多肽合成方法

1、多肽合成中肽鍵形成的基本原理一個肽鍵的形成（生成一個二肽），從表面上看是一個簡單的化學(xué)過程，它指兩個 氨基酸組分通過肽鍵（酰胺鍵）連接，同時脫去水。在溫和反應(yīng)條件下，肽鍵的形成是通過活化一個氨基酸（A）的羧基部分，第二個氨基酸（B）則親核進(jìn)攻活化的羧基部分而形成二肽（A- B）。如果羧基組分（A） 的氨基未保護(hù)，肽鍵的形成則不可控制，可能開有成線性肽和環(huán)肽等副產(chǎn)物，與目 標(biāo)化合物A- B混在一起。所以，在多肽合成過程中，對不參與肽鍵形成的所有官 能團(tuán)必須以暫時可逆的方式加以保護(hù)。因此，多肽合成-即每一個肽鍵的形成，包括三個步聚：第一步，需要制備部分保護(hù)的氨基酸，氨基酸的兩性離子結(jié)構(gòu)不再存在；

2、第二步，為形成肽鍵的兩步反應(yīng)，N-保護(hù)氨基酸的羧基必須先活化為活性中間 體，隨后形成肽鍵。這一耦合反應(yīng)既可作為一步反應(yīng)進(jìn)行，也可作為兩個連續(xù)的反 應(yīng)進(jìn)行。第三步，對保護(hù)基進(jìn)行選擇性脫除或全脫除。盡管全部脫除要等到肽鏈全部組裝完 成后才能進(jìn)行，但為了繼？?？續(xù)肽合成，選擇性脫除保護(hù)基也是必需的。由于 10 個氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和 Cys）含有 需要選擇性保護(hù)的側(cè)鏈官能團(tuán)，使肽合成變得更加復(fù)雜。因?yàn)閷x擇性的要求不 同，所以必須區(qū)分臨時性和半永久性保護(hù)基。臨時性保護(hù)基用于下一步要反應(yīng)氨基 酸的氨基或羧基官能團(tuán)的暫時保護(hù)，在不干擾已經(jīng)形成的

3、肽鍵或氨基酸側(cè)鏈的半永 久性保護(hù)基才脫除，有時也在合成過程中脫除。在理想狀態(tài)下，羧基組分的活化和隨后的肽鍵形成（耦合反應(yīng)）應(yīng)為快速反應(yīng)，沒 有消旋或副產(chǎn)物形成，并應(yīng)用等摩爾反應(yīng)物以獲得高產(chǎn)率。但遺憾的是，還沒有一 種能滿足這些要求的化學(xué)耦合方法相比，適用于實(shí)際合成的方法很少。在肽合成過程中，參與多種反應(yīng)的官能團(tuán)常常與一個手性中心相連（甘氨酸是唯一 的例外），存在發(fā)生的消旋的潛在危險。多肽合成循環(huán)的最后一步，保護(hù)基要全部脫除。除了在二肽的合成中需要全脫保護(hù) 以外，選擇性脫除保護(hù)基對于肽鏈延長具有非常重要的意義。合成策略要深思熟慮 地規(guī)劃，依戰(zhàn)略選擇，可以選擇性脫除 Na-氨基保護(hù)基或羧基保護(hù)基。

4、“戰(zhàn)略” 一詞這里是指單個氨基酸的縮合反應(yīng)順序。一般來說，在逐步合成和片段縮合之間 是有區(qū)別的。在溶液中進(jìn)行肽合成（也指“常規(guī)合成”），對困難序列，多數(shù)情況 下，用肽鏈逐步延長法只能合成較短的片段。要合成更長的肽時，目標(biāo)分子必須分 割成合適的片段，并確定在片段縮合過程中，它們能使能C端差向異構(gòu)化程度最小。在單個片段逐步組裝完成后，再連接產(chǎn)生目標(biāo)化合物。肽合成戰(zhàn)術(shù)包括選擇最 恰當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基組合和最佳的片段偶聯(lián)方法。最初的固相多肽合成（SPPS只是肽和蛋白質(zhì)逐步合成法的一種變化，其概念是將 增長的肽鏈連接到一個不溶性的聚合物載體上，由Robert Bruce Merrifield 在1963年首次報

