云南紅豆杉居群的等位酶分析方法

1、云南紅豆杉居群的等位酶分析方法,me,cat,acp,gdh和adh等1o種酶系統(tǒng).由于胚乳的per,est,got,mdh,skd5種酶系兢顯示7較好的酶譜,用之進行酶位點及等位基因分析,結果表明,5種酶系統(tǒng)顯示714個位點,其中有兩個單態(tài)位點got一3和per-2,種群多態(tài)位點比率p一0.75,等位基因平均敷a=2,025.末研究揭示7云南缸豆種群酶位點及其等位基因譜帶的變異式樣,為進一步種群遺傳結構的研究提供7參考資料.關鍵詞:主壹塾墨塹!堡量;量竺型塹,蓬1恂中圖分類號:$791,495.55文獻標識碼:a文章編號:10017461(2000)04001006云南紅豆杉(taxusyu

2、manensi$)屬紅豆杉科(taxaceae)紅豆杉屬(taxus),為云南省級珍稀保護植物.主要分布于滇西,滇西北橫斷山區(qū)及鎮(zhèn)康,景東等海拔200043500m的溝谷與陰坡地段.常散生于林下蔭蔽處,與多種樹種混生.常見的森林類型有濕潤常綠闊葉林,鐵杉林,亞高山針闊混交林及云杉林.常見的半生樹種是麗江鐵杉,三尖杉,薄片青崗,華山橙,高山櫟,麗江云杉等.因紅豆杉植物體內(nèi)含有目前世界上最有效又最安全的抗癌藥物一紫杉醇(taxo1),因而受到廣泛重視和研究,同時也遭到大量的砍伐.云南紅豆杉中紫杉醇的含量高出其它紅豆杉幾倍一.使本來就比較貧乏的這一資源受到嚴重的砍伐和破壞.如不及時采取合理的保護措麓

3、,這一樹種將有瀕il缶滅絕的危險.因此,了解這一樹種天然居群的遺傳結構和遺傳變異情況,進而制定合理而有效的保護措施已成為當務之急.等位酶分析的方法是目前了解植物居群遺傳結構和遺傳變異的主要方法11.利用等位酶技術進行植物群體遺傳結構的分析在國內(nèi)外已有許多報道,還未見云南紅豆杉遺傳方面的研究報道.本研究以云南紅豆杉主要分布區(qū)滇西北的3個自然種群及人工林為材料,試驗了葉子及胚乳的l0種酶系統(tǒng),從表現(xiàn)較好的胚乳的5種酶系統(tǒng)的14個位點中選定了酶譜清晰的l0個收稿日期:2000-01.2o基金項目云南省自然科學基盒項目云南紅豆杉天然種群遺傳多樣性研究(96c128q)作者筒介:爵沙瑜(1968一).女

4、,助理研究員,從事林木遺傳研究工作*王選明t尹慶t李蓮芳等.紅豆杉扦插育苗適用技術講義.云南省林業(yè)科學院,1994?張茂欽,李選孝,左顯東等.珍稀瀕危樹種生物學特性及內(nèi)古物檢測研究報告.云南省林業(yè)科學院.199z第4期陳少臻等云南紅豆杉居群的等位酵分析方法l】位點及其等位基因,以便利于這些等位酶遺傳標志用于云南紅豆杉群體遺傳結構的研究.1材料|寅法1.1材料材料取自滇西北三江流域的3個自然種群,即:瀾滄江流域的鳳凰山林場,怒江流域的瀘水及金抄江流域的麗江及昆明樹木園的人工林.以其種子的大配子體作為實驗材料.各種群的地理位置和生境詳見表1.衰1云南紅豆杉4個種群的地理位置丑生境tableilto

5、nand=nviromnentoftolirtaxuspopulstlons812月種子成熟期,分單株采集種子.采回種子后,去外種皮,凈粒,置低溫冰箱中備用.葉子材料取自昆明樹木園的云南紅豆杉種群,采集的葉子材料應盡量是同齡同部位,葉子采回后立即制樣以確保酶活性.1.2方法實驗時,從各單株的混合種子中隨機抽取68粒種子的胚乳以確定母株的基因型,由于雌配子體為單倍體,可以直接用以分析是否符臺mende1分離規(guī)律,進而確定譜帶所代表的等位基因位點.同時以昆明樹木園云南紅豆杉人工林的同齡同部位葉子為材料,進行電泳試驗.1.2.1樣品制備實驗采用了3種酶提取緩沖液及2種試材,結果見襲2.每個胚乳或每0

6、.1g葉子用0.4ml酶提取液在冰浴中研磨提取酶蛋白,之后低溫下離b(10000r/rain)10rain,取出上清液,冷藏備用.1.2.2凝膠及電泳采用聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)垂直板式電泳,分離膠濃度為7.5,濃縮膠濃度為3%,電極緩沖液為n|窨一甘氨酸(ph8.3),電泳在4”c冰箱中進行,每樣上樣量為5o皿一.電泳時,濃縮膠部分電流1ma/樣,進入分離膠增至2ma/樣,電泳時間3.5h左右.1.2.3染色參照王仲仁“,cheliak及揚一平等人采用的方法.記錄結果,照相并用干膠儀將之櫥成永久性干膠片.-2結果及分析實驗檢測了per,est,mdh,me,skd,cot,acp,cat,gdh

