灌注后細(xì)胞凋亡分析論文_優(yōu)秀論文

1、 灌注后細(xì)胞凋亡分析論文【論文關(guān)鍵詞】缺血再灌注；凋亡；丹參；中藥；綜述【論文摘要】細(xì)胞過(guò)度凋亡參與了缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)的發(fā)生。我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參可在細(xì)胞、分子、基因水平調(diào)控IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的發(fā)生, 從而對(duì)IRI具有良好的防治作用。在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)造成的細(xì)胞死亡形式中, 凋亡也是一種常見(jiàn)而重要的形式1-4。組織細(xì)胞一旦壞死, 目前人們尚無(wú)辦法干預(yù)；但細(xì)胞凋亡是受一系列程序控制的過(guò)程, 人們有可能通過(guò)干預(yù)死亡程序加以挽救。丹參經(jīng)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí), 對(duì)IRI時(shí)細(xì)胞過(guò)

2、度凋亡有抑制作用, 本文就此方面的內(nèi)容予以綜述。1丹參對(duì)IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的抑制作用Wu.W等5利用原位細(xì)胞凋亡標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabeling,TUNEL)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到：左大腦中動(dòng)脈結(jié)扎后24h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆?fàn)詈巳毖獏^(qū)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞, 2448h達(dá)到高峰；預(yù)先給予丹參則在相應(yīng)部位只見(jiàn)到少量凋亡細(xì)胞；且與對(duì)照組比較, 24h時(shí)間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)腦IRI發(fā)揮保護(hù)作用。丹參是否對(duì)其他器官也有類(lèi)似作用目前尚未明了。2丹參抑制IRI時(shí)細(xì)胞凋亡

3、的作用機(jī)制21減少蛋白酶表達(dá)細(xì)胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)是激活以蛋白酶-白介素-1轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1-convertingenzyme,ICE)組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為175KD的IL-1, 屬于ICE蛋白酶超家族。目前已發(fā)現(xiàn)13個(gè)成員, 根據(jù)其序列同源性分為3個(gè)亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結(jié)合和酶促序列, 在天冬氨酸后將底物降解, 故該酶現(xiàn)被稱(chēng)為半胱天冬蛋白酶(cysteineapartate-specificproteinase,caspase), 并把上述三個(gè)亞家族分別稱(chēng)為caspase

4、-1、caspase-2和caspase-3亞家族。它們的過(guò)度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生6。張金濤等7利用S-P免疫組化法發(fā)現(xiàn), 前腦IRI后1d, 大鼠海馬CA1、CA4區(qū)出現(xiàn)明顯的ICE免疫陽(yáng)性反應(yīng), 第3天達(dá)高峰, 第5天后明顯減少；腦皮質(zhì)也呈現(xiàn)出與海馬區(qū)類(lèi)似的現(xiàn)象, ICE免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞散在分布。與此相反, 丹參組ICE的表達(dá)明顯減少, 特別是大腦皮層區(qū)和海馬CA1區(qū)。因此, 作者認(rèn)為ICE在腦缺血中可能發(fā)揮重要的凋亡調(diào)節(jié)作用；丹參能下調(diào)腦缺血區(qū)ICE表達(dá), 從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。22阻斷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)大多數(shù)情況下, 來(lái)自于細(xì)胞外的誘導(dǎo)因素, 如自由基、細(xì)菌、病毒等作用于細(xì)胞

5、后轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡信號(hào), 并通過(guò)胞內(nèi)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終激活細(xì)胞死亡程序, 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此, 凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核DNA片段化斷裂及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)6。丹參經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí), 可干預(yù)下列已知的凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 從而實(shí)現(xiàn)其抗凋亡作用。221死亡因子及其受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas配體、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)性配體(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL或Apo2L)和Apo3L能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 因此被稱(chēng)為死亡因子6。介導(dǎo)它們誘導(dǎo)凋亡的受體為死亡受體。在體內(nèi), TNF主要由巨噬細(xì)胞(M)分泌。

6、大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明, 丹參不僅可有效抑制M分泌TNF-, 還可以在基因水平抑制TNF-在肝、腎、心等組織中的蛋白表達(dá)8,9,10,18。所以, 丹參可能通過(guò)抑制TNF-的生成和釋放, 減少I(mǎi)RI時(shí)細(xì)胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-B還是JNF/AP-1則目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。222第二信使鈣誘導(dǎo)的凋亡Ca2+是細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中重要的信息分子。Ca2+i持續(xù)升高可使核酸內(nèi)切酶激活, DNA片段化。應(yīng)用膜聯(lián)蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗放大系統(tǒng)顯微熒光測(cè)定術(shù)同步觀(guān)察H2O2誘導(dǎo)人類(lèi)肝細(xì)胞(LO2細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞(EVC304)凋亡

