聚合酶鏈反應(yīng)

1、 火菌雙蒸水 30卩 10X擴(kuò)增緩沖液 10卩1 4種dNTP昆合物，每種濃度為L 16卩1 引物1 5 卩 l(100pmol) 引物2 5 卩 l(100pmol) 模板DNA 2卩1 加滅菌雙蒸水至終體積1001 (2) 置94 C加熱5分鐘； 將卩l(xiāng) Taq DNA聚合酶(5iu/卩l(xiāng))加入反應(yīng)混合液中； (4) 將1001輕礦物油加入混合液表面，以防水分蒸發(fā)； (5) 按所設(shè)定的反應(yīng)條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)(在 PCR儀上進(jìn)行)； 反應(yīng)終止后，取樣品進(jìn)行凝膠電泳， Southern雜交或DNA序列分析以鑒定 是否得到特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。 衍生技術(shù) PCR可擴(kuò)增雙鏈DNA和單鏈DNA并能以RNA為

2、模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 以擴(kuò)增cDNA經(jīng)不斷發(fā)展和完善，已有多種衍生PCR技術(shù)。除反轉(zhuǎn)錄PCR外， 尚有不對稱PCR反向PCR錨定PCR多重PCR著色互補(bǔ)PCR免疫PCR和套 式PCF等。 (1) 反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcriptionPCR RT- PCR) RT- PCF用于擴(kuò)增 RNA 樣品。在PCR體系中先引入反轉(zhuǎn)錄酶，將 RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA再以cDNA做為 PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式擴(kuò)增cDNA這一技術(shù) 廣泛應(yīng)用于RNA和RNA病毒的檢測。 (2) 錨定PCR(Anchored PCR)通常進(jìn)行的PCR試驗(yàn)必須知道欲擴(kuò)增 D

3、NA或 RNA 片段兩側(cè)的序列，并以此為依據(jù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR當(dāng)欲擴(kuò)增的片段序列未知時(shí)， 可通過錨定PCR8行擴(kuò)增。其基本方法是分離細(xì)胞總 RNA或 mRN并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合 成cDNA通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA3端加上同源多聚物poly(dG)尾，通過 與其互補(bǔ)的錨定引物poly(dC)來保證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。 反向PCR(Inverse PCR)常規(guī)PCR是擴(kuò)增兩個(gè)已知序列之間的 DNA片段， 反向PCR則用于擴(kuò)增位于已知序列兩側(cè)的一段未知序列。 方法是使含已知序列和 未知序列的DNA片段環(huán)化，再用限制性內(nèi)切酶切開已知序列，這樣線性化后原位 于已知序列兩側(cè)的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g， 再

4、經(jīng)常規(guī)PCR操作就可大量 擴(kuò)增未知序列。 (4) 不對稱PCR(Asymmetric PCR)不對稱PCR又稱單鏈擴(kuò)增PCR 一般PCR反 應(yīng)中兩種引物的量是相等的，不對稱 PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為 50:1-100:1 ，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會被用完，大量 生成一條單鏈的DNA分離單鏈即可直接進(jìn)行序列分析等研究。 (5) 多重PCR(Multiplex PCR) 應(yīng)用PCR技術(shù)可檢測特定序列的存在或缺失。 某些疾病的基因片段較長，且常有多處發(fā)生缺失或突變，用一對引物進(jìn)行PCR 檢測時(shí)，擴(kuò)增不到目的片段，此時(shí)就須使用多重PCR技術(shù)。在同一反應(yīng)管中加入 多對

5、引物，擴(kuò)增同一模板的多個(gè)區(qū)域。如果某一片段缺失，或擴(kuò)增該片段的引物 與被檢核酸同源性太低，則在相應(yīng)的電泳圖譜上就無相應(yīng)的正常片段出現(xiàn)， 但可 保證其他特異片段出現(xiàn)。目前報(bào)道的多重PCF反應(yīng)，最多可同時(shí)擴(kuò)增12條區(qū)帶。 當(dāng)然，也可設(shè)計(jì)兩對引物，分兩次進(jìn)行常規(guī) PCR。 (6) 著色互補(bǔ) PCR(Colour complementation assay)著色互補(bǔ) PCR又稱熒光 PCR(Fluroscent PCR) 。其原理是用不同的熒光染料分別標(biāo)記不同的寡核苷酸引 物,通過多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。反應(yīng)結(jié)束后除去多余引物，擴(kuò)增產(chǎn)物 在紫外線照射下能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如

