納他霉素的發(fā)酵生產(chǎn)、分離提純及檢測(cè)-廣州大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、納他霉素的發(fā)酵生產(chǎn)、分離提純及檢測(cè)學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院班級(jí)：XXX學(xué)號(hào)：XXX姓名：XXX摘要 本實(shí)驗(yàn)利用褐黃孢鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素，通過(guò)對(duì)褐黃孢鏈霉菌進(jìn)行孢子和種子液培養(yǎng)以及搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，使其產(chǎn)納他霉素，并分離純化得到0.35g/L納他霉素。期間每24h對(duì)培養(yǎng)液取樣鏡檢觀察菌體生長(zhǎng)，并用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。本實(shí)驗(yàn)表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，納他霉素的含量逐漸增加，菌體生長(zhǎng)，菌絲變長(zhǎng)而緊密。關(guān)鍵詞 納他霉素 搖瓶發(fā)酵 褐黃孢鏈霉菌1 前言納他霉素（Natamycin）是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑，也稱游鏈霉素或匹馬霉素(Pimaricin)。它是由5個(gè)多聚乙酰合成酶基因編碼的多酶體系合成。由

2、于它能夠?qū)Ｐ缘匾种平湍妇兔咕?，被廣泛應(yīng)用于食品防腐和真菌引起的疾病的治療。納他霉素是近白色至奶油黃色結(jié)晶粉末，幾乎無(wú)臭無(wú)味，溶點(diǎn)280（分解），分子式C33H47O13，相對(duì)分子量665.75，結(jié)構(gòu)式如圖所示。納他霉素是一類兩性物質(zhì)，分子中有一個(gè)堿性基團(tuán)和一個(gè)酸性基團(tuán)，等電點(diǎn)為6.5。在大多數(shù)食品的pH值范圍內(nèi)，納他霉素是非常穩(wěn)定的。高溫、紫外線、氧化劑及重金屬等會(huì)影響納他霉素低的穩(wěn)定性。但可以瞬時(shí)高溫（溫度可達(dá)100）不影響其活性。N-Natamycin(3-N-dimethylaminopropylsuccimido)的活性比較低，可能是對(duì)它的化學(xué)修飾都會(huì)降低其活性，納他霉素是經(jīng)深層發(fā)酵

3、和多步提取工藝精制而成，其制劑通常是50%納他霉素和50%乳糖的混合物。納他霉素的生產(chǎn)菌種主要有Streptomyces chattanovgensis, Streptomyces natulonso, Streptomyces gilvosporeus等3種鏈霉菌。本實(shí)驗(yàn)所用菌種為褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus），孢子絲螺旋形。孢子表面帶刺。在發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)液中各成分的濃度和類型都會(huì)影響納他霉素的生物合成，其中碳氮比是最關(guān)鍵的因素之一，氮源促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)要在發(fā)酵中流加補(bǔ)充適當(dāng)?shù)奶荚?葡萄糖)。納他霉素在以葡萄糖作為碳源時(shí)產(chǎn)量最高，這是因?yàn)槠咸烟悄?/p>

4、滲入納他霉素的分子中去。有資料表明，氮源的類型對(duì)菌體生長(zhǎng)和納他霉素的產(chǎn)量有較大影響，菌體細(xì)胞生長(zhǎng)最好的氮源是酵母抽提物，而納他霉素產(chǎn)生的最佳氮源是牛肉浸出物。納他霉素是26種多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑的一種，多烯是一平面大環(huán)內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1），納他霉素分子的疏水部分即大環(huán)內(nèi)酯的雙鍵部分以范德華力和真菌細(xì)胞質(zhì)膜上的甾醇分子結(jié)合，形成抗生素甾醇復(fù)合物，破壞細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性；分子的親水部分即大環(huán)內(nèi)酯的多醇部分則在膜上形成水孔，損傷膜的通透性，從而引起菌內(nèi)氨基酸、電解質(zhì)等重要物質(zhì)滲出而死亡。但有些微生物如細(xì)菌的細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)膜不存在這些類甾醇化合物，所以納他霉素對(duì)細(xì)菌沒(méi)有作用。圖1納他霉素的分子結(jié)構(gòu)2

