抑制麻風(fēng)樹(shù)潰瘍病病原菌的土壤細(xì)菌篩選

1、抑制麻風(fēng)樹(shù)潰瘍病病原菌的土壤細(xì)菌篩選 Screening of Soil Bacteria Inhibiting Canker of Jatropha curcas Guo Jianwei1 et al. (1 College of Life Science and Technology， Key Laboratory of Higher Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province， Honghe University ， Mengzi 661100 ，China ) ：

2、63 strains rhizobacteria were isolated soil samples by streak platemethod， subquencely 4 nutrient competent strains controlling Botrosphaeria fuliginosa( Moug. et Nestl. )Ell. et Ev. were screened by tablet coating method. 4 strains above were G+ coccus. 麻風(fēng)樹(shù)( Jatropha curcas L. )別名黑皂樹(shù)、膏桐、臭油桐、 木花生、小桐

3、子等，是大戟科( Euphorbiaceae )麻風(fēng)樹(shù)屬落葉 灌木或小喬木，具有速生、耐旱、耐貧瘠、含油率高的特點(diǎn)，野 生條件下病蟲(chóng)害少；其莖、葉、樹(shù)皮均有充沛的富含毒蛋白的白 色乳汁，可提取生物醫(yī)藥和生物農(nóng)藥；種殼、種子均含油，尤其 是種子含油率達(dá)31.1%47.2%,可加工生物柴油1-3。 據(jù)武建榕 2008 年首次報(bào)道，小桐子潰瘍病最初發(fā)生于嫁接 的插穗上，病原菌為褐黑葡萄座腔菌 Botrosphaeria fuliginosa ( Moug. et Nestl. )Ell.et Ev. 和 Pseudoseptoria sp1。其癥狀表現(xiàn)為：初期插穗的地上部分枯死，后期干燥條件 下出現(xiàn)

4、許多半埋生于表皮層的黑褐色小點(diǎn)， 最終生根的插條枯死 4 。據(jù)呂相賢、何家柏、郭建偉調(diào)查，云南省雙柏縣、建水縣、 蒙自縣、 元陽(yáng)縣的小桐子種植林均發(fā)生了嚴(yán)重的莖潰瘍病，經(jīng)病 原菌分離、鑒定為褐黑葡萄座腔菌。目前，上述地區(qū)的小桐子屬 于粗放式管理，每 3a 施藥施肥一次，農(nóng)藥以多菌靈、代森錳鋅 為主，防治效果不佳；此外，利用生物防治該病害的研究還鮮見(jiàn) 報(bào)道。 植物土壤細(xì)菌是指存在于植物根際土壤中的一類與植物互 利共生的細(xì)菌，對(duì)植物無(wú)可見(jiàn)危害。 1978 年 Burr 和 Schroth 首 先報(bào)道馬鈴薯根際土壤細(xì)菌， 隨后國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)多種根際 土壤細(xì)菌的廣泛存在， 目前報(bào)導(dǎo)最多的根際土壤細(xì)

5、菌菌株有假單 胞菌屬(PseudomonaS、芽抱桿菌屬(Bacillus )、農(nóng)桿菌屬 ( Agrobacterium )、埃文氏菌屬( Eriwinia )、黃桿菌屬 ( Flavobacterium )、巴斯德氏菌屬( Pasteuria )等 5 。王麗 珍等從煙草根際土壤中分離出對(duì)煙草青枯病菌有拮抗活性的菌 株 348株，經(jīng)復(fù)篩還發(fā)現(xiàn)：其中 29 株菌對(duì)赤星菌的抑菌帶寬達(dá) 8.012.0mm 26株菌對(duì)黑脛菌的抑菌帶寬達(dá) 9.014.0mm, 31 株菌對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑達(dá) 30.042.0mm6。因而，從小桐 子能源林土壤分離潰瘍病拮抗性細(xì)菌， 具有一定的可行性和潛在 的應(yīng)用價(jià)值

6、。 1 材料與方法 1.1 土樣 小桐子根際土壤樣品由何家柏和呂相賢于 2011 年 10 月采集自蒙自市草壩鎮(zhèn)碧色寨麻瘋樹(shù)能源林；分別從溝底 （土壤較濕潤(rùn)、肥沃，腐殖質(zhì)多）、坡上（土壤干燥、貧瘠，以 砂石為主）的林中 5 點(diǎn)取樣，共 10 份土樣。 1.2 病原菌活化 將分離自上述地點(diǎn)的褐黑葡萄座腔菌轉(zhuǎn)接 在新鮮PDA培養(yǎng)基上，活化、備用。 1.3培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20g、馬鈴薯200g、瓊脂 20g、蒸餾水1 OOOmL，pH自然（對(duì)峙培養(yǎng)篩選拮抗性細(xì)菌時(shí)加 20g蛋白胨）；NA培養(yǎng)基：牛肉膏3g、NaCI5g，蛋白胨10g、瓊 脂 20g、蒸餾水 1 OOOmL, pH7.0 7

