植物中SOD的分離提取及性質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、植物中SOD的分離提取及性質(zhì)研究-綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)校： 學(xué)院： 班級(jí)： 同組成員： 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康腟OD廣泛存在生物界，是防御氧毒害的關(guān)鍵酶。SOD主要有CuZn-,Mn-,Fe-SOD三種類(lèi)型的同工酶，它們的共同的生物學(xué)作用是專(zhuān)一的清除氧化中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（對(duì)細(xì)胞組分及細(xì)胞器，尤其是生物膜有嚴(yán)重的損壞作用），具有抗衰老，抗輻射，抗癌等生理作用。在醫(yī)藥中，SOD可用于治療輻射病，自身免疫性疾病，炎癥等；在食品中，可用于保健食品添加劑；在化妝品中，可防止皮膚衰老，抗炎，防曬等作用。植物中大蒜的SOD含量豐富，所以，本實(shí)驗(yàn)研究大蒜中SOD的性質(zhì)，并且確定SOD同工酶的類(lèi)型。根據(jù)SOD的性質(zhì)，我

2、們采用鄰苯三酚自氧化法判斷同工酶的最適溫度，最適PH，以及雙氧水對(duì)酶的活力抑制。并采用改進(jìn)的自氧化法測(cè)酶的活力.二、實(shí)驗(yàn)原理1、鄰苯三酚自氧化法根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白質(zhì)具有的酶活性單位（Umg蛋白）來(lái)表示。因此，測(cè)定樣品的比活性必須測(cè)定：每mL樣品中的蛋白質(zhì)mg數(shù)（mgmL）;每ml樣品中的酶活性單位數(shù)（UmL）。酶的純度越高酶的活性也就越高。SOD酶活性測(cè)定方法很多，如鄰苯三酚自氧化法、腎上腺素自氧化法、黃嘌呤氧化酶法、NBT光還原法、化學(xué)發(fā)光法等。在一般情況下，SOD酶活性只能應(yīng)用間接活性測(cè)定法，本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。

3、利用鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開(kāi)始后先變成黃綠色，幾分鐘后轉(zhuǎn)為黃色，線(xiàn)性時(shí)間維持在34min。加入酶液則抑制其自氧化速度，在325nm處測(cè)定溶液的吸光度。酶活性單位采用1mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶定量為一個(gè)活力單位。鄰苯三酚自氧化速率隨其濃度的升高而增加2、不連續(xù)電泳不連續(xù)電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳。由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品（即使是稀樣品）在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進(jìn)行分離。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù)電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳。雖然不

4、連續(xù)電泳在緩沖系統(tǒng)的選擇和制膠（特別是梯度膠）的操作方面比較繁雜，但它可以得到電泳分離最重要的指標(biāo)-高分辨，因而是目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。三、實(shí)驗(yàn)試劑大蒜、氯仿-乙醇混合液、維生素B2、冷丙酮、鄰苯三酚、濃鹽酸、蒸餾水、雙氧水、TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺。）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、溴酚藍(lán)、5.0mol/L PH7.8 磷酸鈉、10 mmol/LHCl、Tris（三羥甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇）、甘氨酸12.45mol/LNBT溶液：稱(chēng)取200mgNBT溶于蒸餾水中并定容至100ml置棕色試劑瓶中，避光貯存。2. 3.60mol/L PH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含2.8mol/L

5、TEMED和2.8 維生素B2）：在100ml 3.60mol/L PH7.8 磷酸鈉緩沖液中加0.42mlTEMED及1.32mg維生素B2 ，置棕色瓶中貯存。3PH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱(chēng)取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，加水至1000ml,用是加水稀釋10倍。4. PH8.9 1.5mol/L Tris-HCl 緩沖液：稱(chēng)取18.2g三羥甲基氨基甲烷（Tris）加24ml 1mol/L鹽酸，加水至100ml.5. PH6.8 0.5mol/L Tris-HCl 緩沖液:稱(chēng)取Tris6.0g,加48ml 1.0mol/L 鹽酸溶液100ml 。6.以及不同濃度的磷酸緩沖液