5、道。今天，為紀(jì)念他 1984年獲得諾貝爾獎而稱之為 Merrifield 。在 聚合物載體上，也可以進(jìn)行片段縮合反應(yīng)。多肽合成方法之?；B氮物法早在1902年，Theodor Curtius就將?；B氮物法引入到肽化學(xué)中，因此它是最 古老的縮合方法之一。在堿性水溶液中，除了與?；B氨縮合的游離氨基酸和肽以 外，氨基酸酯可用于有機(jī)溶劑中。與其他許多縮合方法不同的是，它不需要增加輔 助堿或另一等當(dāng)量的氨基組分來捕獲腙酸。長期以來，一直認(rèn)為疊氮物法是唯一不發(fā)生消旋的縮合方法，隨著可選擇性裂解的 氨基酸保護(hù)基引入，該方法經(jīng)歷了一次大規(guī)模的復(fù)興。該方法的起始原料分別是晶 體狀的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通

6、過肼解相應(yīng)的酯很容易得到。在-10C的鹽酸 中，用等當(dāng)量的亞硝酸鈉使酰肼發(fā)生亞硝化而轉(zhuǎn)化為疊氮化物65,依次洗滌、干燥，然后與相應(yīng)的氨基組分反應(yīng)。有些疊氮化物可用冰水稀釋而沉淀出來。二苯磷?；B氮化物(DPPA也可以用于?；B氮化物的合成。Honzl-Rudinger 方法采用亞硝酸叔丁作為亞硝化試劑，并且使疊氮縮合反應(yīng)可在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。 因酰基疊氮化物的熱不穩(wěn)定性，縮合反應(yīng)需在低溫下進(jìn)行。當(dāng)溫度較高時， Curtius重排，即?；B氮轉(zhuǎn)化為異氰酸酯的反應(yīng)成為一個主要的副反應(yīng)，最終導(dǎo) 致生成副產(chǎn)物脲。由于反應(yīng)溫度低(如 4C)而導(dǎo)致反應(yīng)速率相當(dāng)慢，使得肽縮合 反應(yīng)通常需要幾天才能完全。對于較

7、長的N端保護(hù)的肽鏈，酯基的肼解一般比較困難，因此，使用正交的N保護(hù)肼衍生物是一種選擇。在肼基的選擇性脫除后，按倒接(backing-of )策略組合的肽片段可以用于疊氮縮合。如前所述，雖然疊氮法一直被認(rèn)為是消旋化傾向最小的縮合方法，但在反應(yīng)中，過 量的堿會誘發(fā)相當(dāng)大的消旋。因此，在縮合反應(yīng)期間要避免與堿接觸，例如，氨基 組分的銨鹽應(yīng)采用N, N二異丙胺或N烷基嗎啉代替三乙胺來中和。雖然有上述局限性，但該方法仍很重要，尤其對于片段縮合而言，因?yàn)樵摲椒ň哂?較低的異構(gòu)化傾向，適用于羥基未保護(hù)絲氨酸或蘇氨酸組分，同時，N，保護(hù)的本行酰肼還具有多種用途。多肽合成方法之酸酐法在多肽合成中，最初考慮應(yīng)用酸