5、 材料與方法2.1材料搖床（HYG-B全溫度搖瓶柜）、真空干燥箱（型號(hào)：DZX-6090）、顯微鏡、離心機(jī)、生化培養(yǎng)箱、紫外分光光度計(jì)、褐黃孢鏈霉素、酵母提取粉、麥芽提取粉、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、大豆分離蛋白、麥芽糊精、酵母提取粉、乙醇、甲醇、20%NaOH、抗氧化劑BHA、1,2丙二醇、納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品、250ml三角瓶等等2.2方法2.2.1培養(yǎng)基制備2.2.1.1斜面孢子培養(yǎng)2.2.1.1.1孢子培養(yǎng)基酵母提取粉4g/L，麥芽提取粉10g/L，葡萄糖4g/L，瓊脂20g/L，pH7.02.2.1.1.2孢子斜面制備按斜面孢子培養(yǎng)基配方稱好原料，用融化瓊脂溶解，定容，用20%氫氧化鉀

6、調(diào)pH，121滅菌15min，擺斜面冷卻后置于37培養(yǎng)1-2天，備用。用斜面轉(zhuǎn)管接種，25培養(yǎng)10天，待孢子長(zhǎng)滿后，放置冰箱5天以上再用。涂片觀察孢子形態(tài)，并顯微拍照。2.2.1.2搖瓶種子培養(yǎng)2.2.1.2.1搖瓶種子培養(yǎng)基葡萄糖15g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L、pH7.02.2.1.2.2搖瓶種子制備按搖瓶種子培養(yǎng)基配方稱好原料，用水溶解，定容，調(diào)pH，分裝（250ml裝50ml），121滅菌15分鐘。待培養(yǎng)基冷卻后，刮取孢子接種搖瓶，每支斜面接種5瓶搖瓶。，29，200rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。無(wú)菌取樣，涂片觀察種子菌球形態(tài)，并顯微拍照。2.2.1.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)2.2.1.

7、3.1搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基大豆分離蛋白19.5g/L、麥芽糊精50g/L、酵母提取粉4g/L、葡萄糖6g/L、pH7.02.2.1.3.2 搖瓶發(fā)酵按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方稱好原料，用水溶解，定容，調(diào)pH，分裝（250mL裝40mL），121滅菌25分鐘。待培養(yǎng)基冷卻后，取搖瓶種子1ml接種，29，200rpm振蕩培養(yǎng)120168hr。每隔24hr無(wú)菌取樣，涂片觀察菌球形態(tài)，并顯微拍照。2.2.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取50mg的納他霉素，溶于100mL丙二醇，得濃度為500g/mL的納他霉素原液。按表8-1制作曲線，橫坐標(biāo)為納他霉素工作溶液濃度，縱坐標(biāo)為OD303nm。注意給出回歸方程（y=kx+b）和相關(guān)系

8、數(shù)（R2），如果相關(guān)系數(shù)0.99，要求重做標(biāo)準(zhǔn)曲線。產(chǎn)物濃度計(jì)算公式為：納他霉素含量（mg/L）=X100n其中：X為將所測(cè)樣品的OD303nm作為y值，代入回歸方程中求出的相應(yīng)的x值。100為樣品處理時(shí)2次稀釋倍數(shù)之積。如果所得樣品OD303nm超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為，則稀釋n倍后再次測(cè)定。表1 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線工作表管號(hào)123456工作溶液濃度（g/mL）01.252.53.7556.25納他霉素原液（mL）添加量00.0250.050.0750.10.125水（mL）109.9759.959.9259.99.8752.2.3 納他霉素的提取與檢測(cè)納他霉素不溶于水，因此它在發(fā)酵液中呈晶體狀。納

9、他霉素晶體有針型的，圓盤型的等等。它們都是在發(fā)酵過(guò)程中形成，直徑一般在0.520nm。從接種后第48h開始，每隔24h從每瓶發(fā)酵液中取0.5mL的發(fā)酵液，混合均勻，取混合后的發(fā)酵液0.5mL，加4.5mL的丙二醇（此過(guò)程樣品稀釋了10倍），在搖床上震蕩1小時(shí)，12000rpm離心10min，取0.5mL上清液，加4.5ml蒸餾水（此過(guò)程樣品再次稀釋了10倍），搖勻，在紫外分光光度計(jì)303nm測(cè)定光密度。如果吸光度太大，需要再稀釋一次，計(jì)算結(jié)果時(shí)記得乘以此稀釋倍數(shù)。剩余的混合后的發(fā)酵液平批分成2份，分別用于測(cè)定還原糖和氨氮。2.2.4 納他霉素的分離純化2.2.4.1 發(fā)酵液6000rpm離心1

