(整理)EASYspin石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒操作方法及步驟說明書0001

1、EASYspin石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒目錄號(hào)：RN3001適用范圍：適用于快速?gòu)母栺R林固定、石蠟包埋組織樣品中提取總RNA , RNA可用于反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR。試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性:試劑盒組成保存50 次(RN3001)裂解液PKD室溫15 ml結(jié)合液RBC室溫25 ml漂洗液RW室溫10ml第一次使用前按說明加指定量乙醇蛋白酶K粉40mg/ml-20 C20mgRNase-free 出0室溫10 ml基因組DNA清除柱和收集管室溫50套R(shí)NA吸附柱RA和收室溫50套集管本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。儲(chǔ)存事項(xiàng)：1. 所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時(shí)

2、溶液可能形成沉淀，此時(shí)不應(yīng)該直接使用，可在37 C水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。2.3. 不合適的儲(chǔ)存于低溫（4 C或者20C ）會(huì)造成溶液沉淀，影響使用效果，因此 運(yùn)輸和儲(chǔ)存均在室溫下（15C 25 C）進(jìn)行。4. 為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后， 加入0.5毫升滅菌水溶解（終濃度 40mg/ml）因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性， 因此溶解后立即按照每次使用量）分裝凍存，20 C保存。5. 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、 PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及 時(shí)蓋緊蓋子。注意事項(xiàng)1.2.3. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000

3、rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C或者類似離心機(jī)。4.5.6.7.樣品處理量絕對(duì)不要超過基因組DNA清除柱和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同組織細(xì)胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾 臟DNA含量豐富，超過5mg就會(huì)超過柱子處理能力。COS細(xì)胞RNA含量豐富，超過3x10 6細(xì)胞就會(huì)超過柱子吸附能力。所以開始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品 DNA/RNA含量時(shí)寧可使用較少的樣品處理量，如不超過2個(gè)10 m厚度石蠟切片。將來根據(jù)樣品試驗(yàn)情況增加或者減少處理量。11.裂解液PKD結(jié)合液RBC中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚

4、，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：1) 經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase污染。2)2) 使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。3) RNA提取過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4 小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。4) 配制溶液應(yīng)使用無 RNase的水。(將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37C放置過夜，高壓滅菌。)13. 關(guān)于DNA的微量殘留：一般說來任何總 R

5、NA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留(DNase消化也無法做到100%無殘留)，本公司的EASYspin固定包埋組織 RNA 快速提取試劑盒，由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和基因組DNA清除柱技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR。個(gè)別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA表達(dá)量分析熒光定量PCR，我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：1) 選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與 擴(kuò)增反應(yīng)。2) 選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。14. RNA純度及濃度檢測(cè)：完整性：R

6、NA可用普通瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：膠濃度1.2%; 0.5燈BE電泳緩沖液；150v，15分鐘)檢測(cè)完整性。由于石蠟包埋組織福爾馬林固定和包埋過程中一般由于 RNA與蛋白反應(yīng)交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致RNA斷裂或者降解，一般電泳后UV下只能看到模糊彌散（smear）帶型，隨著儲(chǔ)存的時(shí)間越長(zhǎng)，降解斷裂越嚴(yán)重， 甚至只能看到峰值僅僅在 100bp左右的模糊條帶。這都屬于RNA提取正常情況。純度：OD260/OD280比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的參考指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5 ）在 1.8-2.1 之間。0D260/0D280 讀數(shù)受 測(cè)定所用溶液的pH值影

7、響。同一個(gè)RNA樣品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液 中測(cè)出的0D260/0D280讀數(shù)1.8-2.1之間，在水溶液中所測(cè)讀數(shù)則可能在 1.5-1.9 之間，但這并不表示 RNA不純。濃度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free水稀釋n倍，用 RNase-free水將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行OD260, OD280測(cè)定，按照以下公式進(jìn)行 RNA 濃度的計(jì)算：終濃度（ng/ g）l = （OD260） x（稀釋倍數(shù)n） 40。操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液 RW瓶中加入指定量無水乙醇！1. 修整去除過量包埋組織外石蠟，并切片成5-2

8、0 口厚切片（開始的2-3片拋棄不用）。2. 收集總厚度不超過 40呵的石蠟切片到一個(gè)1.5-2ml離心管（例如2片20呵、4 片10 口、8片5 的石蠟切片），或者不超過 80呵 的石蠟切片到一個(gè) 2ml離 心管。代表處理切片總厚度w 40呵，代表處理切片總厚度w 80 pm3. 加入1ml 100%二甲苯，渦旋振蕩10秒。瞬間離心把組織全部浸入到二甲苯。4. 50 C水浴3分鐘熔解石蠟，20-25 C最高速離心2分鐘，收集組織到管底。5. 小心用移液器吸棄上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。6. 加入1ml無水乙醇，渦旋振蕩，最高速離心2分鐘，小心吸棄上清乙醇。7. 加入1ml無水乙醇，重復(fù)步驟

9、 6 一遍，盡可能吸棄所有乙醇。8. 室溫或者37C晾干乙醇10分鐘或直到所有乙醇揮發(fā)干。乙醇完全晾干非常重要，微量的乙醇?xì)埩粢矔?huì)導(dǎo)致RNA產(chǎn)量降低。9. 重懸吹打或者渦旋振蕩充分重懸組織沉淀在150 4 240 pl裂解液PKD中，短暫離心收集液體到管底，加10 4蛋白酶K，吹打混勻。10. 55C孵育15分鐘，然后80 C孵育15分鐘。55C孵育后，可以將離心管取出放置在室溫，等水浴鍋溫度升到 80 C后再放入水浴鍋，精確的孵育15分鐘。即使2分鐘的延長(zhǎng)也可能導(dǎo)致 RNA的部分降解。11. 加入 320 4 500 4結(jié)合液RBC，充分吹打混勻調(diào)節(jié)結(jié)合條件。12. 立刻將混合物加入一個(gè)基因

10、組DNA清除柱中，（清除柱放入收集管中）14,000 rpm離心60秒，保留濾過液（RNA在濾過液中）。應(yīng)避免吸到可能有的較大的未消化完全的絮團(tuán)物質(zhì)上柱子，以免堵塞離心柱。13. 加入 720 4 12004無水乙醇到濾過液中，立即吹打混勻，不要離心。14. 立刻將混合物（每次小于700 4,多可以分多次加入）加入一個(gè)RNA吸附柱RA 中,（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。15. 加入500 4漂洗液RW （請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇?。?，12,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。加入5004 1漂洗液RW,重復(fù)一遍。16. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免 漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。17. 取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，