SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量

1、1 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測聚丙烯酰胺凝膠電泳測 定蛋白質分子量定蛋白質分子量 2 SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術是動物聚丙稀酰胺凝膠電泳技術是動物 生物化學實驗技術教學中一個重要實驗之生物化學實驗技術教學中一個重要實驗之 一。一。 3 能夠帶動生化實驗技術綜合型能夠帶動生化實驗技術綜合型 實驗項目的開設。實驗項目的開設。 如：蛋白質鹽析沉淀提取如：蛋白質鹽析沉淀提取 葡聚葡聚 糖凝膠層析分離糖凝膠層析分離 DEAE-纖維素分離纖維素分離 提純蛋白質提純蛋白質 蛋白質純度鑒定、蛋白蛋白質純度鑒定、蛋白 質分子量測定等。質分子量測定等。 4 一、實驗目的一、實驗目的 n通過該實驗使學

2、生掌握通過該實驗使學生掌握SDS-PAGESDS-PAGE 測定蛋白質分子量的原理；測定蛋白質分子量的原理； n掌握該技術的操作方法（基礎性很掌握該技術的操作方法（基礎性很 強，使用范圍寬闊強，使用范圍寬闊； n運用運用SDS-PAGESDS-PAGE測定蛋白質分子量測定蛋白質分子量 及染色鑒定。及染色鑒定。 5 二、實驗原理二、實驗原理 n帶電質點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，帶電質點在電場中向帶有異相電荷的電極移動， 這種現象稱為這種現象稱為電泳。電泳。 n電泳分類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳等。電泳分類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳等。 n區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 是在半固相或膠狀介質上加一個點或一薄

3、是在半固相或膠狀介質上加一個點或一薄 層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質上或支層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質上或支 持介質中遷移。持介質中遷移。 6 區(qū)帶電泳使用不同的支持介質，有區(qū)帶電泳使用不同的支持介質，有 濾紙、纖維素粉、聚氯乙烯樹脂、淀濾紙、纖維素粉、聚氯乙烯樹脂、淀 粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜， 現在則多用現在則多用聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）和和 瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠。 7 （一）分類（一）分類 PAGEPAGE根據其有無濃縮效應，分為根據其有無濃縮效應，分為 連續(xù)系統和不連續(xù)系統連續(xù)系統和不連續(xù)系統兩大類：兩大類：

4、1. 1. 連續(xù)系統：連續(xù)系統：電泳體系中緩沖電泳體系中緩沖 液液pHpH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在 電場作用下，電場作用下，主要靠電荷和分子篩效主要靠電荷和分子篩效 應。應。 8 2. 2.不連續(xù)系統不連續(xù)系統：由于緩沖液離子：由于緩沖液離子 成分、成分、pHpH、凝膠濃度及電位梯度的、凝膠濃度及電位梯度的 不連續(xù)性，帶電顆粒在不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動電場中泳動 不僅有電荷效應，分子篩效應，不僅有電荷效應，分子篩效應，還還 具有濃縮效應，具有濃縮效應，因而其分離條帶清因而其分離條帶清 晰度及分辨率均較前者佳。晰度及分辨率均較前者佳。 9 （二）特點：（二）

5、特點： SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在是在 聚丙烯酰胺凝膠系統中引進聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDSSDS（十二（十二 烷基磺酸鈉）。烷基磺酸鈉）。 10 蛋白質在一定濃度的含有強還原劑蛋白質在一定濃度的含有強還原劑 的的SDSSDS溶液中，與溶液中，與SDSSDS分子按比例結合，分子按比例結合， 形成帶負電荷的形成帶負電荷的SDS-SDS-蛋白質復合物。蛋白質復合物。 蛋白質喪失了原有的蛋白質喪失了原有的電荷狀態(tài)電荷狀態(tài)形成形成 僅保持原有分子大小僅保持原有分子大小為特征的負離子團為特征的負離子團 塊，塊，降低或消除了各種蛋白質分子之間降低或消除了各種蛋白質分子之間

6、 天然的電荷差異天然的電荷差異，因此在進行電泳時，因此在進行電泳時， 11 蛋白質分蛋白質分子移速度取決于分子大小。子移速度取決于分子大小。 當分子量在當分子量在15000KD15000KD到到200000KD200000KD 之間時，蛋白質的遷移率和分子量的之間時，蛋白質的遷移率和分子量的 對數對數呈線性關系呈線性關系。合下式：合下式： ，式中，式中 將已知分子量的將已知分子量的標準蛋白質的遷標準蛋白質的遷 移率對分子量對數作圖移率對分子量對數作圖，可獲得一條，可獲得一條 標準曲線標準曲線，未知蛋白質在相同條件下，未知蛋白質在相同條件下 進行電泳，根據它的電泳遷移率即可進行電泳，根據它的電泳

