生物化學技術實驗

1、生物化學技術實驗部分生物化學技術實驗部分 (2010版版) 生物化學研究的核心任務：生物化學研究的核心任務： 闡明闡明生命現(xiàn)象生命現(xiàn)象的的分子機理分子機理。 生物組織生物組織 無細胞提取液無細胞提取液 破碎、溶破碎、溶 解、差速離心、過濾解、差速離心、過濾 精制后的蛋白質精制后的蛋白質 一、蛋白質的性質：一、蛋白質的性質： 二、分離純化蛋白質的主要方法二、分離純化蛋白質的主要方法 （一）根據(jù)溶解度差異分離：選擇性沉淀（一）根據(jù)溶解度差異分離：選擇性沉淀 法法 等電點沉淀法 鹽析法 有機溶劑沉淀法 利用生化物質在不同濃度利用生化物質在不同濃度 的有機溶劑中溶解度差異而分離的有機溶劑中溶解度差異而

2、分離 的方法的方法。 降低水活性，使溶液的降低水活性，使溶液的介電常數(shù)介電常數(shù)下降，增加下降，增加蛋白質溶質蛋白質溶質分子之分子之間間 的作用力，因而聚集在一起。的作用力，因而聚集在一起。 Membrane protein 有機溶劑沉淀法 Water-soluble protein 溶 解 度 Water-soluble protein -+ + + + + - - - - - -+ + + + + - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + - + - + + + + + - - - -+ + + + + - - - - - -+ + + + + -

3、- - - - 有 機 溶 劑 Solvent % = hydrophilic 分辨力比鹽析法高，溶劑易于除去和回收。分辨力比鹽析法高，溶劑易于除去和回收。 易使某些蛋白質或酶變性。易使某些蛋白質或酶變性。 乙醇、丙酮乙醇、丙酮 丙酮沉淀能力比較強丙酮沉淀能力比較強 溫度的控制溫度的控制 有機溶劑的選擇有機溶劑的選擇 pH值的選擇值的選擇 離子強度的選擇離子強度的選擇 分離溶液濃度的控制分離溶液濃度的控制 及時處理沉淀物及時處理沉淀物 全部操作過程應在全部操作過程應在低溫低溫條件進行，而且最好在條件進行，而且最好在同一溫度同一溫度 下進行。下進行。 加入的有機溶劑溫度要加入的有機溶劑溫度要預冷

4、預冷。 pH值影響蛋白質在有機溶劑中值影響蛋白質在有機溶劑中溶解度溶解度，分級，分級 沉淀時更應嚴格控制沉淀時更應嚴格控制pH值。應選擇值。應選擇pH值在等值在等 電點（電點（PI）附近。）附近。 離子強度達到一定程度時，能增加蛋白質或離子強度達到一定程度時，能增加蛋白質或 酶 在 有 機 溶 劑 中 的 溶 解 度 。 離 子 強 度酶 在 有 機 溶 劑 中 的 溶 解 度 。 離 子 強 度 0.05mol/L為好，過大則需更多的有機溶劑為好，過大則需更多的有機溶劑 來沉淀。來沉淀。 由鹽析法沉淀得到的蛋白質或酶，用有機溶由鹽析法沉淀得到的蛋白質或酶，用有機溶 劑沉淀前，一定要劑沉淀前，

5、一定要先透析除鹽先透析除鹽。 蛋白質濃度愈大，加入有機溶劑后，蛋白質沉淀蛋白質濃度愈大，加入有機溶劑后，蛋白質沉淀 量就愈多。量就愈多。 蛋白質濃度大時，可減少變性，節(jié)省有機溶劑用蛋白質濃度大時，可減少變性，節(jié)省有機溶劑用 量。量。 濃度過大，共沉淀現(xiàn)象增加，濃度過大，共沉淀現(xiàn)象增加，不利于分級沉淀。不利于分級沉淀。 沉淀物要立即用水或緩沖液溶解，沉淀物要立即用水或緩沖液溶解， 降低有機溶劑的濃度。降低有機溶劑的濃度。 （二）、根據(jù)（二）、根據(jù) 分子大小和形狀的差異分子大小和形狀的差異分離分離 透析和超濾法：除去小分子物質透析和超濾法：除去小分子物質 半透膜阻留半透膜阻留pr分子，分子， 而讓

