SDS-PAGE蛋白電泳手冊(20210131061339)

1、蛋白電泳手冊 SDS-PAG及 Western blot 蛋白電泳 蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學分離純化技術之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下 ,向 著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象 .根據(jù)所采用的支持物不同 ,有瓊脂糖凝膠電泳 ,淀粉凝膠 電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中 ，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE由于無電滲作用，樣品用量少 （1-100卩g）,分辨率高，凝膠機械強度大，重復性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián) 劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點而受到廣泛的應用。 PAGE原 理 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 （簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N亞甲基雙丙烯酰胺（簡稱Bis） 在催化劑作用下

2、, 聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構的凝膠, 并以此為支持物進行電泳。 聚 丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn) 生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶。 SDS-PAG原 理 SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分 子結(jié)合成復合物, 使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷, 掩蓋了各種蛋白分子 間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS復合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和 分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱 SDS-PAGE。實驗使用過程中，還加入 D

3、TT或者*，以打開蛋白間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì) 的四級結(jié)構。SDS- PAGE最常采用垂直板不連續(xù)系統(tǒng)（分離膠與濃縮膠）。 索引 蛋白電泳（SDS-PAGE 電泳試劑總表 制膠 上樣及電泳 染色 蛋白提取 蛋白定量 Bradford 蛋白濃度測定試劑盒使用說明 BCA蛋白濃度測定試劑盒使用說明 Lowry 蛋白濃度測定試劑盒使用說明 蛋白分子量標準（圖） 考馬斯蛋白膠快速染色液 Western blot Western blotting DAB 檢測試劑盒 Western blotting ECL 化學發(fā)光檢測試劑盒 Western blotting 試劑盒使用說明 蛋白電泳試劑（部分試劑可以相

4、互替換） 系號 貨號 名稱 1 T8060 TRIS 三羥甲基氨基甲烷 G8200 Glycine 甘氨酸 3 S8010 SDS 十二烷基硫酸鈉 4 A8080 Acrylamide 丙烯酰胺 5 M8200 N,N-Methylene Bisacrylamide 甲叉雙丙烯酰胺 6 A8090 Ammonium Persulfate 過硫酸胺 7 D8220 DTT 二硫蘇糖醇 8 M8210 3 -Mercaptoethanol 3 -* 9 T8090 TEMED 四甲基 * 10 A1010 30%丙烯酰胺（ 29:1） 3 / 18 11 S1051 4XSDS-PAG分離膠緩沖液

5、（PH=8.8） 12 S1052 4XSDS-PAG濃縮膠緩沖液（PH=6.8） 13 P1016 4 X蛋白上樣緩沖液（含3 -*） 14 P1015 4 X蛋白上樣緩沖液（含DTT） 15 D1070 1M DTT 16 A1030 10%過硫酸氨 17 T1020 1M Tris-HCL （PH6.8） 18 T1010 1.5M Tris-HCL（PH8.8） S1010 10%SDS 20 T1070 5 x Tris-甘氨酸電泳緩沖液 SDS-PAGEffl今已形成成熟的方案，實驗室可根據(jù)自己的情況和習慣來選擇試齊V。如選擇1、 2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。

6、也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、 13/14、 16、 9、 20。還可選擇 10、 13/14、 16、 9、 17、 18、 19、 20。 一，制膠 凝膠配制表（一） 分離膠 12% 分離膠 10% 分離膠 8% 濃縮膠（ 3%） 總體積 10ml 10ml 10ml 5ml 4X 分離膠緩沖液（ PH8.8） 2.5ml 2.5ml 2.5ml 0 4X 濃縮膠緩沖液（ PH6.8） 0 1.25 30%丙烯酰胺 (29:1) 4ml 3.3 2.7 0.5 ddH2O 3.4ml 4.1ml 4.7ml 3.2ml 10%過硫酸銨 100ul 100ul 100ul 75

