臨床微生物檢驗：分枝桿菌屬

1、 緩慢生長菌緩慢生長菌 （7 7天出現(xiàn)菌落）天出現(xiàn)菌落） 迅速生長菌迅速生長菌 （7 7天出現(xiàn)菌落）天出現(xiàn)菌落） 不能培養(yǎng)菌不能培養(yǎng)菌麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌 偶發(fā)分枝桿菌偶發(fā)分枝桿菌 龜分枝桿菌龜分枝桿菌 膿腫分枝桿菌膿腫分枝桿菌 草分枝桿菌草分枝桿菌 分枝桿菌屬分枝桿菌屬 人結(jié)核分枝桿菌人結(jié)核分枝桿菌 牛分枝桿菌牛分枝桿菌 非洲分枝桿菌非洲分枝桿菌 坎納分枝桿菌坎納分枝桿菌 田鼠分枝桿菌田鼠分枝桿菌 堪薩斯分枝桿菌堪薩斯分枝桿菌 瘰疬分枝桿菌瘰疬分枝桿菌 鳥分枝桿菌鳥分枝桿菌 分枝桿菌的分類：分枝桿菌的分類： 非非 結(jié)結(jié) 核核 分分 枝枝 桿桿 菌菌 結(jié)核結(jié)核 分枝分枝 桿菌桿菌 群群 光

2、產(chǎn)色菌光產(chǎn)色菌 （Runyon I群）群） 暗產(chǎn)色菌暗產(chǎn)色菌 （Runyon II群）群） 不產(chǎn)色菌不產(chǎn)色菌 （Runyon III群）群） 迅速生長分菌（迅速生長分菌（Runyon IV群）群） o一類直或微彎曲的桿菌，有分枝生長趨勢，細(xì)胞 壁脂質(zhì)含量高，抗酸染色陽性。 o耐酸堿,對氧和營養(yǎng)要求高，生長緩慢。 o不產(chǎn)生毒素和侵襲酶類，菌體成分致病，感染為 慢性。 分枝桿菌屬共性分枝桿菌屬共性 Mycobacterium Tuberculosis，MTB 結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌 一、分類一、分類 結(jié)核分枝桿菌群結(jié)核分枝桿菌群中人結(jié)核分枝桿菌中人結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率感染的發(fā)病率 最高，約占

3、最高，約占90%90%。 人結(jié)核分枝桿菌人結(jié)核分枝桿菌 牛分枝桿菌牛分枝桿菌 非洲分枝桿菌非洲分枝桿菌 坎納分枝桿菌坎納分枝桿菌 田鼠分枝桿菌田鼠分枝桿菌 Mycobacterium Tuberculosis，MTB 結(jié)核結(jié)核 分枝分枝 桿菌桿菌 群群 結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌 o通過通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進(jìn)入機體進(jìn)入機體， 侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官，其中以侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官，其中以肺結(jié)肺結(jié) 核最常見核最常見?？煞挚煞衷l(fā)感染原發(fā)感染和和繼發(fā)感染繼發(fā)感染。 脊柱結(jié)核脊柱結(jié)核繼發(fā)性肺結(jié)核繼發(fā)性肺結(jié)核皮膚結(jié)核皮膚結(jié)核 腦結(jié)核腦結(jié)核 二、臨

4、床意義二、臨床意義-2.-2.所致疾病所致疾病 脊椎結(jié)核導(dǎo)致脊椎畸形患者脊椎結(jié)核導(dǎo)致脊椎畸形患者 肺結(jié)核肺結(jié)核是一種慢性消耗性傳染病。是一種慢性消耗性傳染病。 結(jié)核桿菌不斷侵蝕肺組織，引起肺部結(jié)核桿菌不斷侵蝕肺組織，引起肺部 炎性細(xì)胞的浸潤，使肺組織發(fā)生炎癥，造炎性細(xì)胞的浸潤，使肺組織發(fā)生炎癥，造 成滲出、增生、壞死及纖維鈣化等病變。成滲出、增生、壞死及纖維鈣化等病變。 結(jié)核病結(jié)核病 全球三大傳染病： 結(jié)核病結(jié)核病 AIDS愛愛滋病滋病 TB結(jié)結(jié)核病核病 Malaria瘧疾瘧疾 結(jié)核?。航Y(jié)核病：近年來發(fā)病成上升趨勢，近年來發(fā)病成上升趨勢，已成為危已成為危 脅人類健康的嚴(yán)重的全球性重大公共衛(wèi)生問

