完整word版基因工程期末復(fù)習整理

1、動物基因工程名詞解釋：1體細胞克?。阂泽w細胞（包括動物成體體細胞、胎兒成纖維細胞等）為受體，將目的基因以DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進行傳代培養(yǎng)的動物體細胞，再以這些體細胞為核供體，進行動物克隆。2、顯微注射：在顯微操作儀下，將 DNA用微吸管注射到處于原核時期受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖過程中通過DNA復(fù)制而整合到基因組，然后將轉(zhuǎn)化后的胚胎移植到受體子宮中繼續(xù)發(fā)育，得到轉(zhuǎn)基因動物。3、ES細胞：是指外源 DNA通過與受體細胞染色體 DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，整 ,從而改變細胞遺傳特性的方法。將一個結(jié)構(gòu)已知但功能不祥的基因去除，從4、基因打靶： 合到預(yù)定位點DNA水平上設(shè)計實驗，徹底破

2、5、基因敲除：壞該基因的功能或消除表達機制，從而推測該基因的生物學功能。6、乳腺生物反應(yīng)器：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因在動物乳腺中高效表達，在乳汁中生產(chǎn)目 的產(chǎn)品。問題：1 常用動物轉(zhuǎn)基因的方法有哪些？比較優(yōu)缺點顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法、胚胎干細胞法、基因打靶法、精子載體法體、細胞核移植 法、磷酸鈣共沉淀法。其中，常用動物轉(zhuǎn)基因的方法有顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法、胚胎干 細胞介導(dǎo)法。（1）顯微注射法的優(yōu)點：操作技術(shù)性很強顯微注射法的缺點：設(shè)備昂貴，胚胎死亡率高（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒法的優(yōu)點：操作簡便，可大量感染細胞，形成單拷貝，轉(zhuǎn)化率高逆轉(zhuǎn)錄病毒法的缺點：沒有包裝蛋白，不能形成完整的病毒顆粒2、談?wù)勅绾?/p>

3、獲得轉(zhuǎn)基因小鼠？顯微注射法：書118頁逆轉(zhuǎn)錄病毒法：書123頁胚胎干細胞法：書123頁3、 轉(zhuǎn)基因動物有哪些重要的應(yīng)用？（書138-143頁）（1）（2）（3）（4）研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì) 建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機理及治療方法 改善動物生產(chǎn)性能，提高動物育種效率作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器，可以通過家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價 的人體藥用蛋白。4、比較在細菌、真核細胞和動物個體中表達外源基因的優(yōu)缺點？動物：優(yōu)點：目的基因在哺乳動物細胞中表達的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白，哺乳動物細胞能以懸浮培養(yǎng)或在無血清的培養(yǎng)

4、基中達到高密 度且培養(yǎng)體積能達到 1000L以上缺點：A、哺乳動物細胞的表達水平低B、高表達細胞株構(gòu)建復(fù)雜C、細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝復(fù)雜 D、哺乳動物細胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類藥物的成本較高第三章基因工程常規(guī)技術(shù) 一、名詞解釋5J 31. klenow fragment: DNA聚合酶被枯草桿菌蛋白酶水解后產(chǎn)生的大片段，具聚合酶活性和37外切酶活性，是分子生物學中的重要工具。2. Taq酶：水生棲熱菌（Taq）中分離出的具有熱穩(wěn)定性的 DNA聚合酶。3. 核酸酶 S:來源于米曲霉素（aspergillusoryzas）,作用于ssDNA和ssRNA。4. 末端轉(zhuǎn)移酶：terminal transferas

5、e，來源于小牛胸腺。是僅存于前淋巴細胞及淋巴樣細胞內(nèi)的一種不同尋常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3 0H末端。5. 堿性磷酸酶（AKP/ALP ）：同源二聚體蛋白，分子量為 56KDa。每個單體由 449個氨基酸組成，同時每個單體均具有一個活性中心。是能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿 等。包括BAP （細菌堿性磷酶）和 CIP （小腸堿性磷酶）。6. Plasmid:質(zhì)粒，是細菌染色體外的閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，主要有F 質(zhì)粒（F因子或性質(zhì)粒）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）、Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）。7. 表達載體：具有克隆載體