7、遷移率即可 在標準曲線上求得分子量。在標準曲線上求得分子量。 12 圖1 標準蛋白質與待測樣品電泳圖譜 圖2 電泳遷移率與logMW之間的關系 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 膠槽膠槽1 23 注：膠槽1 標準蛋白；膠槽2、3 樣品蛋白 得到同行專家贊 13 采用采用SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 法測蛋白質分子量時，必須法測蛋白質分子量時，必須完全打開完全打開 蛋白質之間的二硫鍵，使蛋白質分子蛋白質之間的二硫鍵，使蛋白質分子 被解聚，被解聚，SDSSDS才能定量地結合到亞基才能定量地結合到亞基 上。上。因此在用因此在用

8、SDSSDS處理樣品同時用處理樣品同時用巰巰 基乙醇處理基乙醇處理。巰基乙醇是一種強還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從巰基乙醇是一種強還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從 而使很多不溶性蛋白質溶解而與而使很多不溶性蛋白質溶解而與SDSSDS定量結合。定量結合。 14 三、三、 實驗試劑和器材實驗試劑和器材 材料材料 實驗試劑實驗試劑 1.低分子量標準蛋白試劑盒: 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌動蛋白兔肌動蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100

9、雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 MW=14,400 開封后溶于開封后溶于200l蒸餾水，置蒸餾水，置-20保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。分鐘后上樣。 樣品樣品1：稱：稱3mg樣品樣品1，加，加2 ml蒸餾水溶解蒸餾水溶解。 15 2. 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）：稱）：稱Acr30g， 甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸餾水至，加蒸餾水至100ml，過濾，過濾 后置棕色瓶中后置棕色瓶中 3. 10%SDS（十二烷基磺酸鈉）（十二烷基磺酸鈉） 4. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液：稱緩沖液：稱 取

10、取Tris18.2g（PH計）計） 16 （7）10%過硫酸銨過硫酸銨(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺） （9）樣品溶解液：）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（巰基乙醇（0.1ml） + 溴酚藍（溴酚藍（2mg）+甘油（甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至），最后定容至10ml。 （10）固定液：?。┕潭ㄒ海喝?0%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混勻?；靹颉?（11）染色液：稱取考馬斯亮藍）染色液：稱取考馬斯亮藍R250 0.125g，加上述固，加上述固 定液定液 250ml， 過濾后備用。過濾后備

11、用。 （12）脫色液：冰乙酸）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸餾水定容，加蒸餾水定容 至至1000ml。 （13）電極緩沖液（內含）電極緩沖液（內含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱）：稱Tris6.0g，甘，甘 氨酸氨酸 28.8g，加入，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。 17 實驗器材實驗器材 n 垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置 n直流穩(wěn)壓電源電泳厚膠濃度后要做直流穩(wěn)壓電源電泳厚膠濃度后要做8各小時，薄膠各小時，薄膠5各小時）各小時） n 電泳儀電泳儀 n

12、標準型酸度計（標準型酸度計（TLD80-2B） n 離心機等離心機等 18 四、四、實驗過程實驗過程 如：如：免疫球蛋白免疫球蛋白G G 分子量的測定分子量的測定 （一）血清（一）血清- -球蛋白的提取球蛋白的提取 硫酸胺鹽析沉淀法硫酸胺鹽析沉淀法 （二）（二） - -球蛋白球蛋白脫鹽脫鹽純化純化 葡聚糖凝膠過濾（柱層析法）除去硫酸胺，得到葡聚糖凝膠過濾（柱層析法）除去硫酸胺，得到- - 球蛋白球蛋白（去年完成的基金項目）（去年完成的基金項目） （三）純化免疫球蛋白（三）純化免疫球蛋白G G DEAE-DEAE-離子交換纖維素法純化免疫球蛋白離子交換纖維素法純化免疫球蛋白G G。 （四）（四）

13、 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定血液免疫球血液免疫球 蛋白蛋白G G的分子量的分子量（ 連續(xù)四個單項實驗）。 19 （1 1）制膠）制膠（簡單敘述（簡單敘述）（雙層膠，摸索膠濃度）（雙層膠，摸索膠濃度） A.A.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 準備準備2 2個干個干 凈的錐形瓶。把玻璃板在灌膠支架上固定好。凈的錐形瓶。把玻璃板在灌膠支架上固定好。 B.B.按比例配好按比例配好分離膠，分離膠，溶液立即傾入制膠溶液立即傾入制膠 模板中模板中(1 5(1 5模板模板) )，加少許蒸餾水，待膠凝，加少許蒸餾水，待膠凝 固后，倒出水并用濾紙把剩余

