一株菲降解細菌的篩選及其

1、雷歡等：一株菲降解細菌的篩選及其降解條件的優(yōu)化一株菲降解細菌的篩選及其降解條件的優(yōu)化* 國家自然科學(xué)基金（NO.40476047,40576054）雷歡1 黃栩1田蘊1，* 通訊作者 E-mail: tianyun 鄭天凌1，2(1, 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361005)（; 2 廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點實驗室, 福建廈門361005)摘要：采用改進的平板升華法從廈門博坦油碼頭附近海水樣品中篩選出一株菲的高效降解菌，經(jīng)16Sr DNA分子鑒定該菌歸于鞘氨醇單胞菌屬。高效液相色譜分析表明, 5天之內(nèi)該菌降解了81.9終濃度為400mgL-1的菲，降解速率達到5.95mgL-1h-

2、1。通過均勻設(shè)計對該菌降解菲的試驗條件進行優(yōu)化，DPS軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析表明在接菌量OD6000.5，菲起始濃度為498.46726mgL-1，降解時間為47.09892h時，降解速率最大。關(guān)鍵詞：平板升華法；菲 ；鞘氨醇單胞菌；均勻設(shè)計；降解速率1. 引言多環(huán)芳烴(PAHs) 是指2 兩個或2兩 個以上苯環(huán)的疏水性芳香族化合物。在環(huán)境中多數(shù)PAHs 具有難降解性、致癌性、致畸性和致突變性,受到了廣大關(guān)注。多環(huán)芳烴(PAHs) 隨三廢排入環(huán)境中的量逐年增加,造成長期、廣泛的污染。菲為三環(huán)多環(huán)芳烴代表物,生物降解是污染環(huán)境中菲去除的主要途徑（3，5，8，11，12，15韓清鵬等，2003；徐虹

3、等，2004；周樂等，2005；Boldorn,et al.,1993;Cho et al.,2001;Goyal et al.,1996）。研究表明鞘氨醇單胞菌屬能很好消除PAHs污染(Cho et al.,2001;12，13，F(xiàn)redrickson et al.,1995;16Kim et al.,2000)，但目前國內(nèi)報道較少4，6，7(陶雪琴等，2007；張杰等，2003)。菲的降解已有不少報道, 但目前已知的菌株對菲的降解速度不甚理想，作者本研究采用改進的平板升華法從廈門博坦油碼頭附近海水樣品中篩選出一株高效菲降解菌，并對其降解條件進行優(yōu)化，為進一步探索菲的生物代謝途徑乃至在不久將

4、來用于污染環(huán)境的生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。一、2. 材料與方法1.2.1 材料2.1.1 ）樣品2005年9月，采集廈門博坦油碼頭附近海水樣品。2）2.1.2 主要試劑菲、芘等PAHs購自Sigma公司，純度99；甲醇、二氯甲烷購于TEDIA（美國）公司，均為HPLC級；碘硝基氯化四氮唑藍(INT) 購自Sigma公司；胰蛋白胨、酵母浸出膏為Difico 公司產(chǎn)品。3）2.1.3 主要培養(yǎng)基無機鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO4，1000 mg；Na2HPO4，800 mg；KH2PO4，200 mg；MgSO47H2O，200 mg；FeCl33H2O，5mg；(NH4)6Mo7O244H2O，1 mg；

5、CaCl22H2O，100 mg；蒸餾水 1000ml；pH 7.2，121滅菌，20min。菲-MSM液體培養(yǎng)基：使用時移取一定量的用二氯甲烷溶解的菲母液（10mg/mL）到已滅菌的無機培養(yǎng)基中，待二氯甲烷揮發(fā)完全后接菌。LB培養(yǎng)基NaCl，10g；酵母浸膏，5g；胰蛋白胨，10g；去離子水，1000ml；pH值7.07.2。固體培養(yǎng)基，瓊脂，1.2-1.5。2.2 2.降解菌的富集培養(yǎng)和馴化（1）2.2.1 移取菲母液（10mg/ml）到已滅菌45 ml的MSM培養(yǎng)液中，至菲終濃度為400 mg/L-1。待二氯甲烷揮發(fā)后，加入剛采集回來的海水樣品5 ml。搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180rpm，溫度3

