(dòng)相

28、的帶動(dòng)流經(jīng)固定相 動(dòng)態(tài)分配。 紙上層析紙上層析 分配薄層層析分配薄層層析 分配氣相層析分配氣相層析 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤72 電泳分離電泳分離 使用的支持體的不同： 薄層電泳薄層電泳 紙層析紙層析 薄膜電泳薄膜電泳 凝膠電泳凝膠電泳 自由電泳自由電泳 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 本身所帶的凈電荷量本身所帶的凈電荷量、顆粒形顆粒形 狀顆粒大小狀顆粒大小、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液溶液 pHpH值值、離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度、支持體的特支持體的特 性性 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤73 過濾與膜分離過濾與膜分離 借助于借助于過濾介質(zhì)，濾紙、濾布、纖維過濾介質(zhì)，濾紙、濾布、纖維 過濾過濾 非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采用各種膜過濾：采用各種高分子膜高分子膜為過濾介質(zhì)為過濾介質(zhì) 酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤74 膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓選擇性地讓小于小于 其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑 的顆粒截留。 膜分離 加壓膜分離加壓膜分離 微濾微濾 超濾超濾 反滲透反滲透 電場(chǎng)膜分離電場(chǎng)膜分離 電滲析電滲析