7、ul TEMED 10ul 10ul 10ul 7.5ul 凝膠配制表(二) 5 / 18 分離膠 12% 分離膠 10% 分離膠 8% 濃縮膠( 3%) 總體積 10ml 10ml 10ml 5ml 30%丙烯酰胺 (29:1) 4ml 3.3ml 2.7ml 0.5ml 1M Tris-HCL (PH6.8) 0 0 0 0.625ml 1.5M Tris-HCL(PH8.8) 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10%SDS 100ul 100ul 100ul 50ul ddH2O 3.3ml 4.0ml 4.6ml 3.75ml 10%過硫酸銨 100ul 100ul 100ul 75

8、ul TEMED 10ul 10ul 10ul 7.5ul 常規(guī)SDS-PAGR凝膠可按上表一或者表二配制。TEMED和10%過硫酸銨最后加，在加入前 需混勻前面所加試劑。10%過硫酸銨在4C有效期為一周，TEMED易揮發(fā)，使用后請蓋緊瓶 蓋。在常溫下膠30分鐘內(nèi)可以凝固，如溫度過低，可放37C溫箱凝固。灌完分離膠后，輕 輕的加 1ml ddH2O 封上層，膠凝固后可見到分界線。灌濃縮膠時，先傾去水層，再用吸紙 吸干。灌濃縮膠后立刻插入梳子。濃縮膠凝固后，放入電泳液中（讓電泳液漫過加樣孔 ），輕 輕的撥出梳子，可防加樣孔變形。 配制量可按上表等比加減。 如果所用膠濃度與上面不同， 可自行調(diào)整，

9、 主要是加減 30%丙烯 酰胺的量（需要濃度X總體積 /30%）,最后用水補足總體積。 ，上樣及電泳 取3體積蛋白樣品加入1體積4X蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴5分鐘。冷卻后離心取上 清上樣，一般還在樣品的相臨孔加上蛋白Marker。上樣前將5XTris-甘氨酸電泳緩沖液稀釋 成1X （100ml加入400ml雙蒸水混勻）。一般在濃縮膠時電壓80V,分離膠時電壓120V。在 目標蛋白跑到合適的地方，停止電泳。取下膠染色或者再進行下一步實驗。 注意事項 1. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標，否 則SDS結(jié)合量不足。 2. 用SDS聚丙烯酰胺

10、凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標準曲線。不能利 用這次的標準曲線作為下次用。并且SDS-PAGE定分子量有10%誤差，不可完全信任。 3. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（a -胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在 *和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。 4. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法 測相對分子量。 5. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。 三，染色 蛋白電泳完后，取出電泳玻璃板，小

11、心撬開玻板（一般膠會附在長玻板，即凹玻板一面）， 用刀片小心切開分離膠與濃縮膠的交界處。 丟棄濃縮膠， 再用刀在膠左右兩邊與玻板凸起交 界處各畫一刀， 放入電泳液中， 一般膠會自然滑入溶液中。可進行下一步染色。我公司所產(chǎn) 蛋白快速染色液，可在半小時內(nèi)染出結(jié)果，詳情請見附四（P1300）。 附一，蛋白提取 名稱 說明 R0010 高效RIPA組織/細胞裂解液 產(chǎn)品簡介：在普通 RIPA 的基礎上改進而來 ,含蛋白酶抑制劑及 * 酸酶抑制劑 （配有一支 PMSF）. R0020 RIPA組織/細胞裂解液 RIPA 經(jīng) 典 配 方 ， 適 于 絕 大 多 數(shù) 蛋 白 - 蛋 白 相 互 作 用 的

12、免 疫 實 驗 。 組 成：50 mM Tris-HCI （pH 7.4）, 150 mM NaCI, 1% NP-40, 0.1% SDS 配有一支 PMSF）保存：4 oC 避光 R0030 非變性組織 /細胞裂解液 非變性條件下裂解的蛋白產(chǎn)物最大限度地保留了蛋白的特性和功能，如抗原-抗體結(jié)合或酶 學活性，因此適宜于進行免疫共沉淀。 本系列試劑隨同配送一支 PMSF,請收到后-20C保存。RIPA裂解液4C保存，如發(fā)現(xiàn)有少量 沉淀，可常溫放置半小時，沉淀可消失，不影響使用。 操作步驟： 根據(jù)使用量，取每 1mlRIPA加入10ul PMSF。使PMSF的最終濃度為 1mM。混勻備用（PMS