5、脅人類健康的嚴(yán)重的全球性重大公共衛(wèi)生問 題，題，“白色瘟疫白色瘟疫”。WHO宣宣布布TB十年十年(2006- 2015)減減半半計劃。計劃。 20世紀(jì)世紀(jì)80年代以來，由于年代以來，由于HIV與結(jié)核桿菌與結(jié)核桿菌 混合感染、移民以及耐藥結(jié)核桿菌的出現(xiàn)，結(jié)混合感染、移民以及耐藥結(jié)核桿菌的出現(xiàn)，結(jié) 核病又在全球全面復(fù)活。核病又在全球全面復(fù)活。 目前，結(jié)核病已成為傳染病中的第一殺手目前，結(jié)核病已成為傳染病中的第一殺手 和最大死因。和最大死因。 結(jié)核病危害人類健康已經(jīng)有幾千年的歷史了。結(jié)核病危害人類健康已經(jīng)有幾千年的歷史了。 結(jié)核病結(jié)核病 很早以前，法國杜鮑阿通過尸體解剖發(fā)很早以前，法國杜鮑阿通過尸體

6、解剖發(fā) 現(xiàn)，結(jié)核病人肺部有白色的、較硬的，象粟?，F(xiàn)，結(jié)核病人肺部有白色的、較硬的，象粟粒 大小的一顆顆小結(jié)節(jié)，類似堅果的核，稱之為大小的一顆顆小結(jié)節(jié)，類似堅果的核，稱之為 “結(jié)核結(jié)核”。 1700年，日內(nèi)瓦孟格脫醫(yī)生發(fā)現(xiàn)了年，日內(nèi)瓦孟格脫醫(yī)生發(fā)現(xiàn)了“結(jié)核結(jié)核 ”和和“干酪樣物質(zhì)干酪樣物質(zhì)”。 發(fā)現(xiàn)歷史發(fā)現(xiàn)歷史 18811881年，年，KochKoch致力于結(jié)核病病因的研究。致力于結(jié)核病病因的研究。 KochKoch認(rèn)為，認(rèn)為，“結(jié)節(jié)、結(jié)核結(jié)節(jié)、結(jié)核”里肯定存在具里肯定存在具 有傳染性的病原菌。有傳染性的病原菌。 18821882年，年，KochKoch首先在結(jié)核病灶中發(fā)現(xiàn)了細(xì)長首先在結(jié)核病灶中

7、發(fā)現(xiàn)了細(xì)長 略帶彎曲的桿菌略帶彎曲的桿菌結(jié)核桿菌結(jié)核桿菌，開創(chuàng)了結(jié)核病研，開創(chuàng)了結(jié)核病研 究的新記元，獲得究的新記元，獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎。 發(fā)現(xiàn)歷史發(fā)現(xiàn)歷史 態(tài)生兩靨之愁，態(tài)生兩靨之愁， 嬌襲一身之病。嬌襲一身之病。 淚光點點，淚光點點， 嬌喘微微。嬌喘微微。 閑靜時如姣花照水，閑靜時如姣花照水， 行動時如弱柳扶風(fēng)。行動時如弱柳扶風(fēng)。 原發(fā)感染的主要病變是結(jié)核結(jié)節(jié)。原發(fā)感染的主要病變是結(jié)核結(jié)節(jié)。 機體對大多數(shù)原發(fā)感染能逐步形成細(xì)胞免疫，機體對大多數(shù)原發(fā)感染能逐步形成細(xì)胞免疫， 控制結(jié)核桿菌的感染，發(fā)展結(jié)局大多為良性。控制結(jié)核桿菌的感染，發(fā)展結(jié)局大多為良性。 結(jié)核壞死，

8、轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N顆粒性的結(jié)核壞死，轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N顆粒性的“干酪狀團塊干酪狀團塊” ，并逐漸，并逐漸纖維化；鈣化；液化，產(chǎn)生空洞纖維化；鈣化；液化，產(chǎn)生空洞 ；吸收消散，不治而愈。；吸收消散，不治而愈。 二、臨床意義二、臨床意義 2 2、導(dǎo)致疾病、導(dǎo)致疾病 當(dāng)機體抵抗力減弱時，潛伏的結(jié)核桿菌可能復(fù)當(dāng)機體抵抗力減弱時，潛伏的結(jié)核桿菌可能復(fù) 活，引起繼發(fā)性結(jié)核病活，引起繼發(fā)性結(jié)核?。▋?nèi)源性感染）（內(nèi)源性感染）；或從；或從 外界吸入結(jié)核桿菌外界吸入結(jié)核桿菌（外源性感染），（外源性感染），多發(fā)生于多發(fā)生于 成年人。成年人。 2 2）繼發(fā)感染）繼發(fā)感染 二、臨床意義二、臨床意義 2 2、導(dǎo)致疾病、導(dǎo)致疾病 肺結(jié)核的

