細(xì)菌菌落總數(shù)檢測常見誤差原因分析

1、細(xì)菌總數(shù)監(jiān)測常見誤差分析細(xì)菌菌落總數(shù)是水源地和地面廢水樣品檢測必做的一項(xiàng)指標(biāo)。菌落總數(shù)檢 測同其他檢驗(yàn)一樣，也存在檢測誤差。平板計(jì)數(shù)法是細(xì)菌總數(shù)常用方法之 一， 因此，該值準(zhǔn)確與否直接關(guān)系水質(zhì)好壞。微生物平板計(jì)數(shù)的通常方法 為每個(gè)樣品用 3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度常做 3個(gè)重復(fù)。但如何對(duì)平板菌落進(jìn) 行正確計(jì)數(shù)、 3個(gè)稀釋度以哪一個(gè)稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)及微生物檢測允許誤差等 問題，在飼料標(biāo)準(zhǔn)中并未有所規(guī)定，而這些問題與統(tǒng)計(jì)值的準(zhǔn)確性密切相 關(guān)。我們就實(shí)際檢測芽孢桿菌工作中遇到一些菌落計(jì)數(shù)的問題，與大家進(jìn) 行探討。1材料與方法11試驗(yàn)材料111樣品：隨機(jī)抽取微生態(tài)飼料添加劑合生素樣品 3份。11 2 培養(yǎng)基

2、：營養(yǎng)瓊脂。113儀器設(shè)備：磁力攪拌器，無菌培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱，振蕩器。12 試驗(yàn)方法 121樣品的振蕩時(shí)間對(duì)菌數(shù)檢測的影響選擇1個(gè)樣品，稱取10 g，放人無菌錐形瓶內(nèi)，加入90 mL無離子水，磁力攪拌分別為10、20、30、40和60 rain。用1 mL移液槍從中吸取1 mL樣品懸濁液加入到盛有9 mL去離子水的試管中，用振蕩器使樣品充分均勻， 以此類推，制成10一1（一不同稀釋度的樣品溶液。平板涂布法檢測菌 含量：用移液槍從樣品稀釋液中各吸取 200 L,每個(gè)樣品稀釋液3個(gè)重復(fù)； 將平板倒置于3537 cC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。1.2. 2檢測方法對(duì)菌數(shù)檢測的影響各個(gè)樣品稱取10 g，放入無

3、菌錐形瓶內(nèi)，加入90 mL無離子水，磁力攪 拌分別為40 rain。并稀釋成1010不同稀釋度的樣品溶液。傾注平板 法檢測菌含量：用移液槍從各個(gè)平行樣品相應(yīng)稀釋液中各吸取1mL，每個(gè)樣品稀釋液3個(gè)重復(fù)，待培養(yǎng)基表面干燥后，將平板倒置于 35 37(2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24 h。平板涂布法檢測菌含量：用移液槍從各個(gè)平行樣品相應(yīng)稀釋 液中各吸取200 L涂布平板，每個(gè)樣品稀釋液3個(gè)重復(fù)；將平板倒置于35 37 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。2結(jié)果2. 1樣品的振蕩時(shí)間對(duì)菌數(shù)檢測結(jié)果的影響采用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)的方法，不同振蕩時(shí)間對(duì)合生素中芽孢桿菌檢出量 的結(jié)果見表1。從表I中可見：不同振蕩時(shí)間獲得的細(xì)菌菌落數(shù)量有

4、較大差 別。總體而言，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著振蕩時(shí)間的延長檢出有效菌含量增加， 說明細(xì)菌從載體上解析需要一定的時(shí)間；當(dāng)振蕩時(shí)間為40 rain后產(chǎn)品中的菌含量基本穩(wěn)定。采用適當(dāng)振蕩時(shí)間才能更精確的顯示產(chǎn)品中有效菌的含 量。表1震蕩時(shí)間對(duì)有效菌含量結(jié)果的影響/_. CFUTg震蕩時(shí)間對(duì)有效菌落含量結(jié)果的影響震蕩時(shí)間10分鐘20分鐘30分鐘40分鐘60分鐘含菌量2610.215143分析與討論3. 1樣品處理對(duì)結(jié)果的影響取樣時(shí)對(duì)樣品取樣口和取樣工具要消毒，防止樣品交叉污染供參考32樣品的均質(zhì)處理對(duì)結(jié)果的影響固體樣品要用均質(zhì)器或玻璃珠等充分均質(zhì)，也可在稀釋液中添加相應(yīng)溶解液f如吐溫80和液體石蠟等1的稀