13、F 現(xiàn)用現(xiàn)加）。 1 ，樣品前處理： a）對于細胞：貼壁細胞用PBS洗一遍，懸浮細胞直接離心收集，按照6孔板每孔細胞量加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。 b）對于組織樣品：把組織剪切成細小的碎片。按照每 20 毫克組織加入 150-250 微升裂解液 的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白 樣品，可以適當減少裂解液的用量 ） 。 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。 2，后處理： 將裂解后的樣品10000-14000g離心3-5分鐘（對應小離心機為16000轉(zhuǎn)），取上清，即可進 行后續(xù)的 PAGE、 W

14、estern 和免疫沉淀等操作。 注：本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑， 所以不適合于 Bradford 蛋白濃度測 定試劑盒，請選擇 BCA法或者Lowry法。 附二，蛋白定量 蛋白含量測定是以標準蛋白作為對照，根據(jù)蛋白濃度不同，吸光值不同而達到定量的目的。 有些方法是理解蛋白本身的吸光值 （紫外光譜吸收法） 來定量， 但更多的是用染料對蛋白進 后一種方法應用 行染色， 利用染料與蛋白結(jié)合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。 更普遍。 蛋白定量方法的選擇，應該考慮到蛋白結(jié)構(標準品選擇) 、蛋白溶液內(nèi)干擾物等因素的影 響。 貨號 名稱 組成 說明 PC0010 Bradfor

15、d 蛋白濃度測定試劑盒 5 X G250染色液 100ml 28C 干擾物質(zhì)少，Tris、糖、甘油、*、氨、EDTA等均不干擾測定。 BSA(5 mg/ml) 1ml -20oC PBS稀釋液 30ml 2-8C PC0020 BCA蛋白濃度測定試劑盒 BCA Reagent 100ml 2-8C BCA法的顯著優(yōu)點是不受去垢劑的影響。 Cu Reagent 3.0ml 28C BSA(5 mg/ml) 1ml -20oC PBS稀釋液 30ml 2-8C PC0030 Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒 Folin 酚甲試劑 A 200ml 2-8C Lowry 法測定較為不受脂類物質(zhì)干擾，適

16、于脂類含量較高的樣品測定。也能耐受相當濃度的 去垢劑如 SDS。 Folin 酚甲試劑 B 5ml 2-8C Folin 酚乙試劑 20ml 2-8C BSA(5 mg/ml) 1ml -20oC PBS稀釋液 30ml 28C 附三，蛋白分子量標準（圖） 附四，考馬斯蛋白膠快速染色液 （P1300） 考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液是一種即用型快速靈敏而且安全的染液，用于SDS ?PAGE或 者非變性膠的快速染色，在半小時內(nèi)就可以出結(jié)果。靈敏度達10ng。 使用方法： 1將電泳后的PAGE交（以8cm X 10 cm大小為例）取下放入容器中，加入50 ml雙蒸水或去 離子水，加熱至沸騰后停止， （

17、可選：繼續(xù)在脫色搖床上搖動 5 分鐘），棄去水溶液。 2加入20 ml至25 ml快速染色液（按盛膠容器的大小而定，以浸沒膠面為準），加熱至沸騰 后保持沸騰狀態(tài) 30-60 秒，停止加熱后繼續(xù)在脫色搖床上搖動 5-10 分鐘，棄去染色液（此 時蛋白條帶應已可見） 。 3加入約50 ml水，加熱至沸騰后保持沸騰狀態(tài)30-60秒，停止加熱后繼續(xù)在脫色搖床上搖 動 5-10 分鐘，換水即可完成脫色，觀察結(jié)果。 注意事項： 1 染色前的清洗步驟（第一步）中，水的質(zhì)量非常重要，質(zhì)量越好靈敏度越高，研究證明， 若用自來水加熱清洗，染色效果與靈敏度僅與常規(guī)甲醇考馬斯亮藍染色（分子克隆第二版） 相同。 2 脫