6、。0.05mol/L， PH如下 5.86.57.07.37.67.87.98.37. 凝膠貯液以及凝膠 A液：48ml 1mol/L Hcl,36g Tris,0.24ml TEMED. B液：48ml 1mol/L Hcl,5.9g Tris,0.46ml TEMED。 C液：30g Acr,0.8g BisD液：10g Acr,2.5g Bis E液：4mg核黃素 F液：40g蔗糖（以上各液定容至100ml）凝膠（體積比）：A:C:E:水=1:3:1:3濃縮液（體積比）：B:D:E:F=1:3:1:3四、實(shí)驗(yàn)儀器離心機(jī) 離心管 水浴鍋 電熱爐 研缽 移液槍 移液管 膠頭滴管 試管若干 7

7、21型分光光度計(jì)以及紫外分光光度計(jì) DYCZ-240D型垂直板電泳槽 錐形瓶 冰箱 不同型號(hào)容量瓶若干 托盤(pán)天平 燒杯 玻璃棒 五實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 制 備 酶 液 ：l SOD的提取： 稱(chēng)取2025g大蒜蒜瓣，置于研磨器中研磨，使組織細(xì)胞破碎。再加入23倍體積的0.05mol/L PH 7.8 的磷酸緩沖液，繼續(xù)研磨，攪拌20min，使SOD充分溶解到緩沖液中，然后以5000r/min離心15min，棄去沉淀，得提取液。（留取1ml提取液備用，正確量取剩余上清液體積，記錄）l 除雜蛋白 向提取液中加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合液，攪拌15min,5000r/min，離心15min,棄除雜蛋白，得粗

8、酶液。（留取1ml粗酶液備用，正確量取剩余粗酶液的體積，記錄）l SOD的沉淀分離 將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min,5000r/min,離心15min得SOD沉淀。將SOD沉淀溶于0.05mol/LPH 7.8的磷酸緩沖液中，于5560C熱處理15min，再離心棄沉淀的得SOD酶液（留取1ml酶液備用，正確量取剩余酶液的體積，記錄） SOD性質(zhì)的測(cè)定：1. 粗酶液活性測(cè)定（鄰苯三酚法）試劑ml空白管對(duì)照管提取液粗酶液酶液PH8.3磷酸緩沖液33333SOD提取液000.10.10.1蒸 餾 水21.81.71.71.7室溫放置20min鄰苯三酚00.20.20.20.2吸 光

9、值加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min，加一滴濃Hcl停止反應(yīng)，在420nm下測(cè)定吸光值。2. 酶液的最適溫度探究 試 管試 劑ml1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)5號(hào)溫度處理（）0255075100PH8.3磷酸緩沖液33333SOD酶液0.10.10.10.10.1蒸 餾 水22222在各自的溫度下靜置10min,然后取出鄰苯三酚0.20.20.20.20.2吸 光 值加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)4min，加一滴濃Hcl停止反應(yīng)，在420nm 6下測(cè)定吸光值。3. 酶液的最適PH探究試管試 劑ml123456SOD 酶液0.10.10.10.10.10.1磷酸緩沖液（PH）5.86.57.07.3

10、7.67.9蒸 餾 水222222 在最適溫度下，水浴10min,取出鄰苯三酚0.20.20.20.20.20.2吸 光 值4抑制劑對(duì)酶液活性的影響（1）H2O2對(duì)SOD活力抑制 試 管試 劑ml12341.5 H2O215l20l25uL30ulSOD酶液0.10.10.10.1于30水浴恒溫30min，取出迅速冷卻至25鄰苯三酚0.20.20.20.2吸 光 值 同工酶類(lèi)型的判斷：（不連續(xù)電泳）1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準(zhǔn)備2個(gè)干凈的錐形瓶.2.把玻璃板在灌膠支架上固定好固定玻璃板時(shí),兩邊用力一定要均勻,防止夾壞玻璃板. 3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入,大約5厘米左右,之后加