6、果某一 DNA區(qū)帶缺 失，則會缺乏相應(yīng)的顏色。通過顏色的有無及其組合可很快診斷基因的缺失、 有 較大變異或發(fā)現(xiàn)某些感染的病毒基因等。 這一技術(shù)為PCR技術(shù)的臨診自動(dòng)化診斷 打下了基礎(chǔ)。 免疫PCR免疫PCR即免疫多聚酶鏈反應(yīng)(Immuno- PCR)它是將高度靈敏 的PCR技術(shù)與特異的免疫學(xué)方法相結(jié)合的一種新型的診斷技術(shù)，是目前最有希望 的診斷方法。它的原理是通過應(yīng)用一個(gè)對 DNAft抗體具有雙重結(jié)合活性的聯(lián)接分 子使二者聯(lián)接起來，這樣就可以使作為指示系統(tǒng)的DNA分子通過抗體而特異性地 結(jié)合到抗原上，從而形成一種特異性“抗原-抗體- DNA復(fù)合物”，再通過對其 中已知片段DNA勺PCRT增，即

7、可證明抗原存在與否。這種方法的特點(diǎn)在于： 通過免疫捕獲作用純化檢測對象； 用于檢測的微生物無需事先明確其核酸序 列；該方法也適用于微生物以外的抗原檢測，其前提條件是被檢測對象具有 良好的抗原性，并且備有其相對應(yīng)的抗體；無需根據(jù)不同對象設(shè)計(jì)不同的引 物。被聯(lián)接的已知片段DNA相當(dāng)于指示劑，無論檢測對象是什么，只需合成針對 這段DNA的引物即可； 省去了普通PCR實(shí)驗(yàn)檢測RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄過程，即 增加了靈敏度又降低了實(shí)驗(yàn)成本。這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明者Sano，T.(1992) 等的試驗(yàn) 表明，免疫PCR的靈敏度比ELISA方法高10萬倍，足以檢測出單個(gè)抗原分子。 (8)套式PCR(Nested PCR)

8、普通PCR的產(chǎn)物DNA往往需要再擴(kuò)增，以便對之進(jìn) 行進(jìn)一步鑒定、分子克隆或用作其他用途。此時(shí)，由于DNA產(chǎn)物的末端效應(yīng)，用 原來的那對引物難以實(shí)現(xiàn)再擴(kuò)增的目的。如果在原來的引物內(nèi)側(cè)重新設(shè)計(jì)一對引 物，再進(jìn)行新一輪PCR則很容易獲得更大量的DNA產(chǎn)物。如果需要，還可再進(jìn) 一步擴(kuò)增，但每次需要在上一次產(chǎn)物的內(nèi)側(cè)重新設(shè)計(jì)引物。 這種采用多對成套引 物，逐步擴(kuò)增DNA內(nèi)側(cè)片段的PCF就稱為套式PCR目前很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 為了各自的研究需要都在應(yīng)用這一技術(shù)。 技術(shù)的用途 (1) 傳染病的早期診斷和不完整病原檢疫 在早期診斷和不完整病原檢疫方面， 應(yīng)用常規(guī)技術(shù)難于得到確切結(jié)果，甚至漏檢，而用PCR技術(shù)

9、可使未形成病毒顆粒 的DNA或 RNA或樣品中病原體破壞后殘留核酸分子迅速擴(kuò)增而測定，且只需提取 微量DNA分子就可以得出結(jié)果。 (2) 快速、準(zhǔn)確、安全檢測病原體 用PCR技術(shù)不需經(jīng)過分離培養(yǎng)和富集病原體， 一個(gè)PCR反應(yīng)一般只需幾十分鐘至2小時(shí)就可完成。從樣品處理到產(chǎn)物檢測， 一天之內(nèi)可得出結(jié)果。由于PCF對檢測的核酸有擴(kuò)增作用，理論上既使僅有一個(gè) 分子的模板，也可進(jìn)行特異性擴(kuò)增，故特異性和靈敏度都很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過常規(guī)的 檢測技術(shù)，包括核酸雜交技術(shù)。PCR可檢出fg水平的DNA而雜交技術(shù)一般在 pg水平。PCF技術(shù)適用于檢測慢性感染、隱性感染，對于難于培養(yǎng)的病毒的檢測 尤其適用。由于PCF操

