宏基因組測序技術(shù)檢測方法

1、因組測序技術(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)簡介：因組測序介紹因組學(xué)是以環(huán)境樣品中的微主物群體基因組為研究對(duì)象，通過現(xiàn)代基因組 技術(shù)手段包括功能基因的篩選和測序分析，對(duì)環(huán)境中微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、 進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系以及環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行研究的新的微生物 研究方法。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為因組學(xué)研究提供了新的理想研究方法。 高通量測序的方法無需分離環(huán)境中各種微生物，也無需構(gòu)建克隆文庫就可以直接 對(duì)環(huán)境中所有微生物進(jìn)行測療;。可以真實(shí)客觀的反映環(huán)境中微生物的多樣性、種 群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等。LI前乂可以分為針對(duì)16sDNA/18sDNA/ITS測序和針對(duì) 因組全序列的測序研究。下面就是對(duì)這兩者的具體介

2、紹。一、16s DNA/18s DNA/ITS 測序16SDNA是最常用的微生物物種分子鑒定的標(biāo)簽，通過對(duì)樣品中16SDNA 測序可以鑒定其中微生物物種的豐度和分布情況。U前，普遍使用Roche 454 平臺(tái)來對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行16s DNA測序。因?yàn)?6SDNA序列比較相似，讀長短的 話，難以進(jìn)行有效的比對(duì)，而454平臺(tái)的平均讀長在400bp左右，可以很好的 避免此類問題。二、因組全測序在這種測序方式中，我們可以假定一個(gè)環(huán)境中的所有微生物就是一個(gè)整體, 然后對(duì)其中所有的微生物進(jìn)行測序。這樣我們就可以研究樣品中的功能基因以及 其在環(huán)境中所起的作用而不用關(guān)心其來自哪個(gè)微生物?？梢园l(fā)現(xiàn)新的基因，可以

3、進(jìn)行基因的預(yù)測，甚至有可能得到某個(gè)細(xì)菌基因組的全序列。此外，該項(xiàng)測序不 單可以針對(duì)DNA水平，也可以針對(duì)全RNA進(jìn)行基因表達(dá)水平的研究。樣品處理：因組樣品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮膚和糞便。樣品 采集遵照樣品采集規(guī)（人）所規(guī)定的操作來進(jìn)行。盡量留足備份樣品。核酸提取：因組核酸提取主要有兩種方法:膜過濾法和直接裂解提取。對(duì)于液體樣品如痰液,灌洗液兩種方法都適用，對(duì)于固體樣品如糞便宜采用直接裂解的方法。核酸提取 后用 NanoDrop ND-1000 測定，260/280 = 1.8-2.0,260/230= 1.8-2.0,電泳檢測DNA應(yīng)是完整的一條帶。測序 Sequen

4、cing1) 16S/18S 測序：Sanger 測序：用于低通量的16S/18S DNA測序，提取因組后，首先通過PCR將16S/18S丿了; 列擴(kuò)增出來，再將其連接到克隆載體上，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，涂平板做藍(lán)白斑篩選， 選出陽性克隆提質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測序反應(yīng)，測序反應(yīng)后純化后用ABI 3130或 ABI 3730進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序。山于其測序準(zhǔn)確率比較高，而通量非常低,現(xiàn)通常用做二代測序結(jié)果的驗(yàn)證。454 Platform：454 平臺(tái)主要包括兩種測序系統(tǒng)：454 GS FLX+ System 和 454 GS Junior System = 454 GS FLX+ System 測序讀長可以

5、達(dá)到 600-1000bp,通量 450-700M, GS Junior System 測序讀長在400bp左右,通量在35MoLibrary Preparation Amplify ribosomal RNA targets from sampled usingfusion primers.Sequencing Amplified rRNA amplicons proceed directly inlo cmPCR and soquencing using the GS FLX* System (XLR70 Sequencing Kil only) or GS Junior SystemDa

6、ta Analysis Utilize a variety of free and commercial software packages to assess microbiol populotion diversity ond make comparisons. GS Amplicon Variant Analyzer (AVA) sofuvare GS Reference Mapper software Public motagcnomic analysis toolsFigure 2: Workflow of a nbosoml rNA ampliconsequencing exper

7、iment LOrary preparation using a direciio-nal primer common to al species enables mterrogatwn of more in a single sequencing rw. For detailed mfonnion.www.my4S.文庫構(gòu)建：用fusion Primer擴(kuò)增核糖體RNA,將已擴(kuò)增的rRNA直接做乳液PCR,在GSFLX+和GS Junior系統(tǒng)上進(jìn)行測序。測序深度：數(shù)據(jù)分析：使用免費(fèi)的軟件包對(duì)微生物的種群多樣性進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行比較。1. MEGAN： 一個(gè)因組分析工具，可以在大量的測序數(shù)據(jù)中