9、臨床表現(xiàn)有：肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)有： 黛玉黛玉一一翻身翻身，卻卻原原來是來是一一場惡夢場惡夢。喉間猶喉間猶 是哽咽是哽咽，心頭還是亂跳心頭還是亂跳，枕頭枕頭上已經(jīng)上已經(jīng)濕透濕透， 肩背身心肩背身心，但覺冰冷但覺冰冷。 二、臨床意義二、臨床意義 3 3、導(dǎo)致疾病、導(dǎo)致疾病 “林姑娘臉林姑娘臉上一上一點血色也沒點血色也沒有，有，摸摸 了了摸身摸身上，上，只剩得只剩得一一把骨頭把骨頭”。 黛玉掙扎著伸出那只手來狠命的撕那絹黛玉掙扎著伸出那只手來狠命的撕那絹 子，卻是只有打顫的分兒，那里撕得動。子，卻是只有打顫的分兒，那里撕得動。 二、臨床意義二、臨床意義 2 2、導(dǎo)致疾病、導(dǎo)致疾病 莢膜莢膜 脂質(zhì)：脂質(zhì)

10、：索狀因子索狀因子 磷脂磷脂 硫酸腦苷酯硫酸腦苷酯 蠟質(zhì)蠟質(zhì) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶，主要由尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶，主要由菌菌 體成分體成分導(dǎo)致的導(dǎo)致的炎癥和免疫損傷炎癥和免疫損傷引起病變。引起病變。 主要致病物質(zhì)主要致病物質(zhì) 二、臨床意義二、臨床意義 1 1、致病物質(zhì)、致病物質(zhì) ：抑制吞噬體和溶酶體融合，使其在巨抑制吞噬體和溶酶體融合，使其在巨 噬細(xì)胞內(nèi)存活。噬細(xì)胞內(nèi)存活。 二、臨床意義二、臨床意義 1 1、致病物質(zhì)、致病物質(zhì) 索狀因子：索狀因子：與結(jié)核桿菌的毒力有關(guān)，能抑制白與結(jié)核桿菌的毒力有關(guān)，能抑制白 細(xì)胞游走和引起慢性肉芽腫。細(xì)胞游走和引起慢性肉芽腫。

11、磷脂：磷脂：可引起機體的單核細(xì)胞增生，形成結(jié)核可引起機體的單核細(xì)胞增生，形成結(jié)核 結(jié)節(jié)和干酪樣壞死。結(jié)節(jié)和干酪樣壞死。 硫酸腦苷脂硫酸腦苷脂：抗吞噬作用，使病菌在吞噬細(xì)胞：抗吞噬作用，使病菌在吞噬細(xì)胞 中長期存在；使壞死組織不能完全溶解，而呈中長期存在；使壞死組織不能完全溶解，而呈 結(jié)核病灶中特有的干酪樣壞死狀態(tài)結(jié)核病灶中特有的干酪樣壞死狀態(tài) 蠟質(zhì)蠟質(zhì)D D：可激發(fā)機體發(fā)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)?？杉ぐl(fā)機體發(fā)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)。 二、臨床意義二、臨床意義 1 1、致病物質(zhì)、致病物質(zhì) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（如結(jié)核菌素）（如結(jié)核菌素）：能與蠟質(zhì)結(jié)合注入能與蠟質(zhì)結(jié)合注入 體內(nèi)可誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。體內(nèi)可誘發(fā)遲發(fā)型超敏

12、反應(yīng)。 二、臨床意義二、臨床意義 1 1、致病物質(zhì)、致病物質(zhì) （三）免疫性（三）免疫性 TB菌的菌的感染率很高，發(fā)病率卻較低。感染率很高，發(fā)病率卻較低。抗結(jié)核的抗結(jié)核的 免疫稱為免疫稱為有菌免疫或傳染性免疫。有菌免疫或傳染性免疫。 細(xì)胞免疫細(xì)胞免疫發(fā)揮重要作用。發(fā)揮重要作用。 可產(chǎn)生遲發(fā)性超敏反應(yīng)可產(chǎn)生遲發(fā)性超敏反應(yīng) “結(jié)核菌素試驗結(jié)核菌素試驗” 三、細(xì)菌特性三、細(xì)菌特性 細(xì)長略彎曲，有時可見分枝；細(xì)長略彎曲，有時可見分枝；呈單、成堆或成束排呈單、成堆或成束排 列；無鞭毛、無芽胞，有莢膜?？沙霈F(xiàn)多形性，在列；無鞭毛、無芽胞，有莢膜。可出現(xiàn)多形性，在 陳舊的病灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型。陳舊的病