10、作的每一步都不需活的病原體， 不會造成病原體逃逸，在 傳染病防疫意義上是安全的。 (3) 制備探針和標(biāo)記探針 PCR為核酸雜交提供探針和標(biāo)記探針。方法是： 用PCF直接擴(kuò)增某特異的核酸片段，經(jīng)分離提取后用同位素或非同位素標(biāo)記制得 探針。 在反應(yīng)液中加入標(biāo)記的dNTP經(jīng)PCRB標(biāo)記物摻入到新合成的 DNA鏈 中，從而制得放射性和非放射性標(biāo)記探針。 (4) 在病原體分類和鑒別中的應(yīng)用用PCR技術(shù)可準(zhǔn)確鑒別某些比較近似的病 原體，如藍(lán)舌病病毒與流行性出血熱病毒，牛巴貝斯蟲，二聯(lián)巴貝斯蟲等。 PCR 結(jié)合其它核酸分析技術(shù)， 在精確區(qū)分病毒不同型、 不同株、不同分離物的相關(guān)性 方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可從分

11、子水平上區(qū)分不同的毒株并解釋它們之間的差異。 此外，PCF技術(shù)還廣泛應(yīng)用于分子克隆、基因突變、核酸序列分析、癌基因和抗 癌基因以及抗病毒藥物等研究中。 技術(shù)應(yīng)用概況 從誕生至今約十年的時(shí)間里，PCR技術(shù)已在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到 廣泛的應(yīng)用。將PCF技術(shù)用于動(dòng)物傳染病的檢疫研究也日趨廣泛。例如，新西蘭 農(nóng)漁部質(zhì)量管理機(jī)構(gòu)所屬動(dòng)物健康實(shí)驗(yàn)室(AHLS )負(fù)責(zé)對各種外來病的疫情監(jiān)測 診斷，該室在1992年建立了幾項(xiàng)PCF檢測技術(shù)，包括從結(jié)核病病灶中快速檢測 牛分枝桿菌；快速檢測患病牛羊中副結(jié)核分枝桿菌； 檢測惡性卡它熱和新城疫等。 自1990年始，將PCR應(yīng)用于動(dòng)物傳染病的診斷等研究的報(bào)道，可歸納如下

12、 ： (1) 快速診斷各類病毒病 用PCR成功進(jìn)行檢測的動(dòng)物傳染病病毒有：藍(lán)舌病病 毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛白血病病毒、馬鼻肺炎病毒、惡性卡他 熱病毒、偽狂犬病病毒、狂犬病病毒。非洲豬瘟病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、 禽傳染性喉氣管炎病毒、馬傳染性肺炎病毒、馬立克氏病毒、牛冠狀病毒、魚傳 染性造血器官壞死病病毒、輪狀病毒、水道貓魚病病毒、水貂阿留申病病毒、山 羊關(guān)節(jié)腦炎病毒、梅迪維斯納病毒、豬細(xì)小病毒等。 (2) 由其它病原體引起的傳染性疾病的研究目前已報(bào)道的有致病性大腸桿菌毒 素基因、牛胎兒彎曲桿菌、牛分枝桿菌、炭疽桿菌芽孢、鉤端螺旋體、牛巴貝斯 蟲和弓形蟲等的PCF檢測研究。在食