18、色時可用自來水清洗。 3 若要得到無背景的染色膠，可重復脫色步驟或?qū)⒛z放在水中過夜。 4經(jīng)本產(chǎn)品染色的 PAGE交，膠的縮漲度小于 5%,染色后的膠可在水中放置數(shù)月而無明顯脫 色。 5 每次加熱后,繼續(xù)在脫色搖床上搖動 5 分鐘,可增強染色效果。 6 本染色液有輕微腐蝕性,請帶手套操作。 Western blot 經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如*纖維素薄膜）上，固相載體以非共價 鍵形式吸附蛋白質(zhì), 且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。 以固相載體上的蛋 白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應, 經(jīng)過底物顯色或 * 自顯影以檢

19、測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分,此技術稱為 免疫印跡（ Western blot ）。 Western blotting 檢測系統(tǒng)除需要過氧化物酶標記的各種二抗外,還需要配套的顯色試劑。 索萊寶提供DAB顯色和ECL化學發(fā)光兩種試劑及相應試劑盒。 Western blotting DAB 檢測試劑盒 本試劑盒適合加一抗后的后續(xù)顯色。 操作簡單, 適合重組等高表達蛋白的檢測, 其敏感性不 如ECL法。 編號 名稱 說明 SW1010 Western blotting （ 小鼠 IgG）DAB 顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為小鼠 IgG。 SW10

20、20 Western blotting（ 兔 IgG）DAB 顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為兔 IgG。 SW1030 Western blotting（ 山羊 IgG）DAB 顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為山羊 IgG。 SW1040 Western blotting（小鼠/兔lgG）DAB顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 100ml 顯色液，適合一抗為小鼠和兔IgG。 試劑盒內(nèi)容： 1封閉試劑：30g（可配制400ml）脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。 2.10 倍濃縮抗體稀釋液， 50ml。 3.

21、HRP標記二抗，0.5ml，效價 1 : 500-3000。 4.20倍DAB濃縮顯色液，5mlA+5mlB。 Western blotting ECL 化學發(fā)光檢測試劑盒 本試劑盒適合加一抗后的后續(xù)顯色。敏感性比DAB高10倍。適合組織及細胞中常規(guī)蛋白的 檢測，但需有暗室等相關配套條件。 編號 名稱 說明 SW2010 Western blotting（小鼠 lgG）ECL顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為小鼠 IgG。 SW2020 Western blotting （兔 lgG）ECL顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為兔

22、 lgG。 SW2030 Western blotting（山羊 lgG）ECL顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為山羊 lgG。 SW2040 Western blotting（小鼠/兔IgG） ECL顯色試劑盒 可配制 250ml 二抗和 50ml 顯色液，適合一抗為小鼠和兔lgG。 試劑盒內(nèi)容： 1. 封閉試劑：30g（可配制400ml）脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。 2. 10 倍濃縮抗體稀釋液， 50ml。 3. HRP標記二抗，0.1ml，效價 1： 2000-5000。 4. ECL顯色液，25mlA+25mlB。 操作步聚 常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后，

23、 1. 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次 每次5min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的 SDS防止影響后面的抗體結(jié)合。 2. 按 5g 封閉試劑加 100ml 雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂 洗過的轉(zhuǎn)印膜，封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉30min。用TBS-T, PH7.6洗液，室溫漂洗3 次每次 5min。 3. 將10 x抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成 1 x （10ml 10 x抗體稀釋液加入 90ml雙蒸水，混勻， 可4C保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。 4. 用1X的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀

24、釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜 放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4C孵育過夜或 37C搖動孵育2h。此用過的抗體 一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條， 分別作好標記，分開孵育。 5. 用 TBS-T， PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次每次 5min。 6. 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋二抗。根據(jù)用量，DAB法按10ml抗體稀釋液加入20ul HRP標 記二抗（1: 500）的比例；ECL法按10ml抗體稀釋液加入 5ul HRP標記二抗（1: 2000）的 比例，配制二抗工作液，混勻。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口，37 C搖 動孵育1h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。 7. 用TBS-T, PH7.6洗液，室溫漂洗 3次每次10min。 8. 顯色: a）DAB顯色：配制 DAB顯色，根據(jù)用量，取 TBS-T 4ml加入DAB顯色液A、DAB顯色液B 各200ul，混勻，加在膜正面，室溫下顯色。在目標條帶顯出后，而且背景未出時，放入水