細胞實驗原代培養(yǎng)

1、曲豪-農(nóng)代培養(yǎng)IMB standardization office IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C細胞生物學實驗原代培養(yǎng)一、實驗目的1. 理解細胞原代培養(yǎng)原理2. 了解細胞原代培養(yǎng)的一般方法與步驟3. 了解細胞原代培養(yǎng)的應用4. 獨立進行細胞原代培養(yǎng)操作5. 熟悉無菌操作技術(shù)二、實驗原理細胞培養(yǎng)是生物學和醫(yī)學研究最常用的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩 種。原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取組織或器官的一部分進行培養(yǎng)。由于培養(yǎng)的細胞剛剛 從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細胞 的生長、代謝、繁殖提供有力的手段。同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。原

2、代培養(yǎng):組織直接從機體獲取后，通過組織塊長出單層細胞，或者用酶消化或機械方 法將組織分散成單個細胞開始培養(yǎng)在首次傳代前的培養(yǎng)可認為是原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的過程指動物的組織或器官從機體取出后，經(jīng)機械法或各種酶類（常用胰 蛋白酶）和螯合劑（常用EDTA）處理.使之分散成單個細胞、加入適量培養(yǎng)基，置于合適 的培養(yǎng)容器中，在無菌、適當溫度和一定條件下，使之生存、生長和繁殖的過程。三、實驗步驟雞胚成纖維細胞的原代培養(yǎng)(1) 入無菌室之前首先穿實驗服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手，用新潔爾滅 溶液拭擦雙手消毒。(2) 關(guān)閉已照射超凈臺臺面20分鐘左右的紫外燈，打開抽風機清潔空氣。打開照明 燈。(3)

3、超凈臺臺面應整潔，用75%酒精擦雙手消毒，并擦拭超凈臺臺面。(4) 準備好所需試劑及儀器，擺放在超凈臺中。 按照1%的比例向含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(本次試驗的培養(yǎng)基約 為80ml,故加入800W的雙抗)(6) 取雞胚蛋一枚放入超凈工作臺中，用酒精棉球擦拭雞蛋殼后，用銀子在雞蛋氣室 位置(大頭處)敲一個小口，然后用銀子小心去除氣室部分的蛋殼。(7) 換用潔凈的無菌鑲子揭開膜，再用潔凈的無菌彎頭鑲子取出雞胚至滅菌的培養(yǎng)皿 中，并用D-hanks液沖洗雞胚，重復三次。(8) 用眼科剪去除雞胚的頭部、四肢及內(nèi)臟，用D-hanks液充分洗滌軀干部分三次。(9) 將洗滌過的軀干移至干凈的

4、培養(yǎng)皿，吸去多余的液體，然后用眼科剪將軀干充分 剪碎，剪碎速度要快。(10) 向碎塊中加入胎牛血清，用滴管將組織碎塊接入培養(yǎng)瓶中，靜置一分鐘，待組織 塊微干與瓶壁貼牢后，加入5ml培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將瓶子翻轉(zhuǎn)倒置后在 37度培養(yǎng)箱中放置2-3小時，再將瓶子翻轉(zhuǎn)過來。(11) 將用過的試劑儀器等擺回原處，將超凈臺打掃干凈，關(guān)閉照明燈及抽風機。(12) 實驗后數(shù)小時后去觀察組織塊中細胞遷移情況，并拍攝照片。四、實驗結(jié)果本次實驗在原代培養(yǎng)過夜后觀察細胞的遷移情況并拍照。雞胚成纖維細胞原代培養(yǎng)（倒置顯微鏡20“五、實驗結(jié)果分析1、原代培養(yǎng)一天后細胞生長情況觀察：由上圖可以觀察到顯微鏡下雞胚組織塊

5、附近有大量細胞遷移，遷移出來的細胞呈纖維 狀，貼壁生長，且沒有污染發(fā)生，實驗結(jié)果比較理想。2、本實驗的材料盡量選取胚胎或幼小的生物體組織或者繁殖能力較強的組織。3、使用組織塊法進行原代培養(yǎng)時，應待組織塊略干燥，能粘附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶時要輕，勿使組織塊漂浮起來。4、要注意無菌操作。六、思考題1、從細胞增殖及調(diào)控角度來看哪種組織和器官適用于原代培養(yǎng)實驗？取材應注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。2、如何提高原代細胞培養(yǎng)的成功率？1）在選擇材料的時候一上要注意選取9-12日齡的雞胚，在處理胚胎的時候要于凈利落，要將四肢及內(nèi)臟去除干凈。（2）應待組織塊略F燥，能粘附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶時要輕，勿使組織塊漂浮起來。（3）操作一泄要無菌，不能污染。組織一泄要盡量剪得碎一點，且動作要迅速。3、雞胚成纖維細胞的應用？(1) 病毒學領(lǐng)域的相關(guān)研究：CEF細胞是疫苗生產(chǎn)的一種重要的細胞資源，現(xiàn)在它被用來生產(chǎn)各種雞的疫苗,如傳染性法氏囊病、馬立克病、新城疫疫苗等，也被用來表達一 些基因工程產(chǎn)物。(2) 雞胚成纖維細胞良好的耐受性使之易于進行從基因轉(zhuǎn)染到微注射等較多領(lǐng)域