6、0。之后每隔5天，轉(zhuǎn)接5 ml培養(yǎng)液于45 ml新鮮的培養(yǎng)液，保持菲的濃度不變，共轉(zhuǎn)接10次。 2.2.2 改進的平板升華法10,9篩選降解菌往500 ml的燒杯里添加5 ml 10mg/ml的菲-二氯甲烷溶液，在通風(fēng)櫥里讓二氯甲烷自然揮發(fā)。取上述密集馴化后的混合菌系1ml，稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群笃桨逋坎?。將平板反扣在國家自然科學(xué)基金（No.40476047,40576054）。通訊作者：E-mail:tianyun。收稿日期：年月日。之后每隔5d，轉(zhuǎn)接5 ml培養(yǎng)液于45 ml新鮮的培養(yǎng)液，保持菲的濃度不變，共轉(zhuǎn)接10次。(2)改進的平板升華法(仉磊等，2005；Alley et al.,200

7、0)篩選降解菌。往500ml的燒杯里添加5ml/10mg/ml的菲-二氯甲烷溶液，在通風(fēng)櫥里讓二氯甲烷自然揮發(fā)。取上述密集馴化后的混合菌系1ml，稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群笃桨逋坎肌⑵桨宸纯墼跓谏?，用封口膜密封二者接觸的地方。，再取一等半徑的平皿再取相同半徑的平皿，放冰于其上。94水浴5分鐘min，取出，冷卻，揭膜。將平板置于30的培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，觀察菌落的周圍是否形成透明圈。2.3. 降解能力測定 挑取經(jīng)過純化的降解菌的單菌落，接種至 150mL150ml的LB液體培養(yǎng)基，當(dāng)OD600 0.60時，菌液經(jīng)6000rpm , 離心10min離心收集菌體。MSM培養(yǎng)液重懸洗滌，離心，反復(fù)三次，吸取

8、等量的菌液，添加至預(yù)先配制好的裝有25ml MSM-菲培養(yǎng)液的三角瓶，其中菲的最終濃度為400ppm，設(shè)三個平行，三個空白。培養(yǎng)條件：30，200rpm搖床中避光培養(yǎng)。接種完后立即取樣一次，包括上述三平行，三空白各一份，然后每隔24h取樣一次。2.4.4降解過程中細菌電子傳遞系統(tǒng)活性（ETSA）測定電子傳遞系統(tǒng)的活性是檢測潛在的代謝活性的重要的生化指標(biāo)。ETSA值及時體現(xiàn)了微生物的代謝活性，可做為降解能力測定的有力補充。該檢測方法基于四銼還原作用來體現(xiàn)耗氧值，底物是碘硝基氯化四氮唑藍(INT)。具體操作步驟如下：吸取0.5 ml的菌液，加入1 ml的INT，避光反應(yīng)30min；加入0.1 ml

9、的甲醛終止反應(yīng)，10000rpm，離心5 min；去上清，加入1 ml的96甲醇，充分振蕩，重懸沉淀；10000rpm，離心2 min，去除菌體對吸光度的干擾；測定OD495，以7 ml 96甲醇加2 ml INT 作為空白。2.5.降解菌的分子鑒定提取降解菌的總DNA，以通用引物（27F和1492R）進行16SrDNA PCR。反應(yīng)體系：25l；引物27F和1492R (10mol/L)，0.25 l；Taq DNA 聚合酶(2.5 /l)，0.25 l；10 mM dNTP，0.5 l；10PCR 緩沖液（含15 mM Mg2+），2.5 l；DDW 補至25l。PCR擴增條件：95C，4

10、 min預(yù)變性，95C，1 min變性，55C，45s退火，72C，延伸1 min，此步驟進行29個循環(huán)，最后72C延伸。產(chǎn)物進行電泳測定、測序。將16S rDNA 的測序結(jié)果輸入GenBank 中進行序列比對測序由上海Invitrogen公司完成。序列用DNAMAN分析，在線比對（/BLAST/），進而進行系統(tǒng)發(fā)育分析。2. 6.利用均勻設(shè)計1,2，14(方開泰，1994；2001；Fang et al.,2000)優(yōu)化降解菌菌降解菲的試驗條件 利用軟件均勻設(shè)計版本3.00，設(shè)計混合水平試驗方案。擬選三因素，即接菌量（OD600）、底物濃度

11、（mg/L-1）和培養(yǎng)時間（h)，水平數(shù)為，結(jié)合均勻設(shè)計表格，選用均勻設(shè)計表U6(623)，見結(jié)果與分析中表。其中包括上述三平行，三空白各一份，30，200rpm搖床中避光培養(yǎng)。2. 7 .降解過程中菲濃度變化的測定培養(yǎng)液中加入20mg/ml的芘做為內(nèi)標(biāo)，前三天的樣品加100l，后兩天的樣品加入50l，培養(yǎng)液中的菲用二氯甲烷重復(fù)萃取兩次,合并萃取液、進行濃縮，定容至5 ml。用注射器吸取有機相,經(jīng)0.45m孔徑的一次性濾器過濾后移入色譜瓶中，-20保存待測。分析儀器為安捷倫高效液相色譜儀, 配有紫外檢測器, 色譜柱為Agilent Hypersil 4.0250m ODS 柱，粒徑5m。波長為

