4744.葛根黃酮的分離和純化的研究論文正文

1、畢 業(yè) 論 文（設(shè)計(jì)） 題 目 葛根黃酮的分離和純化的研究 指導(dǎo)老師 專業(yè)班級(jí) 生物技術(shù)及應(yīng)用0701 姓 名 學(xué) 號(hào) 2010年5月30 日摘 要本研究通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)考察了四種樹(shù)脂的吸附解吸能力，確定樹(shù)脂x-5是分離葛根黃酮的最佳樹(shù)脂；通過(guò)考察藥液濃度，ph，洗脫溶劑，乙醇洗脫濃度等各種因素確定分離純化的最佳工藝是：藥液濃度為40mg/ml，將藥液ph調(diào)至酸性條件下進(jìn)行吸附，用70%乙醇作為洗脫劑。關(guān)鍵詞：葛根總黃酮；大孔吸附樹(shù)脂；藥液濃度；乙醇洗脫濃度目 錄引言11 材料和儀器.21. 1 實(shí)驗(yàn)材料 21. 2 實(shí)驗(yàn)儀器 22 實(shí)驗(yàn)方法 .32. 1 葛根黃酮粉末的制備 32. 2 標(biāo)

2、準(zhǔn)曲線制作 32 .3 大孔樹(shù)脂的篩選 32. 4 最佳分離工藝的篩選 43 結(jié)果與分析.53. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.53. 2 大孔樹(shù)脂的篩選 53. 3 最佳分離工藝的篩選 84 結(jié)論.10參考文獻(xiàn) .11引 言葛根為豆科植物野葛或粉葛的塊根，有山人參之美稱，其主要有效成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物1?，F(xiàn)代研究表明2：葛根總黃酮具有降低心肌耗氧量，增加冠狀動(dòng)脈腦血管流量，緩解心絞痛，抗心律失常，抗氧化，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，生津止渴等多種藥理作用，用于高血壓引起的頭痛、頭暈、耳鳴等癥狀有明顯療效。我國(guó)湖南、廣西、江西、山東及西南地區(qū)等均有豐富的葛根資源。一、葛根黃酮類化合物的分離

3、方法：1. 大孔樹(shù)脂法：崔九成等3用大孔樹(shù)脂分離葛根黃酮。將濃縮至1ml 相當(dāng)于0.5g 葛根藥材的提取物100ml，加入到50g 處理過(guò)的大孔樹(shù)脂柱上，用蒸餾水洗至流出液色變淡，再用70%乙醇洗脫至無(wú)葛根素，洗脫液回收乙醇濃縮并蒸干即得葛根總黃酮，收率為藥材總黃酮的84.58%。2. 鹽析純化法：將葛根粗提物加入蒸餾水后加熱煮沸，冷卻到室溫過(guò)濾，再將濾液中加入nacl后攪拌溶解，靜置2d析出白色沉淀,在過(guò)濾出沉淀并用少量水洗滌，得葛根異黃酮純品4。3. 鉛鹽沉淀法：李穩(wěn)宏等5用鉛鹽沉淀法對(duì)葛根黃酮進(jìn)行分離。將醇回流法所得濃縮物用95%乙醇溶解，加入飽和中性醋酸鉛溶液至不再有沉淀生成為止，過(guò)濾

4、，沉淀用水洗23次，棄去濾渣，濾液與洗液合并。再加入堿式醋酸鉛溶液，至不再有沉淀生成，將沉淀物干燥后懸浮于300ml 95%乙醇中，通入h2s脫鉛。過(guò)濾后，沉淀用醇洗23 次，合并濾液與洗液，調(diào)ph為6.57.0，減壓濃縮回收乙醇至50ml左右，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，真空干燥，得總異黃酮為淺棕色粉末。鉛鹽沉淀法得到的成品中總異黃酮含量高，可達(dá)62.81% ，但其收率較低。二、大孔樹(shù)脂吸附法6在各種分離純化方法中，大孔吸附樹(shù)脂法是因?yàn)槠浔容^環(huán)保和低廉倍受歡迎。大孔吸附樹(shù)脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸劑，是在離子交換劑和其它吸附劑應(yīng)用基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一類新型樹(shù)脂，為用于固體萃取而設(shè)計(jì)。樹(shù)脂一