6、的基本元件，還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的元件的載體。為了 有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強大的啟動子和終止子，為了實現(xiàn)翻譯，克隆基因必需有合適的SD（RBS）&穿梭載體（shuttle vector）:能在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體，可以運載目 的基因穿梭往返兩種生物之間。9. MCS :多克隆位點，指質(zhì)粒上的一段 DNA，其上包括一序列限制性內(nèi)切酶位點，以 利于外源DNA的插入。10. Cosmid :黏粒，柯斯質(zhì)粒。一種由質(zhì)粒和噬菌體聯(lián)合構(gòu)建的新載體。黏粒的基因組包括以下部分：質(zhì)粒復(fù)制原點、多克隆位點、抗藥性基因和入噬菌體兩端的cos位點。11. YAC :酵母人工染色體。利用釀酒酵母染色體的復(fù)制元件構(gòu)建

7、的載體，克隆能力為200-2000kb。YAC載體含有的著絲粒，端粒和復(fù)制起點三種成份可以 滿足YAC自主復(fù)制，染色體在子代細胞間分離及保持染色體穩(wěn)定的需要。YAC以環(huán)狀方式存在，具有大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制元件和選擇標記，以便保存和增殖。12. 脈沖電場凝膠電泳：DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時 間取決于它的大小。該方法可分離長至 5Mb的DNA分子。13. RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄PCR由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補 DNA（cDNA）稱作“逆轉(zhuǎn)錄”， 由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即

8、通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補 DNA。14. RACE : cDNA末端的快速擴增。禾U用PCR技術(shù)在已知部分 cDNA序列的基礎(chǔ)上特 異性克隆其5或3端缺失序列的方法。15. 差異顯示：利用一系列的oligo（dT）引物，逆轉(zhuǎn)錄真核生物細胞中全部表達的mRNA， 通過PCR擴增的方法，轉(zhuǎn)換成 cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因。16. Real-time PCR:實時定量熒光PCR是指在PCF反應(yīng)體系中加入熒光染料或 熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR進程，最后通過標準曲線對未知 模板進行定量分析的方法。17

9、. 基因組文庫：從某種生物體中分離出完整的染色體DNA并且用限制性內(nèi) 切酶消化到所需的平均長度，連于相應(yīng)的載體，構(gòu)建而成。18. CDNA文庫(eDNA Library )：含某種細胞特定時間所有的 mRNA?逆轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)生的cDNA與相應(yīng)載體(質(zhì)?；蚴删w)連接后，得到的重組克隆的總和19. 滴度：病毒懸液的濃度，可用pfu (噬菌斑形成單位)表示。如每微升的 噬菌斑形成單位(pfu/卩L)。20. 差減cDNA文庫：差減文庫也稱扣除文庫，對存在差異表達的兩種材料提 取mRNA或反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，用大大過量不含目的基因的一方作為驅(qū)動 子(Driver)與含有目的基因的試驗方(Tester)

10、進行雜交，選擇性的扣除兩部 分共同基因雜交形成的復(fù)合物，將含有目的基因的未雜交部分收集后，并連 接到載體形成文庫。21. Southern blotting : Northern blotting :都為核酸分子雜交技術(shù)。：探針與待測核酸序列之間的雜交。指將核酸轉(zhuǎn)移至固相載體(能吸附核酸的濾膜或濾紙)，用探針(酶或同位素等標記的核苷酸片段)去反應(yīng)，從而實現(xiàn)對核酸進行分析 和鑒定的技術(shù)。不同的是，Southern雜交的對象是DNA。另一個是RNA。22.缺口平移法： 有DNasel, Pol I,標記dNTP23. 原位雜交(in situ hybridization，ISH):探針直接與細胞或