12、254 nm, 測定時間8min，流動相組成為甲醇水=91, 流速為1mL1ml/ min, 進樣量為5lL。標(biāo)準曲線的繪制：準確配制0.12mg/ ml-1菲溶液和芘溶液（溶劑為二氯甲烷），過濾。上機時，分別按1l ，4l，7l，10l，13l，15l進樣，記錄各樣品出峰時間，以峰面積（Y）對進樣量（X）回歸得到標(biāo)準曲線的回歸方程。根據(jù)出峰及保留時間定性，內(nèi)標(biāo)法（ISTD法）定量。三、3 結(jié)果與討論3.1 .菲的高效降解菌的篩選與分離本研究采用改進的平板升華法篩選到有明顯透明圈的菌落，如（圖31所示）。平板觀察，這些菌在形態(tài)上基本一致（，當(dāng)然不排除同屬不同種的可能性）。將單菌落純化，定名為H

13、。相比于傳統(tǒng)的篩選細菌方法，平板升華法是非常直觀的降解菌篩選方法，其判斷依據(jù)是由于降解菌對PAHs的利用，經(jīng)過夜培養(yǎng)后在降解菌的周圍會形成透明圈，而通過透明圈的大小和產(chǎn)生所需要的時間也可以初步了解降解菌的降解能力。圖31 降解菌H在加菲的MSM培養(yǎng)基上形成的透明圈3.2.降解菌H的形態(tài)觀察降解菌H，在固體培養(yǎng)基上菌落呈規(guī)則圓形、光滑、黃色，細胞染色為革蘭氏陰性。電鏡觀察：無鞭毛，短桿狀，有莢膜結(jié)構(gòu)，細胞長度約2.5 m，半徑約0.4 m。如（圖3-2）所示。 圖32 降解菌H的電鏡照片3.3降解菌H對菲的降解降解菌H具有很強的降解菲的能力，培養(yǎng)液的菲含量在整個過程中呈指數(shù)下降，見（圖3）-3。

14、同時培養(yǎng)液的顏色也從最初的無色，經(jīng)黃色變?yōu)椴枭孜锏念伾兓沧C明了菲被分解代謝。參考空白的菲殘留，整個實驗流程仍然有約25的菲損失，這種損失可能為人為的操作或者客觀的條件所造成。扣除菲損失，降解菌H在5天之內(nèi)對菲的降解達到d之內(nèi)對菲的降解達到81.9，其中絕大部分的降解發(fā)生在前兩天以內(nèi)，第一天就降解了37，降解速率達到5.95mg/Ll-1h-1。本實驗用ETSA值變化，代替?zhèn)鹘y(tǒng)菌體濃度OD600或者菌體全蛋白含量的方式，跟蹤降解過程中降解菌自身的變化。相比之下，測定菌體濃度OD600最為簡便，但是由于菲為水難溶性有機物，會對吸光值造成干擾。而全蛋白含量的測定在操作上比較麻煩。ETSA值的

15、測定主要考察酶對底物（INT）的活性，其產(chǎn)物為可溶性的，可通過離心沉淀的方式排除菌體和菲對吸光度的干擾。由圖312可以看出，在前兩天ETSA的值最高，隨著菲殘留量的減少，亦即底物量的降低，菌體的電子呼吸活性呈降低趨勢，三天后已回到空白水平。圖3 3 5天內(nèi)隨著菲的降解降解菌d內(nèi)隨著菲的降解降解菌ETSA活性的變化3.4.降解菌H的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。16Sr DNA的測序及分析結(jié)果，該菌株的序列與鞘氨醇單胞菌屬(sphingomonas)的多種細菌具有很高的同源性，大于96，其中與Sphingomonas capsulata 和Sphingomonas sp. DEP-AD1的同源性高