8、酐要追溯到1881年Theodor Curtius 對苯甲?；被宜岷铣傻脑缙谘芯?。從氨基乙酸銀與苯甲酰氯的反應(yīng)中，除獲得苯甲酰氨基 乙酸外，還得到了 BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾認(rèn)為，當(dāng)用苯甲酰氯處理時，N-苯甲?；被峄騈苯甲酰基肽與苯甲酸形成了活性中間體不對稱酸酐。大約在70年后，Theodor Wieland利用這些發(fā)現(xiàn)將混合酸酐法用于現(xiàn)代多肽合 成。目前，除該方法外，對稱酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子內(nèi)形成的 N羧基內(nèi)酸酐(NCA,Leuchs an hydrides )也用肽縮合。最后應(yīng)該提到，不對稱酸 酐常常參與生化反應(yīng)中的?；磻?yīng)。多肽合成方法之混合酸

9、酐法有機(jī)羧酸和無機(jī)酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，僅有幾個得到了廣泛的實(shí)際應(yīng) 用，多數(shù)情況下，采用氯甲酸烷基酯。過去頻繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被氯 甲酸異丁酯所替代。由羧基組分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反應(yīng)的區(qū)域選擇性依賴依賴于 兩個互相競爭的羰基的親電性和（或）空間位阻。在由N保護(hù)的氨基酸羧酸鹽（羧基組分）和氯甲酸烷基酯（活化組分，例如源于氯甲酸烷基酯）形成混合酸酐時， 親核試劑胺主要進(jìn)攻氨基酸組分的羧基，形成預(yù)期的肽衍生物，并且釋放出游離酸 形式的活性成分。當(dāng)應(yīng)用氯甲酸烷基酯（R1=異丁基、乙基等）時，游離的單烷基 碳酸不穩(wěn)定，立即分解為二氧化碳和相應(yīng)的醇。然而，對于親核進(jìn)攻

10、的區(qū)域選擇 性，也有一些相反的報道，產(chǎn)物為氨基甲酸酯和原來的N保護(hù)氨基酸組分。為了形成混合酸酐，將N保護(hù)的氨基酸或肽分別溶于二氯甲烷、四氫呋喃、二氧六 環(huán)、乙腈、乙酸乙酯或 DMF中，用等當(dāng)量的三級堿（N甲基哌啶、N甲基嗎啉、 N乙基嗎啉等）處理。然后，在一15C 5C,劇烈攪拌的同時加入氯甲酸烷基 酯以形成不對稱酸酐（活化）。經(jīng)短時間活化后，加入親核性氨基酸組分。如果作 為銨鹽使用（需要更多的堿），必須避免堿的過量使用。如果嚴(yán)格按照以上的反應(yīng) 條件，混合酸酐法很容易進(jìn)行，是最有效的縮合方法之一。Benoiton和他的同事對混合酸酐的穩(wěn)定性，減少副產(chǎn)物氨基甲酸酯和消旋等方面 進(jìn)行了深入研究，由

11、此進(jìn)一步了解了反應(yīng)機(jī)理，并提高了該方法的縮合效率，目前 該方法已獲得廣泛應(yīng)用。通過研究過量氨基甲酸酯產(chǎn)生的原因，尤其是在異亮氨酰基和纈氨?；那闆r下，發(fā)現(xiàn)以二氯甲烷為溶劑和N甲基哌啶作為三及堿能防止這一主要副反應(yīng)?；旌纤狒麑λ庥休^高穩(wěn)定性，因此，可以用水洗滌有機(jī)相來純 化混合酸酐。從氯甲酸烷基酯制得的混合酸酐的穩(wěn)定性依賴于使用的烷基。由 Boc-、Z-和Fmoc-的保護(hù)氨基酸和氯甲酸異丙酯制得的混合酸酐能夠被分離純化， 比從氯甲酸乙酯或氯甲酸異丁酯獲得的混合酸酐更穩(wěn)定。當(dāng)沒有合適的親核試劑 時，混合酸酐在有機(jī)溶劑中的分解起始于環(huán)化，生成2烷氧基5 （4H惡唑酮，同時釋放出二氧化碳和醇 R2-