11、者組織中的核酸進行雜交, DNA的變性、雜交及檢測等都在載玻片上進行，如菌落雜交、噬菌斑雜交、 交、組織切片原位雜交、整胚原位雜交。如果探針是由熒光底物標記，通過熒光顯微鏡進行直觀觀察，稱為熒光原位雜交。染色體雜最后的檢測可以將 DNA 或 RNA)定位、相對定量分析。陣列(DNA array)，在玻片、硅片、薄膜 固定了大量的靶DNA片段或寡核苷24. FISH ( fluoresce nee in situ hybridizatio n )：熒光原位雜交技術(shù)，是探針用特殊的核苷酸分子標記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢

12、測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、25. 基因芯片(DNA mieroarray):又稱 DNA等載體很小的基質(zhì)表面上有序地、高密度地排列、酸片段，形成了高密度的DNA微陣列。二.簡答題1.1)2)3)4)5)6)基因工程發(fā)展過程中標志性的事件有哪些？ 發(fā)現(xiàn)DNA連接酶分離限制性內(nèi)切酶與逆轉(zhuǎn)錄酶體外DNA重組技術(shù)的建立及基因工程的誕生DNA測序技術(shù)Ti質(zhì)粒作為植物基因工程的載體2.基因工程的基本原理是什么?PCR技術(shù)的發(fā)明簡述作為基因工程載體應(yīng)具備的條件。具有一個或多個限制酶切點，以供外源基因插入其中 具有標記基因，以鑒定重組是否進入受體細胞；能自我復(fù)制，否則可能導(dǎo)致重組丟失 ；

13、對受體細胞無害；大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進行操作，太大不便操作。在DNA模板、引物、dNTP、適當緩沖液（Mg2+）的混合物中，在耐高溫 DNA聚合酶 的催化下，對一對寡聚核苷酸所界定的 DNA片段進行擴增。這種擴增是通過模板 DNA與 引物之間的變性、退火（復(fù)性）、延伸三步反應(yīng)為一周期，循環(huán)進行，使目的 DNA片段得 以擴增。3.1）2）3）4）4.5）抗性標記基因編碼原理Ampr酶水解3 -內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性tetr1個膜蛋白阻止四環(huán)素進入細胞camr乙酰轉(zhuǎn)移酶生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性neor（ kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418 （卡那霉素衍生物）轉(zhuǎn)移酶失活h

14、ygr潮霉素3磷酸轉(zhuǎn)移酶使潮霉素3失活基因中常用的抗性標記有哪些，工作原理是什么?5. 質(zhì)粒DNA的分離提取及純化的方法有哪些，原理是什么?提取方法:方法原理堿裂解法在堿性條件下，染色體 DNA和質(zhì)粒DNA的氫鍵斷裂，致使 宿主染色體DNA變性，但閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA由于拓撲纏繞而 不能彼此分開。當以 pH 4.0的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其 pH至中 性時，質(zhì)粒DNA迅速恢復(fù)原有的構(gòu)型， 重新形成超螺旋分子， 保 存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 通 過離心，染色體 DNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被 除去。（小量制備質(zhì)粒DNA ）煮沸法沸水浴裂解細胞的同

15、時可破壞DNA鏈的堿基配對，并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與染色體 DNA變性，但CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊 密不會解鏈。當溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒 DNA。（對于某些特殊的質(zhì)粒，只能用煮沸的方法進 行提?。┻€有酚氯仿裂解法、SDS法、羥基磷灰石層析法等常用的純化方法有柱層析法，和氯化銫梯度離心法， 二者都利用了質(zhì)粒 DNA相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。具體的氯化銫梯度離心法原理是：溴化乙錠通過嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環(huán)質(zhì)粒 DNA中引入超螺

16、旋單位。最后，超螺旋度大為增加，從而阻止了溴化乙錠分子的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多溴化乙錠，直至達到飽和 堿基對大約結(jié)合1個溴化乙錠分子）。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán) 在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。（每2個DNA分子6. 藍白斑篩選（a互補篩選）的基本原理是什么？MCS處具有半乳糖苷酶 N端編碼基因（lacZ ,宿主菌具有該酶的 C端編碼基因，二 者結(jié)合能夠分解底物 X-gal，產(chǎn)物使菌落顯藍色。當目的基因插入 MCS時，lacZ 失活, 無a互補現(xiàn)象，菌落為白色。7.入噬菌體載體如何從入噬菌體改造而來？與質(zhì)粒載體相比有何特殊用途？去除入噬菌