10、0min。離心前發(fā)酵液的體積與離心后上清液的體積之差即為濕菌泥的體積。2.2.4.2 濕菌泥加2倍體積 95%乙醇，20%氫氧化鈉調(diào)pH1010.5，邊加邊攪拌0.5hr（注意一定要調(diào)過(guò)pH后再計(jì)時(shí)），以便納他霉素充分溶解。2.2.4.3 6000rpm離心10min，保留上清液。2.2.4.4 用1N鹽酸調(diào)pH6.5，靜置3hr以上（或冰箱過(guò)夜），以便納他霉素在等電點(diǎn)處沉淀析出。2.2.4.5 6000rpm離心10min，保留沉淀（產(chǎn)物）。2.2.4.6 55真空干燥2hr，稱重。3結(jié)果與分析3.1 發(fā)酵過(guò)程褐黃孢鏈霉菌形態(tài)的變化 圖2 刮菌鏡檢 10X圖為在斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，將斜面孢子

11、接種到種子培養(yǎng)基前（種子培養(yǎng)0 h）的孢子形態(tài),由圖可看出孢子呈圓球狀。 圖3 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24h（發(fā)酵液培養(yǎng)0 h） 油鏡由上圖可知，種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（發(fā)酵液培養(yǎng)0 h）時(shí)，菌絲十分完整，菌絲比較長(zhǎng)，菌體密集，由此推測(cè)該菌體生長(zhǎng)較旺盛，故可轉(zhuǎn)于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 圖4 發(fā)酵液培養(yǎng)24h 油鏡 圖5 發(fā)酵液培養(yǎng)48h 10X由圖4和圖5觀察菌落的形態(tài)可知，由于轉(zhuǎn)入到發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)間不長(zhǎng)，可能由于不適應(yīng)等原因，菌體生長(zhǎng)比較緩慢，菌絲不是很長(zhǎng)。 圖6 發(fā)酵液培養(yǎng)72h 油鏡 圖7 發(fā)酵液培養(yǎng)96h 油鏡由圖6和圖7可看出，在發(fā)酵培養(yǎng)72h和96h時(shí)，在油鏡下觀察到菌體的菌絲較長(zhǎng)且較密集，可

12、以看到圓形的孢子，但視野主要是菌體的菌絲。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，菌絲密度越來(lái)越大，菌絲越來(lái)越長(zhǎng)。圖8 發(fā)酵液培養(yǎng)120h 油鏡 圖8為發(fā)酵培養(yǎng)120h在油鏡下觀察的菌體情況，可以看到菌體減少，大量菌絲斷裂且有較多圓形孢子，這是因?yàn)榫z已經(jīng)開始老化，此時(shí)，納他霉素的含量也有所增長(zhǎng)。3.2 納他霉素的檢測(cè)3.2.1 納他霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線表2 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線表管號(hào)1234567工作溶液濃度（g/mL）01.252.53.7556.257.5納他霉素原液（mL）添加量00.0250.050.0750.10.1250.15水（mL）109.9759.959.9259.99.8759.85OD303CK0.09

13、20.1950.310.4010.5010.645圖9 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線3.2.2 納他霉素的檢測(cè)表3 納他霉素含量隨時(shí)間變化表培養(yǎng)時(shí)間/h24487296120稀釋倍數(shù)100100100200200OD值0.2970.5310.6250.4500.556納他霉素濃度（g/L）0.0740.1300.153 0.2220.273圖10 納他霉素濃度隨發(fā)酵時(shí)間變化圖分析：由表3和圖10可知，納他霉素的濃度隨發(fā)酵時(shí)間增加而增加，且接近線性關(guān)系。3.3納他霉素的分離純化離心前發(fā)酵液體積/mL300離心后上清液體積/mL256濕菌泥體積/cm244干菌泥與離心瓶/g40.44瓶子的重量/g40.33納