13、灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型。 萋尼氏抗酸性染色法萋尼氏抗酸性染色法 染色，菌體染成染色，菌體染成紅色紅色 熒光染料金胺熒光染料金胺O染色，在染色，在 熒光下菌體呈熒光下菌體呈橘黃色橘黃色 1 1、形態(tài)結(jié)構(gòu)、形態(tài)結(jié)構(gòu) 饞饞: :專性需氧專性需氧, ,營養(yǎng)要求高營養(yǎng)要求高（羅氏培養(yǎng)基）羅氏培養(yǎng)基） 懶懶: :生長溫度生長溫度35,35,生長緩慢生長緩慢 丑丑: :液體培養(yǎng)基呈粗糙皺紋狀菌膜生液體培養(yǎng)基呈粗糙皺紋狀菌膜生長長, ,固體培固體培 養(yǎng)基上形成養(yǎng)基上形成形似菜花樣形似菜花樣典型菌落。典型菌落。 三、細(xì)菌特性三、細(xì)菌特性 2 2、培養(yǎng)特性、培養(yǎng)特性 結(jié)核分枝桿菌在羅氏（結(jié)核分枝桿菌在羅氏（L

14、-J）培養(yǎng)基上菌落）培養(yǎng)基上菌落 1.1.多多 糖糖莢膜主要成分。莢膜主要成分。 2.2.脂脂 質(zhì)質(zhì)脂質(zhì)占菌體干重的脂質(zhì)占菌體干重的202040%40%， 占胞壁干重的占胞壁干重的60%60%。包括。包括磷磷 脂索狀因子蠟質(zhì)脂索狀因子蠟質(zhì)D D硫酸腦苷脂硫酸腦苷脂 3.3.蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)TBTB菌菌體內(nèi)都含有數(shù)種蛋白菌菌體內(nèi)都含有數(shù)種蛋白 質(zhì)，其中重要的蛋白質(zhì)是質(zhì)，其中重要的蛋白質(zhì)是結(jié)核結(jié)核 菌素。菌素。 結(jié)核分支桿菌具有免疫佐劑作用。結(jié)核分支桿菌具有免疫佐劑作用。 三、細(xì)菌特性三、細(xì)菌特性 3 3、菌體成分、菌體成分 典型形態(tài)典型形態(tài)多形性多形性 R R型菌落型菌落S S型菌落型菌落 有毒有毒

15、無毒（用于制備疫苗）無毒（用于制備疫苗） 抗結(jié)核藥敏感抗結(jié)核藥敏感耐藥耐藥 卡介苗：是有毒力的牛型結(jié)核分枝桿菌在甘油、膽汁和馬是有毒力的牛型結(jié)核分枝桿菌在甘油、膽汁和馬 鈴薯的培養(yǎng)基中經(jīng)鈴薯的培養(yǎng)基中經(jīng)13年年230次傳代而獲得的減毒變異株次傳代而獲得的減毒變異株 三、細(xì)菌特性三、細(xì)菌特性 4 4、細(xì)菌變異性、細(xì)菌變異性 o生化反應(yīng)不活潑。生化反應(yīng)不活潑。不發(fā)酵糖類，耐熱觸酶實驗陰性不發(fā)酵糖類，耐熱觸酶實驗陰性， 多數(shù)菌株觸酶陽性。多數(shù)菌株觸酶陽性。 o人型人型TBTB煙酸和硝酸鹽試驗陽性，耐噻吩煙酸和硝酸鹽試驗陽性，耐噻吩-2-2-羧酸酰肼，羧酸酰肼， 牛型牛型TBTB則不能。有毒株中性紅試

16、驗陽性。則不能。有毒株中性紅試驗陽性。 煙酸試驗煙酸試驗硝酸鹽試驗硝酸鹽試驗中性紅試驗中性紅試驗 +-+- 三、細(xì)菌特性三、細(xì)菌特性 5 5、生化反應(yīng)、生化反應(yīng) 耐干燥（塵埃，干燥痰）耐干燥（塵埃，干燥痰） 耐酸堿（耐酸堿（3%3%鹽酸鹽酸6%6%硫酸硫酸4%4%堿）堿） 耐一定濃度的孔雀綠、結(jié)晶紫耐一定濃度的孔雀綠、結(jié)晶紫 不耐濕熱（不耐濕熱（62-6262-62度，度，1515分鐘）分鐘） 不耐紫外線不耐紫外線 不耐酒精不耐酒精 三耐三耐 三不耐三不耐 三、細(xì)菌特性三、細(xì)菌特性 6 6、抵抗力、抵抗力 臨床標(biāo)本 涂片檢查 分離培養(yǎng)HPLC基因診斷免疫學(xué)檢測 直接涂片集菌涂片處理標(biāo)本或無污染