17、體上的編碼溶原生命周期的非必須序列及一些限制性內(nèi)切酶位點，加入多克隆位點、某些篩選標記基因構(gòu)建而成的載體?？蓪⑼鈦砟康腄NA替代或插入中段序列（包裝范圍35-51 kb）,使其隨左右臂一起包裝成噬菌體。與質(zhì)粒載體相比具有轉(zhuǎn)化效率高、可 以容納長的外源 DNA、可將外源 DNA整合到細菌的基因組上等特點，適合建庫。 類型：包括插入型載體、置換型載體。8.簡述M13噬菌體的特點及在基因工程領(lǐng)域的用途。M13噬菌體是lacZ 篩選標記和 MCS與M13噬菌體基因組進行重組而形成的載體, 既能象質(zhì)粒一樣復(fù)制，又能產(chǎn)生單鏈DNA，用于DNA測序，體外定點誘變等。9. 限制性內(nèi)切酶有哪些類型：基因工程常用

18、的是哪一或幾類？ 限識別特定的DNA序列，在一定的條件下切割雙鏈可分為I、n、川三類：I類和川類在同一蛋白分子中兼具甲基化和內(nèi)切酶活性，識別和切 割位點不固定；II類酶是基因工程中主要的工具酶。DNA。10.1)2)限制性內(nèi)切酶有哪些特點？識別雙鏈分子的某種特定核苷酸序列使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開11.YAC為何能用于建立基因文庫？YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復(fù)制起點，兩個端YAC能夠容納長達幾百 kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因粒。有可能包含完整的基因,

19、 組文庫所需的克隆數(shù)目。12.試比較瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠(PAGE ):普遍用于蛋白質(zhì)及小分子核酸分析。 分辨DNA范圍：1-1000 bp。 瓊脂糖凝膠：孔徑較大，對蛋白質(zhì)不起分子篩作用，一般用于DNA的分析。分辨 DNA范圍：0.1-60 kb。相同點就是樣品都是帶負電荷的，從負極向正極移動，移動的距離都和樣品的分子量有關(guān)。13. 核酸染色的方法有哪些？各自的原理是什么?方法原理溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光銀染銀染色液中的Ag+可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物， 然后用還原劑如甲醛使 Ag + 還原成

20、銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA回收復(fù)雜SYBR Green I染料與DNA小溝結(jié)合(而EB則是嵌入到堿基之間)；最大激發(fā)波長497nm，最大發(fā)射波長520nm；高靈敏度，較低毒性；結(jié)合雙鏈DNA分子后熒光增 強 800-1000 倍14. 簡述PCR技術(shù)的基本原理。聚合酶鏈式反應(yīng)(P olymerase Cha in Reactio n)，簡稱PCR,是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。該技術(shù)是在模板 DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于 DNA聚合酶的酶 促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈 DN

21、A為模板，借助一小段雙鏈 DNA來啟動合成，通過一 個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈 DNA模板中的一段互補序列結(jié)合， 形成部分雙鏈。 在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物 3-0H末端，并以此為起始 點，沿模板573方向延伸，合成一條新的 DNA互補鏈。15. Real-time PCR分基本原理是什么？在基因表達分析方面有何優(yōu)點？全封閉PCR，無需跑膠，無需后處理；增加精確性，實時監(jiān)測，直觀看到反應(yīng)的對數(shù)期； 引物和探針同時與模板特異結(jié)合，降低反應(yīng)的非特異性; 結(jié)果分析快捷方便。實時定量熒光PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用 熒光信號積累實時監(jiān)