7、及adh10種等位酶系統(tǒng).由于葉子次生物含量高,影響其酶帶分離,使酶譜嚴重拖尾或不清晰,加之是2倍體材料,因而不用于遺傳分析.肛乳材料試驗的10種酶中per,est,mdh,got,skd等5種酶譜帶清晰,共出現(xiàn)14個基因位點.以下著重對胚乳的這5個酶系統(tǒng)進行分析,5種酶基因型的表型如圖1所示.5種酶的電泳酶譜式樣見圖2612西北林學院15卷注;”+氌帶良好顯帶不好(有帶)i/無帶.1號提取疑沖畦;筒單磷酸提取鹱畦(0.1m.ph75)+5蔗糖+o.1)藏基乙醇+412(w/v)pvfii號提取緩藏雙帶出現(xiàn).:主叁,毒叁:.二瑩:熏叁i,曩詈:避iil般圖3esr3個位點的電泳酶譜式樣fi.3

8、pmndingpa:hernthree1iefig4ihadirjgpa,hera?,ff【”ifm1.h圈(【)13個位點的電泳酶譜式樣barfirlimtlcrnl,f,hreehiof(l盯j66?liiiii?e一3el一2est一1mdh一4mdh一3mdh一2mdh一1cot一3cot一2g吐一lper一2peti圖6per,3個位點的電泳酶譜式樣fig6bandingpathernofreelociofper2.3谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶glutamateoxaloacetatetransaminase(got)谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶又稱天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶aspartateamlnotra

9、nsferase(aat),是植物中研究較多的一種酶,存在于細胞液,葉綠體,線粒體和微體中.該酶通常受24個位點控制一3位點在各種群均不清晰,未分析+mdh.4位點總是出現(xiàn)4條平行的帶,之間并不形成雜合二聚體酶帶,推測是”轉(zhuǎn)錄后飾變”現(xiàn)象.王仲仁在某些蕨類植物的蘋果酸脫氫酶實驗中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象”2.5過氧化物醵peroxidase(per)過氧化物酶是比較復雜且不太穩(wěn)定的一種酶,單體或二聚體,213個位點,存在于細胞液,細胞壁中本研究中此酶的電泳結果也不太理想.在出現(xiàn)的兩個位點中,perl位點在一個種群中表現(xiàn)不清晰,未分析,另一個位點per-2為單態(tài)位點3結果討論在研究的4個種群14個基因位

10、點中,僅將其中在各種群都出現(xiàn)且表現(xiàn)清晰的10個位點用以遺傳學分析.其中g0t_3和per-2單態(tài)位點,其它皆為多態(tài)位點.有4個等位基因的位點有skd一1和est一1,有3個等位基因的位點有mdh一1,其余的為兩個等位基因的位點另外在skd一1,est一1,est-3及mdh一1位點中皆出現(xiàn)了雙帶的等位基因.本研究云南紅豆杉種群的多態(tài)位點比倒p一0.75,等位基因平均數(shù)a一2.0:85.揚一平研究紅松群體的p一0.67,a一2.25.對紅皮云杉自然群體遺傳多樣性的研究表明,群體的p=0.50,a一2.50;黃啟強研究報道【6,馬尾橙天然群體的p=0.76,a一2-39;wheeler和jeeh等

11、對taxusbrevaifotia的研究表明,其群體的p一0.68,a=2.00.由此可見,該研究的云南紅豆杉種群的酶位點及等位基因數(shù)的變異比較高通過上述4個云南紅豆杉種群5種酶系統(tǒng)1o個酶位點譜帶的遺傳分析,揭示了云南紅豆杉種群酶位點及其等位基因酶譜帶的變異情況,為云南紅豆杉種群遺傳結構及遺傳多樣性的進一步研究提供了有價值的參考圖譜,同時也為云南紅豆杉這一珍稀瀕危植物資源合理,有效保護策略的制定提供了基礎資料.參考文獻王仲仁.植物等也爵分析d.京科學出版社.1996.葛頸.王明席.陣岳武.用同工群研究馬尾橙群體的遺傳結構口.林業(yè)科學.1988,34(4),399409.揚一平.尹靖雪,張軍翦

12、.長白橙自然群體同工酶遺傳多樣性的研究呻.東北林業(yè)大學,1991.19(5);1725,揚一平.壬述札.尹靖薯.紅按群體內(nèi)和群體聞同工群v,?pctawawansm1.in.(in1.rep.pix一42)1984.21384.warx_rs咖maeevolutionary日nofpinusdm髓tamters.bputativetertiarhybrid.a0mevarj.applgenet.1990.80i635640.wh鼬knctleehkslgeerlcmt_啪tparameter嚆ti咖能intaxus帕婦】.c螄.jfor.r嚆.,1995.25r19131927.第4期陳少瑜等

13、云南紅豆杉居群的等位酶分析方法15allozymemethodinpopulationgeneticsstudyoftalsyunnanensischenshaoyu(yunnanproindolkeykoffestplantscutlpvationandutilizcantkrai.g650204?c口1abstract:verticalslabpolyacrylamidegelelectrophoresiswasusedtodetectgeneticdiversityoffourtaxusyunnanenaiapopulations.leavessmegametophytesandthee

14、nzymesystemsvcretested.however,handpatternsoffiveenzymesystems(per,est,mdh,got,andskd)infemalegametophytes,presumablycodedby10allozymelociandtheiraaeleswereobservedclearly.so,theyaretakenforgeneticanalysis.theresultsshowthatamong10loci,only2alemonomorph|clocus(got一3andper一2),andthepercentageofpolymorphiclociisp一0.75,th