17、標(biāo)本 染色液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基動物試驗 羅氏(L-J） 抗酸.金胺O. 37， 涂片鏡檢 儀器培養(yǎng) 7 7天生長天生長7 7天生長天生長 快速生長菌慢生長菌快速生長菌慢生長菌 菌種鑒定 抗酸染色菌落特點 鑒定試驗藥敏試驗 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 噬菌體噬菌體 鑒定法鑒定法 o標(biāo)本采集標(biāo)本采集 宜用能抑制污染菌的方法宜用能抑制污染菌的方法 常見標(biāo)本：痰、尿、胸腹水常見標(biāo)本：痰、尿、胸腹水 o檢查方法檢查方法 1 1. .顯微鏡檢查顯微鏡檢查 1 1）直接涂片：）直接涂片： 2 2）濃縮集菌涂片：）濃縮集菌涂片： 3 3）報告方式）報告方式 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 常見標(biāo)本為痰

18、、尿、胸腹水、腦脊液等常見標(biāo)本為痰、尿、胸腹水、腦脊液等 o疑肺結(jié)核：收集清晨第一口痰，清潔干燥的容器內(nèi)送檢疑肺結(jié)核：收集清晨第一口痰，清潔干燥的容器內(nèi)送檢 o疑泌尿系結(jié)核：清晨一次全部尿量或疑泌尿系結(jié)核：清晨一次全部尿量或24小時尿沉淀小時尿沉淀10 15ml送檢，必要時作無菌導(dǎo)尿送檢（診斷泌尿道結(jié)核通送檢，必要時作無菌導(dǎo)尿送檢（診斷泌尿道結(jié)核通 常需常需35份標(biāo)本）份標(biāo)本） o采集膿液應(yīng)直接從潰瘍處取膿汁或分泌物采集膿液應(yīng)直接從潰瘍處取膿汁或分泌物,深部膿腫用無深部膿腫用無 菌注射器抽取送檢菌注射器抽取送檢 o其他：無菌抽取腦脊液、胸水、腹水及關(guān)節(jié)液等盛無菌其他：無菌抽取腦脊液、胸水、腹水

19、及關(guān)節(jié)液等盛無菌 試管送檢。腦脊液標(biāo)本靜置后，表面可有細(xì)薄凝塊，取試管送檢。腦脊液標(biāo)本靜置后，表面可有細(xì)薄凝塊，取 凝塊作涂片或接種培養(yǎng)凝塊作涂片或接種培養(yǎng) 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 標(biāo)本采集標(biāo)本采集 o加等量的加等量的3%HCL 、6%H2SO4或或4%NaOH) o強力強力振蕩混勻約振蕩混勻約 50 50 秒秒 o室室溫靜溫靜置置 3030 分分鐘鐘 o加加等量無等量無菌菌磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液中和中和 o離離心心 3,000 g 3,000 g 約約 1515 分分鐘鐘 o倒掉上清液倒掉上清液，加無，加無菌菌磷酸鹽緩沖液重懸磷酸鹽緩沖液重懸 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 痰

20、液痰液- -標(biāo)本處理標(biāo)本處理 1.1.染色性染色性 2.2.菌落特征菌落特征 3.3.生長速度生長速度 4.4.色素產(chǎn)生色素產(chǎn)生 5.5.生化試驗：生化試驗：煙酸，硝酸鹽，尿素，煙酸，硝酸鹽，尿素， 吡嗪酰胺酶，吐溫水解，吡嗪酰胺酶，吐溫水解， 熱觸酶，芳香硫酸脂酶，熱觸酶，芳香硫酸脂酶， 5 5NaCLNaCL等。等。 鑒定鑒定 鑒定鑒定 熒光染色（450） 0 300300視野視野 12條條70視野視野 21850視野視野 2 43610視野視野 3 436每視野每視野 4 36每視野每視野 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 抗酸染色（1000） 0 0300300視野視野 1 12 2條

21、條300300視野視野 1 19 9條條/100/100視野視野 2 2 1 19 9條條/10/10視野視野 3 3 1 19 9條條/ /視野視野 4 4 9/ 9/視野視野 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 1. TB1. TB菌接種前處理：菌接種前處理：液化和處雜液化和處雜 2. 2. 培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇 3. 3. 儀器培養(yǎng)儀器培養(yǎng) （L-JL-J培養(yǎng)基）培養(yǎng)基） 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 快速診斷快速診斷PCR-RFLPPCR-RFLP、PCR-SSCPPCR-SSCP、 PCR-PCR-核核 酸探針、酸探針、PCR-PCR-核酸測序、多重核酸測序、多重