22、測整個PCF進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分 析的方法。1)2)3)4)Real-time PCR所使用的標記方法有哪些類型?16.1) SYBR熒光染料：2) TaqMan熒光探針：3) Molecular beacon分子信標探針:17. 分離基因常用的方法。類型常用方法用途質(zhì)粒DNA堿裂解法DNA重組基因組DNACTAB 法基因克隆、文庫構(gòu)建、遺傳多態(tài)性分析總RNA胍鹽法RT-PCR 克隆基因、Northern Blotting18. 外源基因?qū)胨拗鞯姆椒ㄓ心男Ｎ锢矸ǎ篋NA直接注射法；顆粒轟擊技術(shù)化學法：即用化學方法構(gòu)建非病毒載體系統(tǒng)，借之完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。有脂質(zhì)體載體法和受

23、體介導(dǎo)法(Adv )、單純皰疹病毒(HSV )、腺生物學方法：主要通過構(gòu)建病毒載體來完成。有腺病毒 相關(guān)病毒等。19. 基因組文庫的構(gòu)建的基本步驟有哪些？(1、基因組DNA的提取破碎細胞，抽提蛋白，沉淀核酸。(2、基因組DNA的片段化用限制性內(nèi)切酶 Sau3A (識別4堿基)對基因組 DNA進行部分酶切，能得到相對較長 的DNA片段?；厥?0 kb左右大小的片段。(3)DNA片段與載體連接DNA片段與用BamH I (與Sau3A為同尾酶)消化的置換型 入噬菌體載體臂進行連接, 構(gòu)成重組DNA分子。(4、重組分子的轉(zhuǎn)化與篩選重組DNA分子與包裝蛋白混合，就能夠自動完成包裝過程， 形成完整的、具

24、有很強感染能力的噬菌體顆粒。20. 簡述cDNA文庫構(gòu)建的基本步驟。(1) mRNA的制備提取總RNA，親和層析純化出 mRNA。(2) cDNA的合成mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成雙鏈 cDNA。(3、雙鏈cDNA與克隆載體連接雙鏈cDNA接上接頭，插入載體，構(gòu)成重組DNA分子。(4、重組分子的轉(zhuǎn)化與篩選21. cDNA的合成有哪些方法？mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成雙鏈 cDNA。cDNA第2條鏈的合成方法置換法：第一條鏈合成完成后，用 RNaseH降解雜交分子上的 mRNA鏈。利用降解后 的小片段作為引物， 大腸桿菌聚合酶I合成第二條鏈， 片段之間的缺口由連接酶連接， 形成 完整的cDN

25、A第二條鏈。這種方法應(yīng)用較廣，因為它能得到較完整的mRNA信息。自身引導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄酶體外合成DNA鏈結(jié)束前，DNA鏈會自己折轉(zhuǎn)回來幾個核苷酸形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)。DNA聚合酶I的Klenow片段從發(fā)夾結(jié)構(gòu)的末端開始合成DNA鏈，反應(yīng)完成后，用 RNaseH降解RNA鏈，用S1核酸酶（專門切割單鏈 DNA ）打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 用S1核酸酶對發(fā)夾結(jié)構(gòu)進行切割會導(dǎo)致部分cDNA序列信息的丟失，因此這種方法應(yīng)用較少。22. 基因芯片的基本原理及用途。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光

26、強度 最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物篩選等。為快速篩選和藥物基因組學研究提供技術(shù)支 撐平臺。也應(yīng)用在差異表達分析、雜交測序等技術(shù)中。23. 化學法測序法的基本原理。堿基通過特定化學試劑修飾后，哌啶甲酸使該位置的磷酸二酯鍵斷裂。G反應(yīng)：硫酸二甲酯使 G上的N7甲基化；A + G反應(yīng)：甲酸使 A和G嘌呤環(huán)上的N質(zhì) 子化；C + T反應(yīng)：肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂后重新環(huán)化成五元環(huán)；C反應(yīng)：鹽存在的條件下，肼只與C反應(yīng)；DNA的核苷酸凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出 序列。適用性：測定短 DNA片段和