5、釋液，以保證樣品的充分均質(zhì)。測定 芽孢桿菌活菌數(shù)時(shí)，不同振蕩時(shí)間獲得的細(xì)菌菌落數(shù)量有較大差別，因?yàn)?細(xì)菌從載體上解析并均勻分散到溶液中需要一定的時(shí)間，待測樣品應(yīng)在振 蕩器上充分振蕩，使得芽孢桿菌可以充分和均勻地分散到待測溶液中，避 免因?yàn)榫w未完全釋放而引起結(jié)果中細(xì)菌含量偏低的現(xiàn)象。33 試驗(yàn)過程中操作方法的影響加樣I mL時(shí)，用1 mL的吸管并且每做一個(gè)稀釋度都要換1支吸管，否則稀釋 度間菌落計(jì)數(shù)誤差會(huì)超過 10，說明存在操作誤差。用吸管向平皿里加樣， 平皿開口要小，吸管要直立且加樣結(jié)束后，讓吸頭接觸皿底干燥處，保證 加樣的體積不少。若采取傾注平板法時(shí)，平皿加樣后要及時(shí)傾注瓊脂，其間隔一般不

6、超過20 min f最好在10 min內(nèi)）。以瓊脂不燙手（約45C）為宜, 否則會(huì)殺滅細(xì)菌，太熱也會(huì)使冷凝水過多，影響細(xì)菌的生長。加入瓊脂要 及時(shí)搖勻，先向一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，然后向另一方向旋轉(zhuǎn)。這樣會(huì)減少菌落的 集聚和連片現(xiàn)象。另外，用力不要過大，使瓊脂不濺到H IL壁和肌蓋上， 保證計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確。當(dāng)瓊脂凝。當(dāng)瓊脂凝固后，要及時(shí)移人培養(yǎng)箱倒置 培養(yǎng)。若采用涂布平板法進(jìn)行檢測，放置適當(dāng)時(shí)間后，則立即將平皿翻轉(zhuǎn) 后放置培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，以避免菌落蔓延生長，難以計(jì)數(shù)。為保證結(jié)果 準(zhǔn)確，除作瓊脂的空白對(duì)照外，還要對(duì)菌落計(jì)數(shù)的全程做一對(duì)照。34 菌落計(jì)數(shù)誤差 菌落計(jì)數(shù)在完成培養(yǎng)后應(yīng)立即進(jìn)行，以防菌落繼續(xù)生

7、長蔓延從而影響測定 供參考結(jié)果。培養(yǎng)基中加入 TrC f 氯化一苯四氮唑 ） 可使細(xì)菌菌落顯紅色，這樣可 與同樣品顆粒和凝集物 （白色） 相區(qū)分，以提高菌落計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。有學(xué)者 認(rèn)為：100 mL培養(yǎng)基中加入23 mL的TTC可使菌落著色且不抑制細(xì)菌的生 長。菌落計(jì)數(shù)時(shí)要 2個(gè)人分別用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，取 2個(gè)人的平均 數(shù)報(bào)告菌落總數(shù)。一般來說，每平板含 20200個(gè)菌落的稀釋度的菌含量與 實(shí)際結(jié)果最接近，超過200個(gè)/平皿或小于2O個(gè)/平皿的計(jì)數(shù)結(jié)果則可能與 實(shí)際存在較大差別。因此，應(yīng)盡量選擇 20200個(gè)平皿的稀釋度進(jìn)行芽孢 桿菌的計(jì)數(shù)，保證菌落計(jì)數(shù)的有效性。報(bào)告結(jié)果要遵守國標(biāo)中菌落計(jì)數(shù)的 方法進(jìn)行。4小結(jié)菌落數(shù)檢測的誤差可能來自于多個(gè)方面。試驗(yàn)研究表明：除了檢測環(huán)境和 培養(yǎng)基之外，誤差主要來自于樣品和檢驗(yàn)的操作過程，包括檢驗(yàn)的準(zhǔn)備