6、小的溶質分子和而讓小的溶質分子和 水通過，以達到除去水通過，以達到除去 蛋白質溶液中小分子蛋白質溶液中小分子 （鹽、低分子酸等）。（鹽、低分子酸等）。 施以一定的壓力使小施以一定的壓力使小 分子溶質通過一半透分子溶質通過一半透 膜，而按半透膜的篩膜，而按半透膜的篩 孔大小截留相應的蛋孔大小截留相應的蛋 白質分子白質分子 沉降的速度與顆粒的大小沉降的速度與顆粒的大小 和密度有關。和密度有關。離心后按其離心后按其 沉降的速度不同，彼此分沉降的速度不同，彼此分 開形成區(qū)帶。再進行光學開形成區(qū)帶。再進行光學 定位，針刺或冰凍切片采定位，針刺或冰凍切片采 樣分析樣分析 密度梯度離心法密度梯度離心法 凝膠

7、過濾層析的原理凝膠過濾層析的原理: 介質：交聯(lián)葡聚糖（介質：交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（ Bio-Gel P ，），） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-Gel A） 凝膠過濾法凝膠過濾法 支持物的選擇：支持物的選擇： （三）（三） 根據(jù)電荷性質的差異分離根據(jù)電荷性質的差異分離 1、電泳和等電聚焦法：電泳和等電聚焦法： 普通電泳、等電聚焦、雙向電泳普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細管脈沖電泳、毛細管 電泳電泳 支持物支持物：PAGE 、瓊脂糖膠等瓊脂糖膠等 Polyacrylamide Gel Electrophoresis (

8、PAGE) Molecules are separated by size and charge in an electric field. Isoelectric Focusing relies on the migration of charged proteins in an electric field 等電聚焦法等電聚焦法 2、離子交換層析法、離子交換層析法 基質：纖維素、交聯(lián)葡聚糖、樹脂基質：纖維素、交聯(lián)葡聚糖、樹脂 電荷基團：電荷基團： 陽離子交換劑陽離子交換劑 （四）（四） 配體親和力的差異配體親和力的差異 ： 親和層析親和層析 親和層析作用機理親和層析作用機理： (1)(2)

9、(3) A B Sample WashingElution XB 配體配體 X B AA 分離純化一定數(shù)量的游離配體 載體活化 配體與載體偶聯(lián) Activity 親和層析圖譜： Elution volume Protein pH 2.05 * （五）（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography) HPLCHPLC的特點：的特點： 1.1.支持介質顆粒細，比表面積大。支持介質顆粒細，比表面積大。 2.2.溶劑系統(tǒng)采取高壓，洗脫速度增大。溶劑系統(tǒng)采取高壓，洗脫速度增大。 HPLCHPLC是一項快速、靈敏、高效的分離技術。是一項快速、

10、靈敏、高效的分離技術。 親和層析純化胰蛋白酶 手腦并用，知行合一 - -HN-CH-CO-NH-CH-CO-HN-CH-CO-NH-CH-CO- R1R1R2R2 CHOM的理化性質的理化性質 （分離純化的依據(jù)）（分離純化的依據(jù)） CHOM的性質的性質 （作為親和層析配體純化胰蛋白酶的依據(jù)）（作為親和層析配體純化胰蛋白酶的依據(jù)） 親和層析純化胰蛋白酶的效果親和層析純化胰蛋白酶的效果 依依 據(jù)據(jù) 方方 法法 實驗內(nèi)容提要實驗內(nèi)容提要 1. 雞卵類粘蛋白的制備雞卵類粘蛋白的制備 雞卵類粘蛋白粗品的制備雞卵類粘蛋白粗品的制備 雞卵類粘蛋白粗品的精制雞卵類粘蛋白粗品的精制 2.親和吸附劑的合成親和吸附

11、劑的合成 載體的活化載體的活化 配體與載體的偶聯(lián)配體與載體的偶聯(lián) 親和吸附劑的裝柱親和吸附劑的裝柱 3. 豬胰蛋白酶粗提液的制備及酶的精制豬胰蛋白酶粗提液的制備及酶的精制 豬胰蛋白酶原的提取豬胰蛋白酶原的提取 胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活 上親和層析柱純化上親和層析柱純化 三大任務三大任務 N項注意項注意 需要得到的結果需要得到的結果 0 20 40 60 80 100 120 140 160 051015202530 * *DE-32DE-32纖維素離子交換柱層析分纖維素離子交換柱層析分 離雞卵類粘蛋白的層析圖離雞卵類粘蛋白的層析圖 0 20 40 60 80 100 120 140 1

12、60 05101520 * * 繪制親和層析分離胰蛋白酶的層析圖繪制親和層析分離胰蛋白酶的層析圖 0 50 100 150 200 0510152025 pH 0.2mol/L Na2HPO4/ml 0.2mol/L NaH2PO4/ml pH 0.2mol/L Na2HPO4/ml 0.2mol/L NaH2PO4/ml 5.88.092.07.061.039.0 6.012.387.77.272.028.0 6.426.573.57.481.019.0 6.531.568.57.687.013.0 6.637.562.57.891.58.5 6.849.051.08.094.75.3 磷酸