27、某些被修飾的 DNA。24. Sanger測序法的基本原理。酶法（San ger法、雙脫氧法、末端終止法）。利用雙脫氧核苷酸 2 ,3 -ddNT P來終止 DNA的聚合反應(yīng)。樣品一鏈為模板，引物5端標記。在4只試管中分別加入適當?shù)囊?、模板?中dNTP、DNA聚合酶，再分別加入一種ddNTP。與模板結(jié)合引物在 DNA聚合酶作用下從5端向3端進行延伸反應(yīng)。當 ddNTP參入時，由于它在 3位置沒有羥基。故 不與下一個dNTP結(jié)合從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列不同長 度的新的DNA鏈。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時分離4只管中的反應(yīng)物，由于每一反應(yīng)管中只加入了 ddN

28、TP，則該管中各種長度的 DNA都終止于該堿基，且電泳中該泳道不同帶 DNA3 端為同一種ddNTP。根據(jù)泳道中DNA帶位置讀出與模板鏈互補的新鏈系列。25.酵母雙雜交技術(shù)的基本原理將BD與已知蛋白E融合產(chǎn)生的BD-E稱為誘餌（Bait）,將AD與末知蛋白F融合產(chǎn)生 的AD-F稱為獵物（Prey）,當誘餌釣到獵物時（E和F間有相互作用），轉(zhuǎn)錄激活因子就能 激活目標基因（報告基因）的轉(zhuǎn)錄與表達26.1)2)3)4)核酸雜交中， 缺口平移法： 隨機引物法： 末端標記法：探針標記的方法有哪些？標記 dNTP標記 dNTP堿性磷酸酶和多核苷酸激酶5標記；末端轉(zhuǎn)移酶 3標記PCR法：標記dNTP基因在大

29、腸桿菌、酵母中的高效表達名詞解釋：1、SD序列：mRNA中的核糖體結(jié)合位點，位于翻譯起始位點上游，負責翻譯的起始2、 表達載體：在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等）， 使目的基因能夠表達的載體3、融合表達：動物或者是植物的細胞經(jīng)過某種培養(yǎng)經(jīng)過酶的作用使其細胞相融合構(gòu)成的新 細胞4、in elusion body：包含體，蛋白質(zhì)在大腸桿菌中大量表達時，在胞內(nèi)聚集形成不可溶的、 沒有生物活性的固體顆粒。5、T7啟動子：A. 強大的T7啟動子完全專一受控于T7 RNA聚合酶，B. T7 RNA 聚合酶合成 mRNA的速度比大腸桿菌 RNA聚合酶的快 5倍C. 由于大腸

30、桿菌本身不含T7 RNA聚合酶，需要將外源的T7 RNA聚合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5啟動子控制下，IPTG間接誘導(dǎo)）。6、AOX1 :編碼乙醇氧化酶的基因問題：1、表達載體有哪些特點？（1 ）、具有強的啟動子，如 T7、SP6 tac、入的PL等；（2）、啟動子和ATG之間具有核糖體結(jié)合位點（SD序列）；（3）、具有強的轉(zhuǎn)錄終止序列。2、談?wù)刾ET表達載體系統(tǒng)表達目的蛋白的優(yōu)點。3、蛋白質(zhì)分泌表達的優(yōu)點及影響因素？蛋白質(zhì)分泌表達的優(yōu)點：1. 由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類比較少，因此目標蛋白質(zhì)的純化就比較簡單2. 蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴重3. 促進了二硫鍵的形成及

31、蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境）4. 蛋白質(zhì)的N-末端結(jié)構(gòu)真實正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中，在體內(nèi)對信號肽進 行切割影響分泌表達的因素：（1）信號肽存在與否及類型；（2）啟動子強弱；誘導(dǎo)劑濃度；（3）宿主菌的類型；培養(yǎng)條件（溫度、培養(yǎng)基）產(chǎn)量高、表達高效；操作簡單（可調(diào)控表達、方便純化） 可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)；成本低。4、原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)相比，各自的優(yōu)缺點是什么？ 原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點：（1）（2）（3）（4）原核表達系統(tǒng)的缺點：（1）缺乏真核中的修飾系統(tǒng)，產(chǎn)物有時缺乏活性。（2）表達產(chǎn)物易形成包含體真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點：書 78頁（甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點）缺乏強有力的啟動子 分泌效率差 表達