22、 PCRPCR、雙重復(fù)插入序列、雙重復(fù)插入序列PCRPCR等等。 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 核酸檢測核酸檢測 檢測分枝菌酸：檢測分枝菌酸：由于不同種的分枝桿菌細(xì)胞壁中由于不同種的分枝桿菌細(xì)胞壁中 的分枝菌酸不同，所以利用的分枝菌酸不同，所以利用HPLCHPLC檢測分枝菌酸可檢測分枝菌酸可 鑒定菌種。鑒定菌種。 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 色譜分析技術(shù)色譜分析技術(shù) 1.1.結(jié)核菌素試驗：遲發(fā)型超敏反應(yīng)。結(jié)核菌素試驗：遲發(fā)型超敏反應(yīng)。 2.2.全血干擾素測定全血干擾素測定 3. 3. 抗體檢測抗體檢測 1 1）檢測）檢測PPDIgGPPDIgG輔助診斷。輔助診斷。 2 2）血清抗阿拉

23、伯糖甘露糖脂）血清抗阿拉伯糖甘露糖脂IgGIgG抗體抗體 活動性結(jié)核標(biāo)志物（活動性結(jié)核標(biāo)志物（ATMATM）檢測）檢測 4.4.結(jié)核分枝桿菌抗原檢測結(jié)核分枝桿菌抗原檢測 分泌特異性抗原分泌特異性抗原特異蛋白抗原特異蛋白抗原 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 免疫學(xué)檢驗免疫學(xué)檢驗 結(jié)核菌素試驗結(jié)核菌素試驗 TBTB純蛋白衍生物純蛋白衍生物(PPD)(PPD)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核菌，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核菌 培養(yǎng)濾液后的純化物。培養(yǎng)濾液后的純化物。注入皮內(nèi)注入皮內(nèi)后如受試者已感染后如受試者已感染 結(jié)核，則結(jié)核菌素與致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，形結(jié)核，則結(jié)核菌素與致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，形 成遲發(fā)型超敏

24、反應(yīng)性炎癥成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥。 根據(jù)注射部位是否出現(xiàn)紅腫判斷結(jié)果根據(jù)注射部位是否出現(xiàn)紅腫判斷結(jié)果 5mm為陰性為陰性 5-15mm為陽性為陽性 15mm為強陽性為強陽性 48-72小時 利用外周抗凝全血標(biāo)本，通過檢測結(jié)核感染后利用外周抗凝全血標(biāo)本，通過檢測結(jié)核感染后T淋巴細(xì)胞分淋巴細(xì)胞分 泌的特異性細(xì)胞因子泌的特異性細(xì)胞因子干擾素，來診斷是否存在結(jié)核感染。干擾素，來診斷是否存在結(jié)核感染。 四、微生物學(xué)檢驗四、微生物學(xué)檢驗 5.T-SPOT.TB檢測檢測 分枝桿菌噬菌體分枝桿菌噬菌體D29D29能感染活的分枝桿菌能感染活的分枝桿菌, ,未進(jìn)入感未進(jìn)入感 染菌體內(nèi)的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活

25、染菌體內(nèi)的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活 , ,已進(jìn)已進(jìn) 入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響。噬菌體在感染菌體內(nèi)入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響。噬菌體在感染菌體內(nèi) 大量增殖大量增殖 , ,并將菌體裂解并將菌體裂解 , ,釋放出的子代噬菌體可釋放出的子代噬菌體可 感染隨后加入的指示細(xì)胞感染隨后加入的指示細(xì)胞 , ,并將其裂解并將其裂解 , ,在瓊脂平在瓊脂平 板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑。板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑。 噬菌體鑒定法噬菌體鑒定法 o異煙肼，鏈霉素，利福平，乙胺丁酸，對氨異煙肼，鏈霉素，利福平，乙胺丁酸，對氨 基水楊酸，環(huán)絲氨酸等藥物敏感?；畻钏幔h(huán)絲氨酸等藥物敏感。 耐藥情況嚴(yán)重，耐藥情況嚴(yán)重，主張聯(lián)合用藥主張

26、聯(lián)合用藥。藥物作用的藥物作用的 靶基因變異。靶基因變異。 MDRTB 對對2種或種或2種以上的抗結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核菌感染種以上的抗結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥性的結(jié)核菌感染 藥物敏感試驗藥物敏感試驗 將純培養(yǎng)物菌懸液，接種含各種濃度藥物的將純培養(yǎng)物菌懸液，接種含各種濃度藥物的 固體培養(yǎng)基上，同時做不含藥物的對照組。固體培養(yǎng)基上，同時做不含藥物的對照組。 經(jīng)過培養(yǎng)，含有藥物的培養(yǎng)基上菌落數(shù)目是經(jīng)過培養(yǎng)，含有藥物的培養(yǎng)基上菌落數(shù)目是 對照組的對照組的7575以上，則認(rèn)為該菌對該藥物濃度以上，則認(rèn)為該菌對該藥物濃度 為完全為完全耐藥，耐藥，如無菌落生長則為如無菌落生長則為敏感敏感。 藥物敏感試驗藥物敏感試驗