13、氫二鈉磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液磷酸二氫鈉緩沖液 （0.2mol/L,pH5.8-8.0） （25） 0.2mol/L磷酸氫二鈉：磷酸氫二鈉：Na2HPO412H2O 71.64g/1,000ml 0.2mol/L磷酸二氫鈉：磷酸二氫鈉：NaH2PO42H2O 31.21g/1,000ml 50毫升雞蛋清毫升雞蛋清+50毫升毫升10% 三氯醋酸三氯醋酸的鹽溶液，產(chǎn)生白的鹽溶液，產(chǎn)生白 色沉淀，色沉淀，pH應為應為3.5。 室溫靜置室溫靜置4小時以上，小時以上，3000 轉轉/分分 離心離心10分鐘。上清液分鐘。上清液 用濾紙過濾。用濾紙過濾。pH為為3.5。 緩慢加入緩慢加入3倍體積的預冷丙

14、倍體積的預冷丙 酮。在冰浴中靜置酮。在冰浴中靜置4小時。小時。 2、Sephadex G-25凝膠層析脫鹽凝膠層析脫鹽 稱取稱取30克克Sephadex G-25，用，用 0.02mol/L,pH6.5磷酸緩沖液磷酸緩沖液 室溫溶脹室溫溶脹24小時。小時。 真 空 脫 氣 后 裝 柱 ， 用真 空 脫 氣 后 裝 柱 ， 用 0.02mol/L,pH6.5磷酸緩沖液磷酸緩沖液 平衡柱床，直至記錄儀繪出平衡柱床，直至記錄儀繪出 穩(wěn)定基線。穩(wěn)定基線。 取取20毫升雞卵類粘蛋白粗提液上柱脫鹽（上樣量不超過柱床體毫升雞卵類粘蛋白粗提液上柱脫鹽（上樣量不超過柱床體 積的積的1/6），用），用0.02mo

15、l/L,pH6.5磷酸緩沖液洗脫，收集第一峰。磷酸緩沖液洗脫，收集第一峰。 1. 雞卵類粘蛋白的制備雞卵類粘蛋白的制備 稱取稱取DE-32粉粉10克，用克，用150ml 0.5mol/L NaOH- 0.5mol/L NaCl溶液浸泡溶液浸泡20分鐘，抽濾，用蒸餾水分鐘，抽濾，用蒸餾水 洗至中性后，抽去水分。洗至中性后，抽去水分。 用用150ml 0.5mol/L HCl 溶液浸泡溶液浸泡20分鐘，抽濾，分鐘，抽濾， 用蒸餾水洗至中性后，抽去水分。用蒸餾水洗至中性后，抽去水分。 用用150ml 0.02mol/L,pH6.5的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液浸泡浸泡10分分 鐘，脫氣裝柱。鐘，脫氣裝柱。

16、 將 脫 鹽 后 的 雞 卵 類 粘 蛋 白 粗 提 液將 脫 鹽 后 的 雞 卵 類 粘 蛋 白 粗 提 液 上 柱上 柱 ， 以， 以 0.02mol/L,pH6.5的磷酸緩沖液洗去雜蛋白。的磷酸緩沖液洗去雜蛋白。 用用0.3mol/L NaCl-0.02mol/L pH6.5磷酸緩沖液磷酸緩沖液洗洗 脫，收集第二峰。脫，收集第二峰。 將經(jīng)將經(jīng)DE-32純化的雞卵類粘蛋白溶液裝入純化的雞卵類粘蛋白溶液裝入透析袋透析袋 內(nèi)，用蒸餾水內(nèi)，用蒸餾水透析透析，直到用，直到用1%硝酸銀硝酸銀檢查無氯檢查無氯 離子為止。離子為止。 調調pH至至4.0,加加3倍體積的預冷丙酮，冰浴靜置倍體積的預冷丙酮，

17、冰浴靜置4小小 時以上，離心取沉淀，即得雞卵類粘蛋白純品。時以上，離心取沉淀，即得雞卵類粘蛋白純品。 標準胰蛋白酶比活性的測定 CHOM粗品/純品抑制比活性的測定 CHOM純品的要求： 品質：比活力8,000 BAEE unit/mg protein 數(shù)量： 200mg 載體載體Sepharose 4B的活化的活化 稱取稱取12克（濕重）克（濕重）Sepharose 4B 凝膠凝膠，用，用100ml 0.5mol/NaCl溶液淋溶液淋 洗，再用蒸餾水洗去洗，再用蒸餾水洗去NaCl，抽干。，抽干。 加加10ml 2mol/L NaOH, 5ml環(huán)氧氯丙烷，環(huán)氧氯丙烷，5ml乙晴。室溫下攪拌活化乙

