PCRHPV-DNA熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序培訓(xùn)資料

1、PCR HPV- DNA 熒 光 定 量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程序 精品資料 單位及實(shí)驗(yàn)室名稱 項(xiàng) 目 編號：ASJYK-LAB-C- P-53 日期：2015年6月21 日 版本：第一版，第1次 修訂 第1頁，共3頁 檢驗(yàn)科 HPV-DNA擴(kuò)增熒光 定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作程 序 1. 目的：明確高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的操作規(guī)程，指導(dǎo)檢驗(yàn)人員正 確進(jìn)行巨細(xì)胞病毒核酸定量的檢測。 2. 適用范圍： 2.1適用于進(jìn)行高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的檢驗(yàn)人員。 2.2適合儀器：LightCycler480型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀 2.3方法原理：采用PCF方法結(jié)合熒光探針的擴(kuò)增技術(shù) 2.4樣品要求：宮頸脫落細(xì)胞

2、 3. 職責(zé)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 4. 試劑來源：潮州凱普生物化學(xué)有限公司高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測試 劑盒。 5. 質(zhì)控物：陰性、陽性對照及陽性參控品系列均來源于試劑盒 6. 標(biāo)準(zhǔn)操作： 6.1試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)操作） 6.1.1將試劑盒及其它所需試劑置室溫解凍（臨用前取出，用后立即放回冰 箱，反復(fù)凍融不可超過三次），取出PCR MIX,室溫下避光解凍，上下顛倒混勻 后，8000轉(zhuǎn)/分鐘10s從試劑盒中取出DVA聚合酶，8000轉(zhuǎn)/分鐘IOs。 6.1.2 根據(jù)當(dāng)次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量，取出相應(yīng)試劑（1管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚合酶）總的需求量

3、于一管中（其余隨即放回原溫度保存），如所需要的管數(shù) 為n （n=標(biāo)本數(shù)+1空白管對照+1管陽性對照）取PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本制備 區(qū)。 6.2樣本處理（在樣本處理區(qū)進(jìn)行） 6.2.1. 取宮頸脫落細(xì)胞樣本0. 5ml1ml（如果細(xì)胞數(shù)量少可以加大體積到2m1） 6.2.2. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘 6.2.3棄上清，加入0.5m1細(xì)胞保存液重懸細(xì)胞 6.2.4. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，盡量棄干凈上清 6.2.5. 每樣本加入50ul細(xì)胞裂解液，充分振蕩重懸細(xì)胞，煮沸10分鐘。 6.2.6. 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，保留上清備用（上清中為釋放的DNA） 6.2.7取上清2.

4、0ul作為PCR擴(kuò)增的模板，其余保存于一 20E 628在對應(yīng)的PCR反應(yīng)管中分別加入2ul處理好的樣本DVA,空白對照、陽性 對照，蓋 緊管蓋，稍做離心（反應(yīng)總體積為2o u 1/人份，每次反應(yīng)需要設(shè)置一個(gè)陽性對照 以及一個(gè)空白對照）。轉(zhuǎn)移到檢測區(qū)，放入相應(yīng)的熒光 PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣 本擺放順序 6.3 PCR擴(kuò)增（在擴(kuò)增區(qū)操作） 6.3.1打開穩(wěn)壓器電源，再打開計(jì)算機(jī)電源。 6.3.2打開擴(kuò)增儀電源，按儀器操作規(guī)程進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)條件設(shè)定。 633設(shè)置四種熒光檢測通道的報(bào)告熒光、淬滅熒光passive Refere nee選擇 ASJYK-LAB-C-P-53第 2 頁，共 3 頁 non

5、 e見表1） 表1:設(shè)置四種熒光檢測通道 Detector Name Target Reporter Dye Queneher FAM 12種高危型HPV (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 66，68) FAM none HEM HPV16 HEX/JOE none ROX HPV18 ROX/Red 610 none Cy5 B -globin Cy5 none 6.3.4將循環(huán)條件設(shè)定為 Program Cycles Temperature (C) In eubati on Time (mi n:sec) Temperature Tran si

6、ti on Rate (C /sec) l Acquisit on Mode An alysis Mode 1 1 95 10:00min 20 None None 2 45 95 15sec 20 None None 60 60sec Si ngle Quan tificati on 3 1 38 5sec 20 None None 635檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。 636將待反應(yīng)的PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀中，并根據(jù)實(shí)際情況和儀器操作規(guī)程在 程序中設(shè)定好樣孔位置。 637按儀器操作規(guī)程開始循環(huán) ASJYK-LAB-C-P-52第 3 頁，共 3 頁 638擴(kuò)增結(jié)束后取出PC

7、R反應(yīng)管，關(guān)閉擴(kuò)增儀電源，反應(yīng)管直接放入焚燒垃圾 桶內(nèi) 6.3.9分析數(shù)據(jù)，在Analysis Notes窗口中注明檢測基線值、試劑批號、陽參批 號等相關(guān)信息，進(jìn)行結(jié)果分析 6.3.10關(guān)閉計(jì)算機(jī)。 6.4檢驗(yàn)結(jié)果判斷： 6.4.1基線，閡值的設(shè)定：基線的確定為：取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號：閾值設(shè)定： 使閾值線超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值為 Un der 6.4.2質(zhì)控對照 1陰性對照Ct值均應(yīng)顯示為Un det 2陽性對照Ct值w 36 3內(nèi)對照B -globin 在Cy5通道Ct值w 40 符合以上三個(gè)條件，此反應(yīng)是為有效 6.4.3結(jié)果判斷 1樣本在FAM HEX ROX!道Ct值顯示為Un det，內(nèi)對照B -globi n 在Cy5通 道Ct值w 40,判斷為陰性 2樣本在FAM HEX ROX通道Ct值w 40,內(nèi)對照B -globin 在Cy5通道Ct值w 40判斷為陽性 3若樣本在FAM HEX ROX通道40Ct值45的樣本建議重做，重做結(jié)果 Ct值 40者為陽性，否則為陰性 7. 支持性文件： 7.1高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒（PCR 一熒光探針法）說明書 （潮州凱普生物化學(xué)有限公司） 7.2 檢測結(jié)果報(bào)告程序。 7.3 LightCycler4