13、品微生物的檢測中，PCF技術(shù)的應(yīng)用也日趨 廣泛。 Hornes等(1991)采用一種固相比色PCR技術(shù)成功檢測了大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素 (STs)Ia(STIa) 和 Ib(STIb) 基因。 ( 二) 連接酶鏈反應(yīng) 在連接酶的作用下兩段寡核苷酸能通過形成磷酸二酯鍵而 連接形成較長的核酸片段。連接酶鏈反應(yīng) (Ligase Chain Reaction，LCR)技術(shù)基 于如下原理：在65C，由于熱穩(wěn)定連接酶的作用，兩段與模板正確雜交的寡核 苷酸能連接形成新的較長的核酸片段。 通過高溫變性、 適溫退火和連接三步一循 環(huán)的反應(yīng)， 新形成的靶核酸片段成為下一循環(huán)的模板而使反應(yīng)延續(xù)， 這樣， 擴(kuò)增 產(chǎn)物將

14、象PCR一樣呈指數(shù)遞增。 LCR反應(yīng)體系需采用4個(gè)寡聚核苷酸引物，其中兩個(gè)與模板正鏈結(jié)合，另兩個(gè)與 負(fù)鏈相結(jié)合。引物長約15-20bp,故LCR擴(kuò)增產(chǎn)物長約30-40bp。由于擴(kuò)增產(chǎn) 物較短，循環(huán)反應(yīng)中的變性溫度一般應(yīng)比常規(guī) PCR要低。 熱穩(wěn)定連接酶分離自嗜熱細(xì)菌，它能精確識別與模板正確雜交的寡核苷酸引物。 由于堿基誤配而雜交上模板的非特異引物將不能起連接反應(yīng)。與PCR相比較,LCR 中非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的幾率很低，有資料表明，經(jīng)過50- 70個(gè)LCR循環(huán)， 非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物未有明顯增長，這樣，可保證反應(yīng)的高度敏感性和特異性。 LCR已應(yīng)用于檢測人乳頭瘤病毒、結(jié)核分枝桿菌等病原體。目前，L

15、CR的應(yīng)用范 圍遠(yuǎn)不如PCR廣泛，但LCR與PCR相結(jié)合，可有效解決分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的 一些問題，如啟動(dòng)子等小片段核酸的克隆等。 (三)Q B復(fù)制酶技術(shù) QB復(fù)制酶是QB噬菌體產(chǎn)生的一種依賴于 RNA的RNA 聚合酶。該酶于1963年由Haruna和Weissmanr等人發(fā)現(xiàn)并命名。QB復(fù)制酶能 以某些單鏈RNA為模板，在體外大量復(fù)制單鏈 RNA該酶有嚴(yán)格的模板特異性， 能在體外充當(dāng)QB復(fù)制酶模板的所有RNA分子均含大量的二級結(jié)構(gòu)，且模板和產(chǎn) 物RNA必須能在復(fù)制過程中形成穩(wěn)定的分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu)。 Lizardi及其合作者（1988）發(fā)現(xiàn)，在QB復(fù)制酶的天然模板MDV-1RNA中插入一 段瘧原

16、蟲（Plasmodium falciparum）的特異序列后，所形成的重組 RNA片段仍可 做為模板被QB復(fù)制酶大量擴(kuò)增。經(jīng)37C反應(yīng)半小時(shí)，可在模板含量最低的反 應(yīng)體系（約含1 000個(gè)分子）檢測到129ng的重組RNA分子，相當(dāng)于1億倍擴(kuò)增。 QB復(fù)制酶能擴(kuò)增經(jīng)過修飾的RNA片段，因此可應(yīng)用于診斷和檢測單鏈RNA或 DNA 序列。 據(jù)1992年發(fā)表的有關(guān)資料介紹，Gene Trak Systems的科研工作者已在用 QB 復(fù)制酶開發(fā)傳染病診斷的技術(shù)。 其技術(shù)要點(diǎn)如下：先用硫氰酸胍處理生物材料 （如 血、尿、腦脊髓液），使RNA釋放出來。由于QB復(fù)制酶通常不復(fù)制欲擴(kuò)增的特 異RNA序列，如HIV 1 RNA因此，待檢材料須再做如下處理，先用一捕獲探 針（捕獲探針與一種磁性小球偶聯(lián)）通過雜交反應(yīng)將HIV-1 RNA“釣”出來，隨后 洗脫其它未結(jié)合的RNA分子；將捕獲探針和HIV-1 RNA的復(fù)合體與插入另一段 HIV-1 RNA序列的重組MDV-1 RNA