7、.2 7。 以上相應(yīng)的固體或液體培養(yǎng)基以加瓊脂與否為標(biāo)準(zhǔn)。 1.4 土壤細(xì)菌的分離、純化 常規(guī)平板稀釋培養(yǎng)法分離土壤 細(xì)菌并經(jīng)劃線法純化 7 。 1.5 拮抗細(xì)菌的篩選與相對(duì)抑制率測(cè)定 采用 3 點(diǎn)接種法將 細(xì)菌與病原菌接種在加有蛋白胨的 PDA培養(yǎng)基上，28C恒溫培養(yǎng) 514d,觀察是否抑制病原菌；如抑制，則計(jì)算相對(duì)抑菌率 8。 相對(duì)抑菌率（ %） =（病原菌菌落半徑 - 病原菌接種點(diǎn)到凹痕 的距離）/菌落半徑X 100。 1.6 抑制菌株的形態(tài)及部分生理生化測(cè)定 對(duì)抑制病原菌的 細(xì)菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色、莢膜染色、運(yùn)動(dòng)性測(cè)試、接觸酶反應(yīng) 等基本的形態(tài)學(xué)與生理生化測(cè)定 7 。 2 結(jié)果與分析

8、2.1 土壤細(xì)菌的分離 從 10 份土壤樣品中分離出具有不同 菌落特征的細(xì)菌 63 株，說(shuō)明麻風(fēng)樹(shù)根際土壤具有較為豐富的細(xì) 菌資源。 2.2 抑制病原菌的土壤細(xì)菌的篩選與相對(duì)抑菌 率 采用對(duì)峙生長(zhǎng)法篩選出 4 株覆蓋病原菌菌絲并阻止其進(jìn)一步 生長(zhǎng)的細(xì)菌，其菌落特征及抑菌作用見(jiàn)表 1 和圖 1。 表1 對(duì)小桐子潰瘍病病原菌具有抑制作用的 4個(gè)菌株特征 篩選菌株 &菌落色澤 &菌落特征 &相對(duì)抑菌率（% &WT4-仁&乳白色 &較濕潤(rùn)、光滑、透明 &21.4&WT2-1-2& 乳黃色 &干燥、邊沿整齊、不透明 & 16.7&WT2-2-2-a&淡 乳黃色 &濕潤(rùn)、光滑、透明 &42.3 &WT2-

9、2-2-b&淡乳黃色 &濕潤(rùn)、光滑、不透明 & 38.6 & 注: A.WT2-2-2-a菌株對(duì)潰瘍病病原菌抑制作用；B.WT2-1-2 菌株對(duì)潰瘍病病原菌的抑制作用；C.病原菌 圖 1 篩選菌株對(duì)潰瘍病病原菌的抑制作用 2.3 抑制病原菌的土壤細(xì)菌的初步鑒定 如表 2所示，4株 細(xì)菌均為革蘭氏陽(yáng)性球菌，有莢膜，厭氧或兼性厭氧，都可以在 含5%NaCI的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有一定的耐鹽性。其中，WT4-1 接觸酶反應(yīng)陰性，在7%NaCI的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，其余菌株接 觸酶反應(yīng)均為陽(yáng)性， 耐7%NaC但不耐10%NaCJ WT2-1-2不具備 運(yùn)動(dòng)性，其余菌株沿穿刺線云霧狀生長(zhǎng)，均具有運(yùn)動(dòng)性。 表

10、2 拮抗菌株生理生化鑒定 菌株&革蘭氏染色 &莢膜染色 &運(yùn)動(dòng)性 &厭氧性測(cè)定 &耐鹽性試驗(yàn) &接觸酶反應(yīng) （3% H2O2） &2%NaCl &5%NaCl &7%NaCl &10%NaCl &WT4- &+,球菌 &+&+ &厭氧 &+&+ &- &- &- &WT2-1-2&+,球菌 &+ &-&兼性厭氧 &+&+&+ &- &+ &WT2-2-2-a&+,球菌 &+&+&兼性厭氧 &+&+&+ &- &+&WT2-2-2-b &+,球菌 &+&+&兼性厭氧 &+ &+ &+ &- &+ & 3 小結(jié)與討論 3.1 土壤細(xì)菌的分離、純化 本試驗(yàn)采用稀釋涂布平板法從 小桐子能源林土壤樣品中共分離到 63 株形態(tài)各異的土壤細(xì)菌， 說(shuō)明小桐子根部土壤細(xì)菌具有豐富的多樣性， 與前人關(guān)于植物根 際細(xì)菌普遍存在的觀點(diǎn)是相符的。 3.2 抑制病原菌細(xì)菌的篩選 據(jù)報(bào)道，根際土壤微生物可通 過(guò)侵染位點(diǎn)的隔離與重寄生、 營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、 拮抗作用等抑制植物病 原菌5， 6， 8-10 。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)峙生長(zhǎng)法發(fā)現(xiàn)： 4株細(xì)菌雖然 不產(chǎn)生抑菌圈但會(huì)覆蓋褐黑葡萄座腔菌菌絲并抑制其生長(zhǎng)， 4 菌 株可能通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用抑制病原菌。 前人對(duì)土壤細(xì)菌的研究多數(shù)是對(duì)有關(guān)草本作物而非喬本植 物，雖然不能簡(jiǎn)單類比， 但顯然本研究分離到的抑制病原