11、少許蒸餾水,靜置40分鐘.凝膠配制過(guò)程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無(wú)法注膠.注膠過(guò)程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.水封的目的是為了使分離膠上延平直,并隔絕空氣，凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘. 樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.5.在上槽內(nèi)加入緩沖液后,拔出樣梳.要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會(huì)影響加樣效果. 6.加樣，取10u l樣品溶液,再加入10 ul 2倍樣品緩沖液,上樣量分別為5u l和3u l.7.按下表用微量

12、注射器距槽底三分之一處加樣,加樣前,樣品在 沸水中加熱3分鐘,去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合.（注射器不可過(guò)低,以防刺破膠體,也不可過(guò)高,在樣下 沉?xí)r會(huì)發(fā)生擴(kuò)散.為避免邊緣效應(yīng),最好選用中部的孔注樣.）槽 口12345試 劑SOD酶液和H2O2SOD酶液SOD酶液和H2O2SOD酶液SOD酶液 1 2 3 4 5 8.電泳槽中加入緩沖液,接通電源,進(jìn)行電泳,開(kāi)始電流恒定在10mA,當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA,溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí),停止電泳.9.SOD活性染色 取凝膠板，按下列順序浸泡于培養(yǎng)皿中染色 2.45mol/L NBT溶液中，再黑暗條件下浸泡20min，NBT溶液應(yīng)置于暗處，4貯存以免氧化變質(zhì)，染

13、色時(shí)也至于暗處，如凝膠板厚可延長(zhǎng)浸泡時(shí)間置于3.60mol/L PH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含2.8mol/L TEMED和2.8 維生素B2）中，在黑暗條件下浸泡15min將凝膠板移入5.0mol/L PH7.8 磷酸鈉緩沖液中浸泡，在48W日光燈下照20-30min,光照應(yīng)均勻，使無(wú)SOD區(qū)的NBT充分還原成藍(lán)紫色的甲月替。經(jīng)上述染色和光照后的凝膠板，在藍(lán)色背景上出現(xiàn)清晰透明的SOD活性染色。染色后的凝膠板用水漂洗數(shù)次后，再用保存液浸泡。酶活力測(cè)定：鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：在試管中加入緩沖液4.5ml,于25保溫20min,然后加入預(yù)熱的鄰苯三酚10L （對(duì)照管用10 mmol/LHCl 代

14、替），迅速搖勻倒入1cm光徑的比色皿，在325nm下，每隔30s測(cè)吸光度一次，可適當(dāng)調(diào)整鄰苯三酚加入量，將自氧化速率控制在0.070A/min.SOD或粗酶液的活性測(cè)定:在試管中加入約10L酶夜，其它操作同自氧化速率的測(cè)定，按下列公式計(jì)算酶活力：?jiǎn)挝惑w積活力（U/ml）=0.070-樣液速率0.07050%反應(yīng)液總體積總活力單位數(shù)（U）=每毫升酶夜活力單位數(shù)酶夜的總體積六、要求運(yùn)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)高速離心技術(shù)、有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)、分光光度技術(shù)、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)等。七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：1. 粗酶液活性測(cè)定（鄰苯三酚法）試劑ml空白管對(duì)照管提取液粗酶液酶液PH8.3磷酸緩沖液33333S

15、OD提取液000.10.10.1蒸 餾 水21.81.71.71.7室溫放置20min鄰苯三酚00.20.20.20.2 平均吸光值00.2630.2500.2450.217實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：依照鄰苯三酚法測(cè)定酶活力 一號(hào)管作為空白管，在實(shí)驗(yàn)中起對(duì)照作用。二號(hào)管作為對(duì)照管，加入了鄰苯三酚。三、四、五號(hào)試管吸光度依次下降且均低于對(duì)照管，表示酶活力依次增強(qiáng)。且酶液活力遠(yuǎn)高于粗酶液。2. 酶液的最適溫度探究 試 管試 劑ml1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)5號(hào)溫度處理（）0255075100PH8.3磷酸緩沖液33333SOD酶液0.10.10.10.10.1蒸 餾 水22222在各自的溫度下靜置10min,然后取出鄰

