動物肝臟中DNA的提取匯總

1、實驗八動物肝臟中DNA的提取一、目的學(xué)習(xí)和掌握用濃鹽法從動物組織中提取DNA的原理和技術(shù)二、原理核酸和蛋白質(zhì)在生物體中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于細胞核中，應(yīng)（4C）進行，動植物的DNA核蛋白能溶于水及高濃度的鹽溶液（如1mol/L NaCl）, 但在0.14mol/L的鹽溶液中 溶解度降低，而RNA核蛋白則溶于0.14mol/L 鹽溶液，可利用不同濃度的氯化鈉 溶液，將脫氧核糖蛋白和核糖蛋白從樣 品中分別抽提出來。將抽提得到的脫氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉） 處理，DNA即與蛋白質(zhì)分開，可用氯仿將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶 解于溶液中。向含有DNA的水相中加入 冷乙醇，D

2、NA即呈纖維狀沉淀 出 來。三、實驗器材1. 豬肝。2. 722型（或7220型）分光光度計。3.勻漿器4.量筒 50ml （XI）、10ml （X1）。5.離心機（5000r/min）。6.離心管。7.試 管及試管架。 8.吸管 0.50ml （2）、1.0ml （&）、2.0ml （2）、5.0m l （X）。四、實驗試劑1. 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 檸檬酸鈉（pH6.8）。2. 0.015mol/L NaC l - 0.0015mol/L檸檬酸三鈉溶液：氯化鈉 0.828g及檸檬酸三鈉0.341g溶 于蒸餾水，稀釋至1000ml。3. 95%乙醇（A . R. ）

3、。4. NaCl固體（A . R.）。5. 5% SDS 溶液：5g SDS 溶于 100ml 水中。6.氯仿（A. R. ）。7. V （氯仿）：V （異戊醇）混合液20: 1。五、操作1. 稱取豬肝8g,用勻漿器磨碎（冰?。尤胂喈?dāng)于 2倍肝重的0.1mol /L NaCl- 0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液，研磨三次，然后倒出勻漿物，勻漿 物在4000r/min下離心10min;沉淀中再加入25ml緩沖液，于4000r/min 離心20min；取沉淀。2. 在上述沉淀中加入 40ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液、 20mlCHCI3 異戊醇混合液、4m

4、l 5% SDS使其終濃度為0.41%，振搖30 min，然后緩慢加固體NaCl，使其濃度為1mol/L （約3.6g）。將上述混合 液在3500r/min離心20min，取上清水相。3. 在上述水相溶液中加入等體積冷 95%乙醇，邊加邊用玻璃棒慢慢攪動， 將纏繞在玻棒上的凝膠狀物用濾紙吸去多余的乙醇，即得 DNA粗品。用 蒸餾水溶解并定容至50ml，用二苯胺法測定DNA含量。4. 提純將上述所得的 DNA粗品置于20ml 0.015mol/L NaCl-0.0015mol /L檸檬酸三鈉溶液中，加入1倍體積的氯仿異戊醇混合液，振搖10min， 離心（4000r/min, 10min）,傾出上

5、層液（沉淀棄去），加入1.5倍體積9 5%乙醇，DNA即沉淀析出。離心，棄去上清液，沉淀（粗 DNA ）按本操 作步驟重復(fù)一次。最后所得沉淀用無水乙醇洗滌 2次，真空干燥。四、實驗結(jié)果是否可見DNA ?顏色如何？有無斷裂現(xiàn)象？實驗九酵母RNA的提取和定性檢測【實驗?zāi)康摹?學(xué)習(xí)稀堿法提取RNA的原理和操作方法2. 掌握RNA組分的鑒定方法【實驗原理】酵母中含有豐富的RNA（可達酵母干重的2.62%10%），是工業(yè)上大 規(guī)模制備核酸和核苷酸的原料。稀堿法是工業(yè)上常用的RNA提取方法，是用稀堿溶液使細胞裂解，使 RNA釋放到堿液中，然后用酸中和，除去 蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀 RNA ;或用

6、酸調(diào)整pH至2.5,利用等 電點沉淀RNA。RNA用H2SO4水解時，可以生成磷酸、戊糖和堿基，各種成分以下列 反應(yīng)鑒定：磷酸：用強酸使 RNA中的有機磷消化成無機磷，后者與定 磷試劑中的鉬酸銨結(jié)合成磷鉬酸銨（黃色沉淀），當(dāng)有還原劑存在時磷鉬酸 銨立即轉(zhuǎn)變成藍色的還原產(chǎn)物 一鉬藍。核糖：RNA與濃鹽酸共熱時，發(fā) 生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與苔黑酚反應(yīng)，在Fe+或 Cu2+催化下生成鮮綠色復(fù)合物。嘌呤堿與AgNO3能產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物 沉淀?！酒鞑呐c試劑、】（一）器材1. 150ml錐形瓶2. 沸水浴3. 量筒4. 移液管5. 吸管及滴管6. 布氏漏斗和抽濾裝置7. 試管、試管夾