32、質(zhì)粒易丟失易培養(yǎng)、繁殖快、便于基因操作 真核表達系統(tǒng)的缺點：（1）（2）（3）5、原核表達中產(chǎn)生包含體的原因及解決措施有哪些？原核細胞缺乏真核細胞的修飾系統(tǒng)；缺乏折疊所需的酶和輔助因子，無法正確折疊; 合成速度過快，產(chǎn)量太高；蛋白質(zhì)類型；培養(yǎng)條件（溫度及培養(yǎng)基）產(chǎn)生包含體的原因：（1）（2）（3）（4）（5）解決措施：（1）降低培養(yǎng)溫度；誘導(dǎo)物濃度；（2） 培養(yǎng)基中加入添加劑；培養(yǎng)基組分、pH等。6、酵母菌表達外源蛋白的優(yōu)點。（1）遺傳背景清楚（2）屬真核模式生物，具備蛋白質(zhì)翻譯后加工系統(tǒng)（3）可發(fā)酵生產(chǎn)（4）不產(chǎn)生內(nèi)毒素，屬安全的表達系統(tǒng)7、甲醇酵母表達系統(tǒng)的基本構(gòu)成及特點基本構(gòu)成：甲醇酵母

33、表達載體為整合型質(zhì)粒，整合位點一般位于HIS4（組氨酸脫氫酶基因）區(qū)或A0X1（乙醇氧化酶）區(qū)。載體上含有 5 A0X1啟動子、多克隆位點、 3 A0X1終止子，以 HIS4基因作為互補選擇標記。特點：8、自選一種新型的有藥用價值的細胞因子，提出基因克隆、蛋白質(zhì)表達與純化、生物活性 測定的實驗研究方案。書80-83頁基因工程第五章植物基因工程一、名詞解釋Ti質(zhì)粒：環(huán)狀DNA分子，分子量90150 X 106 D,其長度約200250kb。分為章魚堿型、 胭脂堿型和農(nóng)桿堿型。由T-DNA區(qū)、毒性（vir）區(qū)、結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)（con ）、復(fù)制起始區(qū)（ori）組成。T-DNA :決定腫瘤的形態(tài)和冠瘤堿的

34、合成，兩端25bp同向重復(fù)序列（左臂和右臂）。雙元載體系統(tǒng)：雙元載體系統(tǒng)，包括兩個質(zhì)粒，一個是帶有T-DNA的微型質(zhì)粒（雙元Ti載體）,一個是帶有Vir區(qū)的輔助質(zhì)粒。、酶基因（如報告基因：編碼易于檢測的產(chǎn)物的基因，包括抗性基因（抗生素、抗除草劑） gus）和發(fā)光基因（如 gfp）等。二、問答1、回答植物基因工程技術(shù)實施的基本策略？3）繁殖擴增重組 DNA （ 4）目的它能在自然條件下趨化性地感染大 根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞答：（1） 目的基因分離和鑒定（2）植物表達載體的構(gòu)建（ 基因向植物細胞的轉(zhuǎn)化（5）轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定。2、簡述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本原理？答：農(nóng)桿菌是普遍

35、存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌， 多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段 T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后， 可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將 目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。3、植物轉(zhuǎn)基因中用到的報告基因有哪些？答：gfp基因、gus基因、luc基因、Npt- n基因、aphIV基因、spt基因、Bar基因、epsps基 因。4、什么是基因沉默，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因發(fā)生失活的原因有哪