27、1 1）給給新生新生兒接兒接種種卡介苗卡介苗是預(yù)防是預(yù)防結(jié)核病的結(jié)核病的最最有有 效效的的措施措施。 防治原則防治原則 2 2）發(fā)現(xiàn)和治療痰菌陽性者）發(fā)現(xiàn)和治療痰菌陽性者 防治原則防治原則 國際放癆和肺病聯(lián)合會推薦國際放癆和肺病聯(lián)合會推薦“直接督直接督 導(dǎo)下的短程化療導(dǎo)下的短程化療”，即異煙肼、利福，即異煙肼、利福 平、吡嗪酰胺強化平、吡嗪酰胺強化2 2個月，維持個月，維持4-64-6個個 月，共月，共6-86-8個月。個月。 2. 治療原則治療原則 防治原則防治原則 早發(fā)現(xiàn)；早發(fā)現(xiàn)； 聯(lián)合用藥，藥物要適量，有規(guī)律地全程聯(lián)合用藥，藥物要適量，有規(guī)律地全程 用藥，切勿停藥；用藥，切勿停藥； 認(rèn)真

28、注意休息，增加營養(yǎng)；認(rèn)真注意休息，增加營養(yǎng)； 定期復(fù)查。定期復(fù)查。 o指結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿指結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿 菌。不是分類學(xué)上的名稱。因具有抗酸性，故菌。不是分類學(xué)上的名稱。因具有抗酸性，故 又稱又稱非典型抗酸性菌。非典型抗酸性菌。 o廣泛分布于外環(huán)境和人及動物的機體中。廣泛分布于外環(huán)境和人及動物的機體中。NTM 種類眾多，種類眾多，已發(fā)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)1717種以上能引起人類疾病，種以上能引起人類疾病， 引起的肺部感染，對多種藥耐藥。引起的肺部感染，對多種藥耐藥。 o結(jié)核病和結(jié)核病和NTM感染的治療不同感染的治療不同 。 nontuberculous Myc

29、obacteria ，NTM 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 非結(jié)核分枝桿菌（非結(jié)核分枝桿菌（RunyonRunyon分群）分群） o群群光產(chǎn)色菌光產(chǎn)色菌,如猿猴分枝桿菌、堪薩斯如猿猴分枝桿菌、堪薩斯 分枝桿菌、海分枝桿菌等（分枝桿菌、海分枝桿菌等（光產(chǎn)色）光產(chǎn)色） o 群群暗產(chǎn)色菌暗產(chǎn)色菌,如蘇加分枝桿菌、蟾蜍如蘇加分枝桿菌、蟾蜍 分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌等（分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌等（暗產(chǎn)色）暗產(chǎn)色） o 群群不產(chǎn)色菌不產(chǎn)色菌,如鳥分枝桿菌復(fù)合群如鳥分枝桿菌復(fù)合群 (M1avium complex ,MAC) 、瑪爾摩分枝桿、瑪爾摩分枝桿 菌、土地分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、嗜血分枝菌、土地分枝桿菌

30、、潰瘍分枝桿菌、嗜血分枝 桿菌等桿菌等 （不產(chǎn)色）（不產(chǎn)色） o 群群快生長菌快生長菌,如偶發(fā)分枝桿菌、龜分如偶發(fā)分枝桿菌、龜分 枝桿菌、膿腫分枝桿菌。枝桿菌、膿腫分枝桿菌。 （快速生長）（快速生長） 膿腫分枝桿菌引 起的注射后感染 膿腫分枝桿菌引膿腫分枝桿菌引 起的注射后感染起的注射后感染 NTM感染后難感染后難 于愈合的傷口于愈合的傷口 （一）標(biāo)本采集（一）標(biāo)本采集 與結(jié)核分枝桿菌類似與結(jié)核分枝桿菌類似 （二）涂片抗酸染色（二）涂片抗酸染色 本菌為本菌為抗酸桿菌抗酸桿菌，但，但較結(jié)核分枝桿菌短而粗較結(jié)核分枝桿菌短而粗，大，大 小約小約18m0.30.5m，抗酸染色著色均勻，抗酸染色著色均勻

31、， 呈束狀或團狀排列呈束狀或團狀排列 微生物學(xué)檢驗 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 （三）分離培養(yǎng)與鑒定（三）分離培養(yǎng)與鑒定 光產(chǎn)色分枝桿菌（光產(chǎn)色分枝桿菌（Runyon 群）群） o菌落特點是菌落特點是在暗處一般不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量色在暗處一般不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量色 素素，光照，光照1h后能在后能在48h內(nèi)轉(zhuǎn)為黃色或橘黃色內(nèi)轉(zhuǎn)為黃色或橘黃色 o需在營養(yǎng)復(fù)雜的培養(yǎng)基上才能生長，需在營養(yǎng)復(fù)雜的培養(yǎng)基上才能生長，生長緩慢生長緩慢， 菌落光滑菌落光滑 o有時可形成索狀生長有時可形成索狀生長 微生物學(xué)檢驗微生物學(xué)檢驗 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 （2）暗產(chǎn)色分枝桿菌（）暗產(chǎn)色分枝桿菌（Runyon 群）群