7、時(shí)不同時(shí)限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：H2O2作用后05h即出現(xiàn)Ca2+躍升現(xiàn)象；當(dāng)Ca2+i400nmol/L后1h出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡膜翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象, 即磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層；此后, Ca2+i持續(xù)升高, 早期凋亡細(xì)胞(Annexia-V+)、死亡細(xì)胞(PI+)指數(shù)均上升；熒光顯微鏡下出現(xiàn)大量綠色熒光的早期凋亡細(xì)胞和胞漿或胞核紅染的死亡細(xì)胞。同時(shí)Ca2+i上升了一個(gè)數(shù)量級(jí)；在Rax處理組H2O2作用8h后Ca2+i尚未超過(guò)400nmol/L, 與對(duì)照組比較差異顯著(P400nmol/L很可能是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的早期信號(hào)。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn), 由此

8、可能減少其在核內(nèi)促進(jìn)凋亡基因信號(hào)傳遞中的作用及其后引起的細(xì)胞凋亡, 減輕細(xì)胞損傷。分析其機(jī)理可能是：作為咖啡酰縮酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基, 可和H2O2發(fā)生氧化反應(yīng), 接受O-生成羧基-COOH, 從而直接減輕H2O2對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的損傷, 減少Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滲漏入細(xì)胞內(nèi)；因肝細(xì)胞Ca2+內(nèi)流由鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物和IP3敏感鈣池共同調(diào)節(jié)。故Rax對(duì)LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白受體, 阻止受體操縱性鈣通道開(kāi)放所致11。223由線(xiàn)粒體損傷后啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡新近的研究證實(shí), 由活性氧(ROS)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發(fā)細(xì)胞凋亡

9、的重要觸發(fā)機(jī)制11,12。當(dāng)這些死亡信號(hào)到達(dá)線(xiàn)粒體后, 首先引起線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換并釋放凋亡相關(guān)蛋白, 包括細(xì)胞色素C(cyt-C)及caspase-3等, cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結(jié)合及caspase-9的激活, 后者繼而激活caspase-3, 從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。IRI時(shí)ROS生成過(guò)多, 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載, 線(xiàn)粒體受損, 誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度凋亡6。丹參具有強(qiáng)大的清除自由基、減輕鈣超載、保護(hù)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整等作用, 因而可切斷上述誘導(dǎo)因素的產(chǎn)生, 阻斷了此通路啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡13-15,17。23調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)細(xì)胞凋亡是級(jí)聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果。目前已知細(xì)胞凋

10、亡相關(guān)基因多達(dá)數(shù)十種, 根據(jù)功能不同分為三類(lèi)：抑制凋亡基因, 如EIB、ZAP、Bcl-2, 其中對(duì)Bcl-2的研究最為詳細(xì)而系統(tǒng)；促進(jìn)凋亡基因, 如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調(diào)控基因, 如J-myc、Bclk等。正常情況下, 促進(jìn)凋亡基因與抑制凋亡基因處于協(xié)調(diào)的對(duì)立統(tǒng)一狀態(tài), IRI時(shí)這種平衡被打破, 組織細(xì)胞凋亡增多2。張金濤等7報(bào)道BcL-2在前腦缺血2h就有表達(dá), 于6h達(dá)高峰, 其后減少。此變化以海馬CA1區(qū)最為顯著。說(shuō)明BcI-2主要在細(xì)胞凋亡早期發(fā)揮作用。丹參在缺血30min給予后, BcL-2的表達(dá)明顯增加。趙明中等15采用心肌IRI模型, 以TUNEL及S-P免疫

11、組化法進(jìn)一步證實(shí)復(fù)方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)(PEI)明顯增加, 還可使心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Fas蛋白PEI下降。且隨著復(fù)方丹參滴丸的劑量加大而進(jìn)一步降低(P綜上所述, 丹參作用廣泛, 對(duì)IRI細(xì)胞凋亡各環(huán)節(jié)都有調(diào)節(jié)作用, 從細(xì)胞、分子及基因水平阻斷了IRI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中因細(xì)胞凋亡引起的一系列“惡性循環(huán)”, 從而表現(xiàn)出對(duì)IRI顯著的保護(hù)作用。因此, 丹參對(duì)減輕IRI來(lái)說(shuō)是一種十分理想的藥物, 在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景；同時(shí)丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過(guò)度引起的疾病提供了一條新思路。參考文獻(xiàn)1冷靜,彭韜,馮振卿,等.大鼠缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的研究.江蘇醫(yī)藥,

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