12、OH副產(chǎn)物為對稱酸酐和酯。在混合酸酐縮合法的實(shí)際應(yīng)用中，有以下幾方面需要注意：雖然含水的DMF寸于混合酸酐的形成和隨后的縮合反應(yīng)是一個好的溶劑，但是，正如在Z-Gly-Xaa-OH（Xaa=Ala,Leu,Val,Phe）與H Val-OEt的反應(yīng)中所遇到的，它促進(jìn)消旋的程度比 使用四氫呋喃或鹵化試劑為溶劑時要高得多。氯甲酸異丙酯優(yōu)氯甲酸乙酯或異丁 酯。有趣的是，在DMF或 N甲基吡咯烷酮中，氯甲酸乙酯活化比氯甲酸異丁酯活 化引起的消旋更少。盡管如此，從氯甲酸乙酯制取的混合酸酐，以三乙胺作為三級 堿在目前幾乎沒有實(shí)用價值。最初，分別在 Nu甲基磺?；?、Nu三苯甲基、N a -三氟乙?；Ｗo(hù)的氨

13、基酸活化中觀察到混合酸酐法的副反應(yīng)。有時特戊酸（2,2 -二甲基丙酸）被推薦作為活化基，用于混合酸酐的合成，對于 Na -酰基保護(hù)的天冬酰胺尤其如此。類似地，這種不對稱酸酐由Na -?；被岷吞匚祯Ｂ戎频?，并且與氨基親核試劑反應(yīng)的產(chǎn)率高。特戊酸叔丁基的強(qiáng)+1效 應(yīng)降低了它的羰基的親電性，同時還因?yàn)榭臻g位阻的影響，使親核試劑在活化的氨 基酸上發(fā)生預(yù)期的區(qū)域選擇性進(jìn)攻。從機(jī)理上考慮，這里也要提到?；孜帖}作為 活性中間體在肽縮合中的應(yīng)用。多肽合成方法之對稱酸酐法Na -?；被岬膶ΨQ酸酐是用于肽鍵形成的高活性中間體。與混合酸酐法相 反，它與胺親核試劑的反應(yīng)沒有模棱兩可的區(qū)域選擇性。但肽縮合產(chǎn)率

14、最高，為 50% （以羧基組分計）。雖然由對稱酸酐氨解形成的游離 Na -?；被峥梢院湍繕?biāo)肽一起，通過飽和碳 酸氫鈉溶液萃取回收，但在最初，這種方法的實(shí)用價值極低。對稱酸酐可以用Na-保護(hù)氨基酸與光氣，或方便的碳二亞胺反應(yīng)制得。兩當(dāng)量的Na -保護(hù)氨基酸與-當(dāng)量的碳二亞胺反應(yīng)有利于對稱酸酐的形成，對稱酸酐可以分離出來，也可不經(jīng) 純化而直接用于后面的縮合反應(yīng)。基于 Na -烷氧羰基氨基酸的對稱酸酐對水解穩(wěn) 定，可采用類似上述純化混合酸酐的方法進(jìn)行純化。由于BOC-保護(hù)氨基酸的商品化和合理的價格，在肽鏈的逐步延長中，使用對稱酸 酐法日益受到重視。雖然可以買到晶狀的對稱酸酐，但原位制備仍然是一種

15、不錯的 選擇。多肽合成方法N-羧基內(nèi)酸酐法Hermann Leuchs在1906看發(fā)現(xiàn)，在N羧基內(nèi)酸酐（NCA中，氨基酸的羧基活化 和?；Ｗo(hù)同時發(fā)生。因此，在德國文獻(xiàn)中，又稱之為Leuchs 酸酐。原則上，該類衍生物應(yīng)具備理想的前提條件以應(yīng)用于多肽合成。第一個N羧基內(nèi)酸酐（1,3 氧氮雜環(huán)戊烷2,5 二酮）是從N（乙氧羰基） 氨基酸酰氯消除氯乙烷而得到的。制備該類衍生物的一個好方法是游離氨基酸與光 氣反應(yīng)，相應(yīng)的氨基甲酰氨為中間體。然而，痕量的水就能使N羧基內(nèi)酸酐發(fā)生聚合，因?yàn)樽畛跣纬傻陌被姿嶙詣用撊ヴ然玫接坞x胺，此游離胺是發(fā)生進(jìn)一步 開環(huán)反應(yīng)的親核試劑。因此，NCA方法在肽合成中的應(yīng)用