5、般為小球狀，直徑為0.20. 8mm之間，是依靠它和被吸附的分子(吸附質(zhì))之問(wèn)的范德華引力，通過(guò)它巨大的比表面物理吸附而進(jìn)行的。合成吸附劑有大的比表面積和類似活性炭顆粒的內(nèi)細(xì)孔結(jié)構(gòu)，這些多孔特性使之從水溶液中有效的吸附有機(jī)化合物。與其它溶劑萃取技術(shù)相比用合成吸附萃取劑能減少溶劑的使用量和增加操作的安全性。與其他分離純化方法比較大孔樹(shù)脂吸附法所具有的優(yōu)點(diǎn)如下：1. 能縮小劑量，提高中藥內(nèi)在質(zhì)量和制劑水平。 2. 減少產(chǎn)品的吸潮性。 3. 大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)能縮短生產(chǎn)周期，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，免去了靜置沉淀、濃縮等耗時(shí)多的工作，節(jié)約包裝，降低成本，為中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)創(chuàng)造了條件。 本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察葛根總黃酮的

6、純化工藝，篩選出分離葛根總黃酮的最佳樹(shù)脂，通過(guò)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)與動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化分離純化工藝。1 材料和儀器11 實(shí)驗(yàn)材料葛根(購(gòu)于胡慶余堂)、乙醇、naoh、hcl、葛根黃酮標(biāo)準(zhǔn)樣品、d101樹(shù)脂、ab-8樹(shù)脂、x-5樹(shù)脂、nka-9樹(shù)脂、大孔樹(shù)脂柱12 實(shí)驗(yàn)儀器紫外分光光度計(jì) sp1910uv 上海光譜儀器有限公司ph計(jì) phs-3c 上海精密儀器廠搖床 qyc-200 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 re-52 上海安亭電子儀器廠2 實(shí)驗(yàn)方法2. 1 葛根黃酮粉末的制備7-8將葛根用組織破碎機(jī)破碎成粉末，稱取粉末20g，置于圓底燒瓶中，以固液比1:10加入75%的乙醇200ml，80水浴提取3次

7、，每次1.5h。收集提取液濃縮并干燥成粉末。2. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取干燥至恒重的葛根素5mg，于25ml容量瓶中，加95%乙醇溶解并稀釋至刻度精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9m1分別置于10ml容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以此溶劑做空白對(duì)照，在250nm處測(cè)定吸光度。2. 3 大孔樹(shù)脂的篩選9-102.3.1 靜態(tài)吸附取4種處理好的大孔樹(shù)脂各10g，分別加入葛根水溶液30ml，放置于搖床中進(jìn)行振蕩，2h后分別取各樹(shù)脂吸附后的溶液1ml，于250nm處測(cè)吸光度，計(jì)算各種樹(shù)脂對(duì)葛根黃酮的吸附率11。2.3.2靜態(tài)解吸將靜態(tài)吸附的樹(shù)脂

8、過(guò)濾抽干，加30ml70%乙醇解吸，放置搖床進(jìn)行振蕩，2h后分別吸取各解吸液1ml，于250nm處測(cè)吸光度，計(jì)算各樹(shù)脂對(duì)葛根黃酮的解吸率。2.3.3 動(dòng)態(tài)吸附取處理好的4種樹(shù)脂各10ml于220cm的柱內(nèi)，加葛根水溶液于柱頂，以3bv/h的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，按樹(shù)脂床體積收集，于250nm處測(cè)吸光度計(jì)算黃酮含量，繪制各樹(shù)脂的泄漏曲線。2.3.4 動(dòng)態(tài)解吸取處理好的4種樹(shù)脂各10ml于220cm的柱內(nèi)，加葛根水溶液于柱頂，以3bv/h的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附后，先用蒸餾水進(jìn)行洗脫，再以70%乙醇以3bv/h的流速進(jìn)行洗脫，按床體積收集，于250nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算乙醇洗脫液中總黃酮的含量。