14、他霉素干重/g0.11由此分析：1、 由120h測(cè)得的納他霉素的濃度為0.273g/L，而本實(shí)驗(yàn)中分離純化得到的納他霉素的含量為0.110.3=0.35g/L0.273g/L,其中0.35g/L較0.273g/L遲一周測(cè)量，因此可推測(cè)出，此后一周發(fā)酵液培養(yǎng)中，納他霉素含量有所增長(zhǎng)，約0.35-0.273=0.077g/L2、 本實(shí)驗(yàn)中，本小組在分離純化過(guò)程中，納他霉素?fù)p失十分小，實(shí)驗(yàn)非常成功！4討論在本實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試了通過(guò)搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素，加深了我們對(duì)好氧發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)與次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的關(guān)系的認(rèn)識(shí)，也積累代謝調(diào)控發(fā)酵及相關(guān)產(chǎn)品分離純化和分析檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)，這些是我們之前都沒(méi)有接觸過(guò)的。

15、我們小組的實(shí)驗(yàn)中，在發(fā)酵液培養(yǎng)期間，我們?cè)谂囵B(yǎng)時(shí)間為0h到120h中，每天都用顯微鏡觀察菌體生長(zhǎng)情況，隨著菌體生長(zhǎng)，菌體逐漸老化，孢子的數(shù)量也逐漸增多，菌絲開始斷裂，代謝產(chǎn)物的含量也越來(lái)越大（在本實(shí)驗(yàn)中，稍顯出指數(shù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)），讓我們更加深刻地了解菌體生產(chǎn)與次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的關(guān)系。在剛開始，雖然我們以前有用過(guò)顯微鏡進(jìn)行鏡檢操作，但是很多操作要點(diǎn)都忘記了，因此，老師讓我們嘗試鏡檢時(shí)，我們很多人都沒(méi)有成功，后來(lái)經(jīng)過(guò)多次的探索。我慢慢摸索到了竅門：1、取菌體的時(shí)候要記得打散，不然視野看上去會(huì)一片紅。2、染色時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則顯微鏡下看到視野也會(huì)看到紅色一片。3、蓋蓋玻片的時(shí)候，載玻片應(yīng)該保持濕潤(rùn)并把

16、蓋玻片輕輕地放在載玻片上，否則蓋玻片會(huì)貼不牢固或者有氣泡。4、用酒精燈烘干時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則載玻片會(huì)焦等等。另外，在次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化中，我們小組最終得到了0.35g/L的納他霉素。據(jù)了解和比較，在搖瓶水平下，能達(dá)到這個(gè)值已經(jīng)是很不錯(cuò)了，這樣好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有賴于小組每一位成員的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)態(tài)度和相互之間的融洽的配合與合作，更要感謝為我們準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品和一切事項(xiàng)的李老師和循循善誘給我們教導(dǎo)的雷德柱老師！萬(wàn)分感謝！5.思考題5.1 種子液菌球與發(fā)酵液菌球在形態(tài)上有什么區(qū)別？為什么會(huì)有這種區(qū)別？種子液菌球的菌絲較發(fā)酵液菌球的菌絲短，其孢子呈圓形，為鏈狀。整個(gè)菌球形狀比較松散。而發(fā)酵液菌球的菌絲比較長(zhǎng)，菌球大而緊密。造成這種區(qū)別的原因是：種子液與發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)成分不同，可能是發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)成分使其逐漸形成形態(tài)上的差異。5.2納他霉素的分離純化中需要兩次調(diào)節(jié)pH值，其目的和作用分別是什么？第一次調(diào)pH值：濕菌泥加2倍體積95%的乙醇，20%氫氧化鈉，pH調(diào)至10-10.5，其目的是使納他霉素充分溶解。第二次調(diào)pH值：用鹽酸調(diào)至pH6.5，其目的是使納他霉素在等電點(diǎn)出沉淀洗出。5.3各時(shí)期取樣觀察到的菌絲形態(tài)、還原糖含量、氨基氮含量和產(chǎn)物產(chǎn)量之間有什么關(guān)聯(lián)性？菌體適應(yīng)發(fā)酵液的環(huán)境后，隨著適應(yīng)時(shí)間增加，菌體逐漸生長(zhǎng)，菌絲逐漸增長(zhǎng)且變成菌絲球，其次級(jí)代謝產(chǎn)物如還原糖含量、氨基氮