考馬斯亮藍(lán)測蛋白實驗報告(參考資料)

1、實驗二：分光光度計的學(xué)習(xí)之考馬斯亮藍(lán) G-250法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)含量定實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)分光光度計的基本原理和使用方法，并使用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì) 含量。實驗原理考馬斯亮藍(lán) G-250( Coomassie brilliant blue G-250)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm 當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸 收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其 結(jié)

2、合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單， 操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為 01 000卩g/mL是一種常用的微量蛋白質(zhì) 快速測定方法。三實驗材料1. 實驗材料：未知濃度的牛血清樣品2. 主要儀器：試管、移液槍、分光光度計等。3. 試劑：蛋白試劑考馬斯亮藍(lán) G-250的配制：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250, 溶于50mL9%乙醇中，加入85%(V/V)的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1 000mL此溶液在常溫下可放置一個月。四實驗步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取6支10mL干凈的試管，按表

3、1取樣。搖勻后放置2min，用 1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長下比色，記錄測定的光密度 OD595nm并做標(biāo)準(zhǔn) 曲線。表1低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作菖玄僅倍巷考，険恨負(fù)腳可刪徐管號0123451mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白(ml)00.020.040.060.080.10蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán) G-250 (ml)555555蛋白濃度(mg /ml )00.020.040.060.080.10OD 595nm00.3390.4910.6010.7750.799上圖數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:0D值y = 7.7329x+ 04U2 OD值一線性(OD值R 0.9277擬合標(biāo)準(zhǔn)方程：y

4、=7.7329x+0.11422 未知蛋白質(zhì)濃度的測定另取2支10mL試管，按下表取樣。吸取測定液 O.ImL,蒸餾水0.9 mL放入試 管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后用1cm光 徑比色杯在595nm下比色，記錄光密度OD595nm并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測品提 取液中蛋白質(zhì)的含量X(卩g)。以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號試管做空白。五實驗結(jié)果待測樣品的吸光度1為0.240，待測樣品的吸光度2為0.266，平均值為0.253 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得知X為0.0018，所以濃度為0.018 mg /ml。六、實驗分析（一）經(jīng)測量得每毫升測定液中蛋白質(zhì)的含量很低，是樣品本身蛋白含量少還是實驗操作造成，還需進(jìn)一步分析。（二）考馬斯亮藍(lán)法測定未知蛋白濃度： 優(yōu)點：1、靈敏度高；2、測定快速、簡便，只需要加入一種試劑；3、干擾物質(zhì)少。缺點：一般分光光度法都有較大的機(jī)器誤差（重復(fù)性較差），為了數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，需 要每次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。七、注意事項1. 在測量前應(yīng)把分光光度計預(yù)熱半小時， 打開開關(guān)時，先確定開關(guān)按鈕的置，切 不可憑直覺亂摸。2. 稱量樣品前，電子天平要歸零，稱量時要精準(zhǔn)。3. 溶液一定要配制準(zhǔn)確，以防影響實驗效果，保證點在一條直線上。4. 在作標(biāo)準(zhǔn)