16、一直受到限制，直到1966年才探索出正確的反應(yīng)條件，可以在水性介質(zhì)中用N羧基內(nèi)酸進(jìn)行有條件的肽合成。在低溫和pH值為10.2的條件下，N-羧基內(nèi)酸酐能迅速?；被岷碗摹Ｔ?pH值增加到10.2時，同時加入下一種N羧基內(nèi)酸酐，開始下一輪縮合。為減少 中間體肽氨基甲酸酯和氨基組分間的羧酸酯的交換，必須劇烈攪拌反應(yīng)混合物。精 確控制pH值是另一個前提條件（氨基酸要求在 pH值為10.2 10.5，肽要求在pH 值為10.2 ），因?yàn)楫?dāng)pH值大于10.5時，產(chǎn)生副產(chǎn)物乙內(nèi)酰脲。N羧基內(nèi)酸酐的硫類似物即 N-硫代羧基內(nèi)酸酐（Nthiocarboxy anhydrides,NTA ）也可以用于肽合成，因

17、為硫代氨基甲酸酯具有較高的穩(wěn)定性。酰 化反應(yīng)可以在pH值低到9 9.5時進(jìn)行，因而可以防止可能的水解轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰 脲。NCA/NTA方法尤其適用于不需要分離反應(yīng)中間體的片段縮合。三官能團(tuán)氨基酸（除賴氨酸和半胱氨酸）不需要側(cè)鏈保護(hù)。采用該方法已組合了核糖核酸酶S-蛋白的幾個片段，之后采用疊氮物法可得到完整的S蛋白。最近，NCA方法再一次引起極大的關(guān)注，歸功于已制備出氨基甲酸酯保護(hù)的N羧基內(nèi)酸酐（urethane-protected N-carboxy anhydrides,UNCA），并用于肽合成。在非質(zhì)子溶劑中和三級堿存在的條件下，利用合適的試劑，可以將NCA勺環(huán)上氮原子?；?，引入 Boc、Z

18、或Fmoc基團(tuán)，得到相應(yīng)的 UNCA6&Y= Boc, Z， Fmoc）。 從大多數(shù)氨基酸可獲得UNCA晶體，并在無水條件下穩(wěn)定存在。UNCA寸親核試劑表 現(xiàn)出高反應(yīng)活性，在常用于肽固相和液相合成的大多數(shù)無水溶劑（除醇以外）中， 高速形成所需肽鍵。二氧化碳是唯一的副產(chǎn)物，并且沒有發(fā)生寡聚或聚合的危險， 因?yàn)樵诳s合反應(yīng)后，增長中的肽鏈氨基端仍然被氨基甲酸乙酯保護(hù)著。最近又報道了 N三苯甲基和N苯基勿甲基保護(hù)的NCA多肽合成方法之碳二亞胺法碳二亞胺類化合物可用于氨基和羧基的縮合。在該類化合物中N, Nx二環(huán)己基碳二亞胺（DCC相對便宜，而且可溶于肽合成常用的溶劑。在肽鍵形成期間，碳 二亞胺轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的脲衍生物，N, Nx二環(huán)己基脲可以從反應(yīng)液中沉淀出來。顯 然，碳二亞胺活化后的活性中間體氨解和水解速率不同，使肽合成能在含水介質(zhì)進(jìn) 行。經(jīng)幾個課題組的大量研究，確立了以碳二亞胺為縮合劑的肽縮合