9、2. 4 最佳分離工藝的篩選12-132.4.1藥液濃度的考察取葛根黃酮水溶液（總黃酮含量為40mg/ml）10ml，分別加水稀釋0，5，10，15，20倍，于10g x-5樹(shù)脂中進(jìn)行靜態(tài)吸附，放置于搖床中振蕩，2h后分別取樹(shù)脂吸附后的溶液1ml，于250nm測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率。2.4.2 ph的考察取葛根黃酮水溶液10ml，用1mol/l的hcl或1mol/l的naoh調(diào)ph12，34，56，78，910，加于10g的x-5樹(shù)脂中，放置在搖床上進(jìn)行振蕩，2h后分別取樹(shù)脂吸附后的溶液1ml，于250nm處測(cè)吸光度。2.4.3 洗脫溶劑的考察 取葛根黃酮溶液10ml，加于10g的x-5樹(shù)脂中

10、，置于搖床上振蕩進(jìn)行吸附后，分別用30ml水、乙醇、丙酮置于搖床上振蕩進(jìn)行洗脫，2h后取1ml解吸液在250nm處測(cè)定吸光度。2.4.4 乙醇洗脫濃度的考察取葛根黃酮溶液10ml，放于10g的x-5樹(shù)脂中進(jìn)行吸附后，分別用10%，30%，50%，70%，90%乙醇進(jìn)行洗脫，放置于搖床上振蕩2h后取各解吸液1ml，于250nm處測(cè)定其吸光度。3、結(jié)果與分析31 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以葛根濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:表3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度(a)0.10.2260.3380.4850.6380.8060.9381.0881.186體積(ml)0.10.20.30.40.50.60.70

11、.80.9濃度(mg/ml)0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0140.0160.018 圖3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y = 68.809x - 0.0388(r2 = 0.9967)3. 2 大孔樹(shù)脂的篩選3.2.1 靜態(tài)實(shí)驗(yàn)表3.2 4種大孔樹(shù)脂對(duì)葛根總黃酮的吸附率與解吸率樹(shù)脂種類吸附率(%)解吸率(%)nka-990.432.8ab-898.933.8x-5 98.858.3d10169.141.6圖3.2靜態(tài)吸附和解吸率曲線從表3.2和圖3.2可以看出從靜態(tài)吸附和解吸的角度來(lái)看ab-8和x-5的靜態(tài)吸附率和解吸率大于其他2種樹(shù)脂。3.2.2 動(dòng)態(tài)吸附圖3.

12、3動(dòng)態(tài)吸附泄露曲線表3.3 4種大孔動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果樹(shù)脂體積樹(shù)脂種類nka-9ab-8x-5d10110.450.270.320.3620.560.340.380.4130.620.440.540.4840.980.610.660.5951.120.910.750.7261.251.370.991.0571.431.441.231.2381.461.491.331.2891.481.511.54101.531.56從表3.3和圖3.3中可以看出ab-8、x-5和d101的泄漏點(diǎn)相近，與nka-9相差較大。3.2.3 動(dòng)態(tài)解吸表3.4 動(dòng)態(tài)解吸結(jié)果樹(shù)脂體積樹(shù)脂種類nka-9ab-8x-5d10111

13、.361.301.511.0321.511.441.781.1930.541.590.961.4140.460.710.840.8350.380.560.580.6260.340.480.50.4170.300.370.410.2280.240.29圖3.4 動(dòng)態(tài)解吸曲線從表3.4和圖3.4中可以看出nka-9的解吸能力最好，其次是x-5，再次是ab-8和d101。綜合考慮樹(shù)脂的吸附解吸性能，認(rèn)為x-5分離葛跟黃酮效果好。3.3 最佳分離工藝的篩選3.3.1藥液濃度的考察表3.5 藥液濃度考察結(jié)果稀釋倍數(shù)（倍）05101520吸附率(%)98.0099.8099.9099.9299.93表3.