14、的水分吸干，按比固后，倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比 例例配好濃縮膠，配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣 5mm5mm處，樣梳需一次平穩(wěn)插入，靜置處，樣梳需一次平穩(wěn)插入，靜置4040分鐘，待分鐘，待 模板中的膠定型后，輕輕取出梳形樣品槽模具，模板中的膠定型后，輕輕取出梳形樣品槽模具， 梳口處不得有氣泡，拔出樣梳后，在上槽內加入梳口處不得有氣泡，拔出樣梳后，在上槽內加入 緩沖液。緩沖液。 20 C.C.拔出樣梳后拔出樣梳后, ,在上槽內加入緩沖液在上槽內加入緩沖液, , D. D.加樣（摸索加樣量）加樣（摸索加樣量） 取取10l標準蛋白標準蛋白溶解液于溶解液于

15、 EP管內，再加入管內，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣量為倍樣品緩沖液，上樣量為20l。 取取10l樣品溶液樣品溶液，再加入，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上倍樣品緩沖液，上 樣量分別為樣量分別為5l 和和10l。 E.E.用微量注射器距槽底三分之一處進樣用微量注射器距槽底三分之一處進樣, ,加樣前加樣前, , 樣品在沸水中樣品在沸水中加熱加熱3 3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。 21 F.F.電泳槽中加入緩沖液，電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行接通電源，進行 電泳，開始電流恒定在電泳，開始電流恒定在8mA，（電流、電壓），（電流、電壓） 當進入分離膠后改為當進入分離膠后改

16、為16mA，溴酚藍距凝膠邊，溴酚藍距凝膠邊 緣約緣約5mm時，停止電泳。時，停止電泳。 G.G.凝膠板剝離與染色凝膠板剝離與染色 電泳結束后，撬開電泳結束后，撬開 玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內，玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內， 加入染色液，染色加入染色液，染色 過夜。過夜。 H.H.脫色脫色 染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數 次，再用脫色液脫色次，再用脫色液脫色 。 剝膠時要小心剝膠時要小心, ,保持膠完好無損保持膠完好無損, ,染色要充分染色要充分。 22 圖1 標準蛋白質與待測樣品電泳圖譜 圖2 電泳遷移率與logMW之間的關系 五、實驗結果分

17、析五、實驗結果分析 94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400 膠槽膠槽1 23 注：膠槽1 標準蛋白；膠槽2、3 樣品蛋白 23 六、分析計算六、分析計算 繪制標準曲線繪制標準曲線：按下式計算 電泳遷移率電泳遷移率 = 樣品遷移距離樣品遷移距離/溴酚籃遷移距離溴酚籃遷移距離 以每個以每個蛋白標準的分子量對數蛋白標準的分子量對數對它的相對對它的相對遷移遷移 率作圖率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可 測出其分于量，這樣的標難曲線只對測出其分于量，這樣的標難曲線只對同一塊凝膠同一塊凝膠 上的樣品的分子量測定才具有可

18、靠性。上的樣品的分子量測定才具有可靠性。 24 標準蛋白分子量（標準試劑盒）：標準蛋白分子量（標準試劑盒）： 97400kD、66200kD、43000kD、 31000kD、20100kD、14400kD。 采用不連續(xù)采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳法對所分電泳法對所分 離純化的蛋白質進行純度鑒定，發(fā)現圖中離純化的蛋白質進行純度鑒定，發(fā)現圖中 電泳圖譜可以清晰的看到電泳圖譜可以清晰的看到兩條蛋白帶兩條蛋白帶。 25 兩條蛋白帶代表兩條蛋白帶代表綿羊免疫球蛋白綿羊免疫球蛋白G的重的重 鏈和輕鏈。鏈和輕鏈。 計算分析結果表明：計算分析結果表明： 綿羊血清綿羊血清lgG重鏈和輕鏈的分子量分別重鏈和輕

19、鏈的分子量分別 為為50000和和28000Kd。一般說來，當蛋。一般說來，當蛋 白質的分子量在白質的分子量在200000至至15000 kD 之之 間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性 關系關系 。實驗結果各譜帶所代表的成分的分實驗結果各譜帶所代表的成分的分 子量的范圍均在此之間。子量的范圍均在此之間。用用SDS-PAGE垂直板電泳測得綿羊血清具有一垂直板電泳測得綿羊血清具有一 定的可信度定的可信度 。 26 七、思考題七、思考題 n在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,當分離膠加完后當分離膠加完后, ,需需 在其上加一層水在其

20、上加一層水, ,為什么為什么? ? n在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,分離膠與濃縮膠中分離膠與濃縮膠中 均含有均含有TEMEDTEMED和和AP,AP,試述其作用試述其作用? ? n樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘? ? 27 十二、達到預期目標十二、達到預期目標 1. SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術聚丙稀酰胺凝膠電泳技術是動是動 物生物化學實驗技術教學中物生物化學實驗技術教學中一個綜合性實一個綜合性實 驗項目驗項目， 且是一個較高水平的一個實驗項且是一個較高水平的一個實驗項 目。目。 28 蛋白質鹽析沉淀提取蛋白質鹽析沉淀提取 凝膠層析分離（上年基金項目已完成）凝膠層析