16、苯三酚0.20.20.20.20.2平均吸光值 0.2000.4950.3490.2280.850實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)中采取單一變量的方法，嚴(yán)格控制五支試管中除溫度單一變量不同外其實(shí)實(shí)驗(yàn)變量完全相同，可以有效的驗(yàn)證sod酶的最適溫度。其中取的五個(gè)溫度梯度，分別為0，25，50，75，100，其中0的吸光光度值為最低，經(jīng)驗(yàn)證為實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤。從25到75，隨著溫度的升高，吸光光度值依次降低，證明在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶活性升高。在75達(dá)到活性最高點(diǎn)（研究范圍內(nèi)）而從75和100的數(shù)據(jù)中可以看出，吸光光度值升高，說(shuō)明了此時(shí)sod酶已經(jīng)失活，無(wú)法催化。在此范圍內(nèi)，得出酶的最適溫度為75。3. 酶液的

17、最適PH探究試管試 劑ml123456SOD 酶液0.10.10.10.10.10.1磷酸緩沖液（PH）5.86.57.07.37.67.9蒸 餾 水222222在最適溫度下，水浴10min,取出鄰苯三酚0.20.20.20.20.20.2平均吸光值0.3610.2510.1460.1050.0650.150實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：同樣，在探究sod酶的最適ph我們依舊采取的為控制變量法。除ph以外的實(shí)驗(yàn)變量控制保持不變，而且使溫度保持在最適溫度即75反應(yīng)，能夠有效排除其余外界因素對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾?？煽闯觯琾h對(duì)于sod酶活性的影響顯著，且在堿性環(huán)境中，sod酶的活性較強(qiáng)，在ph=7.6時(shí)，吸光光度值

18、達(dá)到了最大，說(shuō)明酶活性最強(qiáng)。單一變量法探究除了sod酶的最適ph為7.6。4.抑制劑對(duì)酶液活性的影響（1）H2O2對(duì)SOD活力抑制 試 管試 劑ml12341.5 H2O215l20l25uL30ulSOD酶液0.10.10.10.1于30水浴恒溫30min，取出迅速冷卻至25鄰苯三酚0.20.20.20.2 平均吸光值0.4030.4050.4370.428實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：同樣采取控制變量法，此處我們控制單一變量為抑制劑物質(zhì)的量。其中抑制劑為過(guò)氧化氫，顯然，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，抑制劑過(guò)氧化氫對(duì)酶活有一定的抑制作用，使酶活力降低。降低的程度與抑制劑的物質(zhì)的量有關(guān)。一定程度內(nèi)，物質(zhì)的量越大，抑制程度越深，但是25l時(shí)酶活力低于30l時(shí)的酶活力，說(shuō)明過(guò)量抑制劑反而無(wú)法高效抑制，在25l時(shí)效果最好。關(guān)于聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果的分析：實(shí)驗(yàn)中，我們按照步驟嚴(yán)格配比出了凝膠液，濃縮液，并按照步驟加入濃縮膠，插入梳子。取梳齒距密集的小梳子，使最終凝膠制作完畢時(shí)，各個(gè)加樣處距離分布密集。同時(shí)，當(dāng)我們加樣時(shí)，未能及時(shí)準(zhǔn)備的將粗酶液加入各個(gè)槽中，使得最后凝膠電泳時(shí)，各個(gè)樣無(wú)法分離，最終染色后我們的凝膠樣品呈一條拋物線(xiàn)，兩邊跑的較快，中間跑的慢，這是由于加樣時(shí)將中