36、些？答：基因轉(zhuǎn)入后不表達的現(xiàn)象，稱為基因沉默。導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因發(fā)生失活的原因有：位置效應(yīng)、 DNA甲基化、重復(fù)序列誘導(dǎo)、共抑制。5、植物基因工程技術(shù)的應(yīng)用有哪些方面？答：（1 ）農(nóng)作物基因工程提高農(nóng)作物抗性1）抗病性：抗病基因；抗病毒基因；病程相關(guān)蛋白類基因。2） 抗蟲性：毒蛋白基因，如蘇云金芽孢桿菌（Bt）毒蛋白基因等；蛋白酶抑制劑基因，如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（Cp TI）等；淀粉酶抑制劑基因，如菜豆a2淀粉酶抑制劑基因等；昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因，如蜘蛛毒素基因等。超氧3）抗自然災(zāi)害：逆境誘導(dǎo)的植物蛋白激酶基因；編碼細胞滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)基因; 化物岐化酶（SOD）基因；防止細胞蛋白質(zhì)變性的基因。性

37、狀控制1）延長存儲期：多聚半乳糖醛酸酶基因；乙烯合成酶基因。（HMW） 基因。2）改善營養(yǎng)品質(zhì)和技術(shù)性狀：高賴氨酸基因；高分子量谷蛋白亞基3） 代謝分配的調(diào)節(jié)：木質(zhì)素生物合成酶基因AD、OMT。（2 ）植物生物反應(yīng)器，通過大規(guī)模種植脂類植物生物反應(yīng)器是指通過基因工程途徑，以農(nóng)作物作為“化學工廠”生產(chǎn)具有高經(jīng)濟附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、及其它一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法。1）可食用植物疫苗：食用含有抗原的新鮮水果，使食用者腸道免疫系統(tǒng)激發(fā)對病原體 的抗 病能力，如乙肝、艾滋病等。2） 利用植物生產(chǎn)抗體：利用植物合成細菌（突變鏈球菌，引起齲齒）抗體。3） 植

38、物營養(yǎng)品：水稻中過量表達維生素A霍植物甾醇類，可減少人體內(nèi)的膽固醇。6、談?wù)勀銓D(zhuǎn)基因植物的安全性的認識？答：首先是毒性問題。一些研究學者認為，對于基因的人工提煉和添加，可能在達到某些人 們想達到的效果的同時，也增加和積聚了食物中原有的微量毒素。其次是過敏反應(yīng)問題。對于一種食物過敏的人有時還會對一種以前他們不過敏的食物產(chǎn) 生過敏，比如：科學家將玉米的某一段基因加入到核桃、小麥和貝類動物的基因中，蛋白質(zhì)也隨基因加了進去，那么，以前吃玉米過敏的人就可能對這些核桃、小麥和貝類食品過敏。第三是營養(yǎng)問題。科學家們認為外來基因會以一種人們目前還不甚了解的方式破壞食物 中的營養(yǎng)成分。第四是對抗生素的抵抗作用

39、。當科學家把一個外來基因加入到植物或細菌中去，這個基因會與別的基因連接在一起。 人們在服用了這種改良食物后，食物會在人體內(nèi)將抗藥性基因傳給致病的細菌，使人體產(chǎn)生抗藥性。第五是對環(huán)境的威脅。在許多基因改良品種中包含有從桿菌中提取出來的細菌基因， 這種基因會產(chǎn)生一種對昆蟲和害蟲有毒的蛋白質(zhì)。在一次實驗室研究中， 一種蝴蝶的幼蟲在吃了含桿菌基因的馬利筋屬植物的花粉之后，產(chǎn)生了死亡或不正常發(fā)育的現(xiàn)象，這引起了生態(tài)學家們的另一種擔心，那些不在改良范圍之內(nèi)的其它物種有可能成為改良物種的受害者。最后，生物學家們擔心為了培養(yǎng)一些更具優(yōu)良特性，比如說具有更強的抗病蟲害能力 和抗旱能力等，而對農(nóng)作物進行的改良，其特性很可能會通過花粉等媒介傳播給野生物種。第八章蛋白質(zhì)工程一、名詞解釋:蛋白質(zhì)工程：以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過分子設(shè)計，將蛋白質(zhì)改造為合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)的過程。改變一個核苷酸到改變定點突變：專一改變基因中某