7、及試管架8. 離心機9. 濾紙10. pH試紙11. 燒杯12. 天平13. 酵母粉（二）試劑1.0.2% NaOH 溶液2. 95%乙醇3. 冰乙酸4. 無水乙醚5. 1.5mol/L H2SO46. 濃氨水7. 5% AgNO3 溶液8. 苔黑酚乙醇溶液稱取苔黑酚6g,溶解于95%乙醇100ml （冰箱中可保存1個月）。9. FeCb的濃鹽酸溶液取10% FeCl3 2ml，與濃鹽酸400ml混合。10. 定磷試劑（1）17% H2SO4 溶液（2）2.5%鉬酸銨溶液（3）10%抗壞血酸溶液（貯存于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1個月。溶液呈淡黃色時可用，如呈深黃色或棕色則已失效。）臨用時將

8、上述3種溶液與水按如下比例混合（限當(dāng)天使用）：17%H2SO4：2.5%鉬酸銨：水:10%抗壞血酸=1:121 （V:V）【實驗步驟】（一） RNA的粗提取1. 取酵母粉5g,置于100ml燒杯中，加入0.2% NaOH溶液20ml，攪拌成懸浮液。2. 將懸浮液在沸水浴中加熱30min,冷卻至室溫，分兩管4000rpm離心10mi n。3. 將上清液緩緩傾入95%乙醇30ml中，注意邊攪拌邊緩緩傾入，用冰乙酸調(diào)pH值至2.5。靜置，待RNA沉淀完全后，3000rpm離心3min。4. 棄上清，以95%乙醇10ml洗滌沉淀，3000rpm離心3min。再用95%乙醇10ml洗滌沉淀，并移入布氏漏

9、斗中抽濾。5. 用無水乙醚洗滌沉淀2次，每次20ml，于布氏漏斗中抽濾至沉淀干燥。（二）水解RNA將提取的RNA加入5ml 10% H2SO4中，沸水浴加熱10min,使RNA水 解。（三）RNA組分鑒定1. 嘌呤堿：取試管1支，加入水解液1ml，濃氨水2ml ,5%的AgNO3 1ml，觀察是否產(chǎn)生白色絮狀嘌呤銀化物沉淀（放置后可能變?yōu)樽睾谏?. 戊糖：取試管1支，加入水解液1ml，苔黑酚-FeCb溶液1ml，在沸水浴中加熱，觀察試管中顏色變化。3. 磷酸：取試管1支，加入水解液1ml和定磷試劑1ml，在沸水浴中加熱，觀察試管中顏色變化?！疽c提示】1. 苔黑酚（又名地衣酚，3,5-甲苯

10、二酚）鑒定戊糖時特異性較差，凡屬戊糖 均有此反應(yīng)。微量DNA無影響，較多DNA存在時有干擾作用，在試劑中 加入適量CuC12 2H2O可減少DNA的干擾，甚至某些戊糖持續(xù)加熱后生成 的羥甲基糠醛也能與地衣酚反應(yīng)，產(chǎn)生顯色復(fù)合物。2. 苔黑酚鑒定戊糖時也可用下列配方：（1）苔黑酚試劑：FeCb 0.1g溶于濃鹽酸100ml，搖勻，貯存?zhèn)溆谩Ｊ褂?前加入苔黑酚0.476g。（2）苔黑酚試劑：苔黑酚0.1g溶于濃鹽酸100ml中，再加FeCb 0.1g （臨用前配制）。3. RNA中磷酸的鑒定方法有兩種，原理如下：（1）鉬酸銨試劑鑒定：鉬酸銨試劑：鉬酸銨2g溶解于10%的硫酸100ml。強酸使RNA分子中的有機磷消化成無機磷，使與鉬酸銨試劑中的鉬酸銨 結(jié)合成磷鉬酸銨（NH4）3PO4 12MoO3 （黃色沉淀）。3+2+P04 -+3NH4 +12MoO4 -+24H =(NH4)3 PO4 12MoO3 6H2OJ +6H0(2)定磷試劑鑒定：上述反應(yīng)當(dāng)有還原劑存在時，Mo被還原成Mo ,此Mo4+再與試劑中的其它M042-結(jié)合成Mo(MoO4)2或M0308,呈藍色，稱 為鉬藍。在一定濃度范圍內(nèi)，藍色的深淺和磷含量成正比，因此也可用分 光光度法定量測定RNA。4用乙醇沉淀RNA時，需用酸中和稀堿，可以加冰乙酸至 pH2.5，也可以 直接用酸性乙醇(濃鹽酸1ml加入