18、晴。室溫下攪拌活化 16-20小時。小時。 用蒸餾水洗去未反應得殘留試劑，再用用蒸餾水洗去未反應得殘留試劑，再用0.1mol/L pH9.5 NaCO3緩沖緩沖 液液洗滌洗滌,處理好待用。處理好待用。 一步都不能出錯！ 不要忘記測定和計算！ 用用10毫升毫升0.1mol/L pH9.5 NaCO3緩沖液緩沖液溶解雞卵類粘蛋白，加入到溶解雞卵類粘蛋白，加入到 活化好得活化好得Sepharose 4B凝膠中，室溫下，攪拌凝膠中，室溫下，攪拌20-24小時。小時。 偶聯(lián)終止后，抽濾。用偶聯(lián)終止后，抽濾。用0.5mol/NaCl溶液洗去未被偶聯(lián)的雞卵類粘溶液洗去未被偶聯(lián)的雞卵類粘 蛋白，再用蒸餾水洗去

19、蛋白，再用蒸餾水洗去NaCl。 用用0.1mol/L甲酸甲酸-0.5mol/LKCl,pH2.5的溶液洗，破壞殘存的環(huán)氧基。的溶液洗，破壞殘存的環(huán)氧基。 再用蒸餾水洗至中性。再用蒸餾水洗至中性。 用用30毫升親和柱平衡液浸泡毫升親和柱平衡液浸泡10分鐘，脫氣裝柱。分鐘，脫氣裝柱。 一步都不能出錯！ 不要忘記測定和計算！ 豬胰蛋白酶粗提液的制備及酶原的激活 取胰臟取胰臟50克，加克，加150毫升預冷的毫升預冷的乙酸酸化水乙酸酸化水，用，用組織搗碎機組織搗碎機搗碎。搗碎。 勻漿。在勻漿。在5-10提取提取4小時以上。四層紗布過濾。濾液用小時以上。四層紗布過濾。濾液用2.5mol/L H2SO4調調

20、pH2.5-3.0。靜置。靜置2-4小時，過濾收集濾液就是胰蛋白酶粗提小時，過濾收集濾液就是胰蛋白酶粗提 液。液。 酶原粗提液用酶原粗提液用NaOH調節(jié)調節(jié)pH8.0,加入固體加入固體CaCl2使溶液的使溶液的Ca+濃度達濃度達 到到0.1mol。 加加2mg結晶豬胰蛋白酶結晶豬胰蛋白酶，攪勻，于，攪勻，于4冰箱中激活冰箱中激活12-16小時。小時。 待酶比活力達到待酶比活力達到800-1000BAEE/mg停止激活，用停止激活，用2.5mol/L H2SO4調調 pH2.5-3.0，濾去，濾去CaSO4沉淀物，備用。沉淀物，備用。 不要忘記測定和計算！不要忘記測定和計算！ 親和吸附劑裝柱親和

21、吸附劑裝柱上樣上樣洗脫洗脫 親和層析純化胰蛋白酶 不要忘記測定和計算！不要忘記測定和計算！ 品名 價格 Sepharose 4B 4100元元/1L DEAE-32 cellulose 2600元元/100g Sephadex G-25 1800元元/100g Acetone 講授實驗原理及操作講授實驗原理及操作 清洗用具、配制試劑（注意貼好標簽）清洗用具、配制試劑（注意貼好標簽） 提取提取CHOM(做到丙酮沉淀做到丙酮沉淀CHOM，過夜），過夜） 溶脹溶脹Sephadex G-25 （干粉）（干粉） Sephadex G-25洗滌裝柱（已溶脹）洗滌裝柱（已溶脹） 處理處理DEAE-32纖維素并裝柱纖維素并裝柱 測定標準胰蛋白酶活性測定標準胰蛋白酶活性 第一天第一天 理順思路！要做什么？怎么做？理順思路！要做什么？怎么做？ 第二天第二天 離心收集離心收集CHOM Sephadex G-25裝柱（溶脹裝柱（溶脹24小時后）小時后） 用用Sephadex G-25脫鹽脫鹽 提取第二份和提取第二份和第三份第三份CHOM DEAE-32離子交換層析純化離子交換層析純化CHOM 透析