14、6 單因素方差分析差異來(lái)源ssdfmsfp-valuef crit組間20030120030633.76.64e-095.318組內(nèi)252.9831.61總計(jì)202839從方差分析表3.6中可以看出p0.01，說(shuō)明不同濃度樣液吸附量差異極顯著。從表3.5中可以看出當(dāng)藥液稀釋20倍時(shí)吸附率最高，可達(dá)99.93%，但藥液不稀釋也可達(dá)到98.00%，所以在生產(chǎn)實(shí)踐中為了節(jié)約人力、物力，可以選擇藥液不稀釋。3.3.2 ph的考察表3.7 藥液ph考察結(jié)果ph12345678910吸附率(%)99.6099.6799.6699.1097.60從表3.7中可以看出當(dāng)藥液濃度在酸性條件下其吸附結(jié)果比在堿性條

15、件下好，但在酸性范圍內(nèi)其吸附率變化不大。3.3.3 洗脫溶劑的考察表3.8 洗脫溶劑考察結(jié)果溶劑水乙醇丙酮解吸率(%)0.133.25.6從表3.8中可以看出用丙酮洗脫效果較好，但由于丙酮有毒且價(jià)格較乙醇貴，所以綜合考慮，我們選用乙醇作為洗脫溶劑。3.3.4 乙醇洗脫濃度的考察表3.9 乙醇濃度考察結(jié)果乙醇濃度(%)1030507090解吸率(%)1.122.402.374.034.01表3.10 單因素方差分析差異源ssdfmsfp-valuef crit組間55721557311.130.010295.318組內(nèi)40068500.8總計(jì)95799從表3.9中可以看出當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)洗脫

16、效果最好。在低于70%時(shí)解吸效果遠(yuǎn)不如70%時(shí)高，90%的乙醇效果雖然不錯(cuò)但是不符合經(jīng)濟(jì)的條件。從方差分析表中得知：0.01p0.05，說(shuō)明不同乙醇濃度洗脫效果差異顯著。4.結(jié)論通過(guò)不同大孔樹(shù)脂對(duì)葛根黃酮溶液的靜態(tài)吸附率和解吸率以及動(dòng)態(tài)吸附率和解吸率的考察，最后確定大孔樹(shù)脂x-5為分離葛根黃酮溶液的最佳樹(shù)脂。再通過(guò)樹(shù)脂x-5對(duì)葛根黃酮溶液進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸來(lái)篩選吸附和解吸的合適條件。選擇從藥液濃度，ph，洗脫溶劑，乙醇洗脫濃度這幾個(gè)方面著手，利用靜態(tài)吸附和解吸來(lái)考察最優(yōu)條件。通過(guò)計(jì)算吸附率和解吸率的大小來(lái)確定各條件下的合適的范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳分離工藝是：藥液濃度為40mg/ml，將藥液ph

17、調(diào)至酸性條件下進(jìn)行吸附，用乙醇作為洗脫的溶劑，綜合各因素考慮確定用70%的乙醇進(jìn)行洗脫。參考文獻(xiàn)1 郭建平, 孫茸榮. 葛根化學(xué)成分及臨床應(yīng)用研究概況j. 藥學(xué)實(shí)踐雜志. 1996. 14(3): 46-148.2 何惟勝. 葛根及其提取物冶療心腦血管疾病的藥理和臨床研究進(jìn)展j. 中醫(yī)藥研究, 2000, 17(3): 58-59.3崔九成, 蒙躍尤, 楊勻. 大孔樹(shù)脂分離葛根黃酮研究j. 西北藥學(xué)雜志, 1999，14(4): 54-55. 4 曾祥群. 葛根總黃酮提取工藝j . 食品工業(yè)科技, 2002, 21(3): 23-25.5 李穩(wěn)宏, 李劍君, 高新. 葛根中有效成分總異黃酮提取工藝研究j. 西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 1998, 28(2): 131-134.6 董珂. 大孔樹(shù)脂技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用概況j. 藥學(xué)實(shí)踐雜志, 2006，24(1)：13-16.7 蕾方言, 現(xiàn)代實(shí)用中藥新劑型新技術(shù)m. 北京: 人民衛(wèi)牛出版社, 2001-4-27.8 張妍, 山楂中總黃酮幾種提取分離方法的考察及含量測(cè)定j, 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 35(3): 183.9 貝偉劍, 彭文烈, 羅杰, 柿葉黃酮的大孔吸附樹(shù)脂分離提純富集j. 中成藥, 2005, 2