8、對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行聚類 分析。2. MG-RAST：用于注釋因組樣品的全自動(dòng)軟件。3. IMG/M :基于因組序列微生物群體的功能性。4. CAMERA：致力于微生物生態(tài)學(xué)研究。5. CARMA：可以通過未拼接的序列來進(jìn)行物種組成和微生物的遺傳潛力的研究。6. GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆蟲等。7. Greengenes： 16S rRNA的數(shù)據(jù)庫，可以用來做16S rRNA的比對(duì)。8. QIIME：針對(duì)454測序數(shù)據(jù)的因組分析。9. The Ribosome Database Project (RDP)：針對(duì)焦磷酸測序的分析方法。Miseq Platform：Miseq 平臺(tái)讀長

9、可以是 2X250bp 或 2X300bp。使用 Miseq Reagent Kit V2 可以產(chǎn)出7.5-8.5Gb的數(shù)據(jù)，使用Miseq Reagent Kit V3可以產(chǎn)出13.2-15Gb的數(shù)據(jù)。z Figure 1:16S Amplicon Sequencing WorkflowDesign and order region of interest-specific primersGenerate template library by PCRNormalize and pool librariesand sequencing on the MiSoq systemView data

10、 using the Metagenomics 16S rRNAWorkflow in MiSeq Reporter or AmpliconViewer in BaseSpace16S ampkn sequencing e a dGnonsrat9d protocol for the MlSoq system, indudr sam0e preparation, sequencing, and autcmated data analyas vsith on-rtstrunem software for reMZng results.文庫構(gòu)建：根據(jù)感興趣的片段設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增出片段做為模

11、板構(gòu)建文庫。使用 Nextera XT Sample Prep Kit構(gòu)建文庫，按照試劑盒說明書操作。將建好的文庫歸 一化處理并將其混到一起。在Miseq系統(tǒng)里自動(dòng)進(jìn)行成簇反應(yīng)，進(jìn)而完成測序。 文庫檢驗(yàn)：用Agilent 2100檢測文庫大小片段是否與預(yù)期一致。文庫片段是否集中。測序深度：16S rRNA測序深度應(yīng)至少在50,000條reads以上，以保證較好的覆蓋度。數(shù)據(jù)分析：對(duì)微生物生態(tài)進(jìn)行定量觀察Greengenes： 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫和分析工具；因組分析工具：MEGAN核糖體數(shù)據(jù)庫il劃(RDP)Ion Torrent Platform：Ion Torrent 平臺(tái)主要有兩個(gè)

12、測序系統(tǒng)：Ion PGM System 和 Ion Proton System Ion PGM有兩種讀長,200bp和400bp, Ion PGM主要應(yīng)用三種芯片,Ion 314 Chip, Ion 316 Chip和Ion 318 Chip,最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可以達(dá)到2Gb。Ion Proton讀長為200bp, 最多數(shù)據(jù)產(chǎn)出可達(dá)到10Gb。文庫構(gòu)建：使用 Ion Plus Fragment Library Kit 為 16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物加上 barcode 標(biāo)簽， 共有96個(gè)barcode可以選擇。加上標(biāo)簽后使用Ion PGM Template 0T2 200 Kit 在Ion OneT

13、ouc* DL System上進(jìn)行乳液PCR,完成文庫構(gòu)建。測序時(shí)根據(jù)需要 不同的讀長選擇不同的測序試劑盒。測序深度：對(duì)于人體腸道微生物16S rRNA測序，對(duì)于檢測高豐度的樣品，每個(gè)樣品至 少要測10000條reads,而對(duì)于檢測低豐度的樣品，則需要1,000,000以上的reads 數(shù)。2)全因組測序 Whole-metagenomics SequencingRoche 454 platform:文庫構(gòu)建：提取因組DNA,總量不低于10ug,且樣品DNA應(yīng)相對(duì)完整。使用GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit構(gòu)建文庫，按照說明書進(jìn)行相應(yīng)操作

14、。 文庫檢驗(yàn)：DNA reads數(shù)與微球的比例在8%左右，可以達(dá)到比較理想的測序結(jié)果。 測序深度：每個(gè)樣品應(yīng)至少保證10,000條以上的reads數(shù)。Hiseq platform:Hiseq平臺(tái)主要有Hiseq 2000和Hiseq 2500兩個(gè)測序系統(tǒng)。Hiseq 2000測序 讀長是2X100bp Paired-end測序，一次運(yùn)行通量可達(dá)600Gb以上，Hiseq 2500有 兩種運(yùn)行模式：快速運(yùn)行和高通量，快速運(yùn)行可以達(dá)到2X150bp,產(chǎn)生最多180Gb 的數(shù)據(jù)，高通量讀長在2X125bp,數(shù)據(jù)產(chǎn)出在600Gb以上。文庫構(gòu)建：將提取的因組DNA用Covaris M220片段化后，使用Truseq DNAXT/LT Sample Prep Kit (illumina)按照protocol進(jìn)行文庫構(gòu)建，DNA起始投入量應(yīng)在lug以上。 文庫檢驗(yàn)：將建好的因組文庫