32、） o無論有光或無光均能產(chǎn)生色素，無論有光或無光均能產(chǎn)生色素，呈黃色或橘黃色呈黃色或橘黃色 o生長緩慢，生長緩慢，菌落為光滑型菌落為光滑型 微生物學(xué)檢驗微生物學(xué)檢驗 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 不產(chǎn)色分枝桿菌（不產(chǎn)色分枝桿菌（Runyon 群）群） o缺乏缺乏-胡蘿卜素，故在胡蘿卜素，故在光照和暗處均不能產(chǎn)生光照和暗處均不能產(chǎn)生 色素，生長緩慢。色素，生長緩慢。 微生物學(xué)檢驗微生物學(xué)檢驗 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 快速生長分枝桿菌（快速生長分枝桿菌（Runyon 群）群） o在普通培養(yǎng)基上即可生長在普通培養(yǎng)基上即可生長 o最適生長溫度為最適生長溫度為2545 o生長速度快，生長速度快，3

33、 36d6d即可形成菌落即可形成菌落 微生物學(xué)檢驗微生物學(xué)檢驗 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 （四）其他鑒定方法（四）其他鑒定方法 o非培養(yǎng)方法的鑒定與結(jié)核分枝桿菌類似。非培養(yǎng)方法的鑒定與結(jié)核分枝桿菌類似。 oNTMNTM的實驗室診斷的實驗室診斷可跟據(jù)細(xì)菌生長速度、色素可跟據(jù)細(xì)菌生長速度、色素 等表型特征進(jìn)行初步鑒定，再進(jìn)行分子診斷，等表型特征進(jìn)行初步鑒定，再進(jìn)行分子診斷， 后者應(yīng)用越來越廣泛。后者應(yīng)用越來越廣泛。 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌 微生物學(xué)檢驗微生物學(xué)檢驗 o麻風(fēng)病的病原菌，麻風(fēng)是一種慢性傳染病，主要麻風(fēng)病的病原菌，麻風(fēng)是一種慢性傳染病，主要 表現(xiàn)為表現(xiàn)為皮膚、粘膜和神經(jīng)末梢的損

34、害皮膚、粘膜和神經(jīng)末梢的損害。晚期可侵晚期可侵 犯深部組織和器官，形成肉芽腫。犯深部組織和器官，形成肉芽腫。 o根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細(xì)菌檢查結(jié)果等根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細(xì)菌檢查結(jié)果等 將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié)核樣型和界限類綜合征等三將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié)核樣型和界限類綜合征等三 種病型。種病型。 Mycobacterium Leprae,MLP 麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌 oWHO自自1995年始對麻風(fēng)患者實施免費治療年始對麻風(fēng)患者實施免費治療 o麻風(fēng)病發(fā)病率直線下降麻風(fēng)病發(fā)病率直線下降 o2008年全球新發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)患者年全球新發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)患者249000例例 o中國現(xiàn)癥麻風(fēng)病患者由解放初期的中國

35、現(xiàn)癥麻風(fēng)病患者由解放初期的50多萬人減少多萬人減少 至目前的至目前的6000余人余人 o20012008年年,我國每年新發(fā)現(xiàn)患者我國每年新發(fā)現(xiàn)患者14001700 例例 麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌 o抗酸桿菌抗酸桿菌，呈呈束狀或團狀排列束狀或團狀排列，革蘭陽性無革蘭陽性無 鞭毛、莢膜和芽胞。用藥后細(xì)菌可斷裂為顆鞭毛、莢膜和芽胞。用藥后細(xì)菌可斷裂為顆 粒狀、鏈桿狀等，著色不均勻，叫做不完全粒狀、鏈桿狀等，著色不均勻，叫做不完全 菌。菌。 o細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)胞內(nèi)寄生，可形成麻風(fēng)細(xì)胞。可形成麻風(fēng)細(xì)胞。 麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌 o微生物檢驗微生物檢驗標(biāo)本涂片抗酸染色是診斷麻風(fēng)標(biāo)本涂片抗酸染色是診斷麻風(fēng) 的主要依據(jù)的主要依據(jù) o該菌目前尚該菌目前尚不能人工培養(yǎng)不能人工培養(yǎng) o近年采用近年采用PCR技術(shù)檢測麻風(fēng)菌基因、運用新發(fā)技術(shù)檢測麻風(fēng)菌基因、運用新發(fā) 現(xiàn)抗原血清學(xué)與現(xiàn)抗原血清學(xué)與T細(xì)胞試驗