16、達99。以與鞘氨醇單胞菌屬關(guān)系較近的Ahrensia kielensis為外群，構(gòu)建基于降解菌H和同屬細菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖33）。降解菌H和Sphingomonas sp. DEP-AD1聚于同一發(fā)育小分支，與同屬的其他種的同源性也非常高。 5. H菌降解條件的優(yōu)化本研究采用均勻設(shè)計優(yōu)化H菌降解菲的試驗條件(表1)。均勻設(shè)計能從全面試驗點中挑選出部分代表性的試驗點，這些試驗點在試驗范圍內(nèi)充分均衡分散，但仍能反映體系的主要特征。例如正交設(shè)計是根據(jù)正交性來挑選代表點，它在挑選代表點時有兩個特點：均勻分散，整齊可比。為了達到這兩點，試驗點的數(shù)目就必須比較多。均勻設(shè)計只考慮試驗點

17、在試驗范圍內(nèi)充分“均勻分散”而不考慮“整齊可比”，因此它的試驗布點的均勻性會比正交設(shè)計試驗點的均勻性更好，使試驗點具有更好的代表性。采用均勻設(shè)計，每個因素的每個水平僅做一次試驗，當(dāng)水平增加時，試驗數(shù)隨水平數(shù)增加而增加，而若采用正交試驗，試驗數(shù)則隨水平數(shù)的平方數(shù)而增加，這是兩個試驗的最大不同處。將實驗結(jié)果經(jīng)DPS軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)二次多項式逐步回歸分析，并對該模型進行顯著性檢驗(表2)。得回歸方程Y=2.013632437+0.006417529039X2+9.102316609X1*X1+0.028758704091X1*X2-0.20999125426X1*X3相關(guān)系數(shù)R= 0.99979，F(xiàn)

18、值= 582.2746，顯著水平p=0.0311，剩余標(biāo)準差 S= 0.11409調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra= 0.99893，說明該方程能很好的擬合菲降解的過程。 圖34 -4基于降解菌H和同屬細菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(結(jié)點處數(shù)字示bootstrap值)3.5 H菌降解條件的優(yōu)化本研究采用均勻設(shè)計優(yōu)化H菌降解菲的試驗條件，結(jié)果見表1。均勻設(shè)計能從全面試驗點中挑選出部分代表性的試驗點，這些試驗點在試驗范圍內(nèi)充分均衡分散，但仍能反映體系的主要特征。例如正交設(shè)計是根據(jù)正交性來挑選代表點，它在挑選代表點時有兩個特點：均勻分散，整齊可比。為了達到這兩點，試驗點的數(shù)目就必須比較多。均勻設(shè)計只考慮試

19、驗點在試驗范圍內(nèi)充分“均勻分散”而不考慮“整齊可比”，因此它的試驗布點的均勻性會比正交設(shè)計試驗點的均勻性更好，使試驗點具有更好的代表性。采用均勻設(shè)計，每個因素的每個水平僅做一次試驗，當(dāng)水平增加時，試驗數(shù)隨水平數(shù)增加而增加，而若采用正交試驗，試驗數(shù)則隨水平數(shù)的平方數(shù)而增加，這是兩個試驗的最大不同處。表1. 降解菲的均勻設(shè)計表U6(623)及實驗結(jié)果水平因素 1 2 3 實驗結(jié)果接種量（OD600）底物濃度（mg/Ll - 1）培養(yǎng)時間（h)降解速率（mg/L-l1h-1)1 0.1 200 722.3611112 0.3 500 487.3333333 0.5 100 243.83754 0.0

20、5 400 724.4555565 0.2 50 481.0302086 0.4 300 246.8375將實驗結(jié)果經(jīng)DPS軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)二次多項式逐步回歸分析，并對該模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表2。得回歸方程：Y=2.013632437+0.006417529039X2+9.102316609X1*X1+0.028758704091X1*X2-0.20999125426X1*X3 相關(guān)系數(shù)R= 0.99979，F(xiàn)值= 582.2746，顯著水平p=0.0311，剩余標(biāo)準差 S= 0.11409，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra= 0.99893，說明該方程能很好的擬合菲降解的過程。表2. 用二次多項式

21、逐步回歸法處理的數(shù)據(jù)結(jié)果因素 偏相關(guān) t檢驗值 顯著水平pX20.994589.561680.01076X1*X10.9960111.165270.00793X1*X20.9961111.307200.00773X1*X3-0.992207.960420.01542從表2各變量可以看到顯著性檢驗p值的大小，可以知道對降解速率的影響大小為：X1*X3X2X1*X1X1*X2。從以上實驗結(jié)果我們還可以知道，因素之間存在交互作用。由以上均勻設(shè)計實驗，得出菲降解的最佳條件為：接菌量OD600為0.5，菲濃度為498.46726ppm，降解時間為47.09892h，最大降解速率為8.104167mgL-

22、1h-1。經(jīng)實驗驗證，在優(yōu)化條件下菲的降解速率為8.044002 mgL-1h-1，與回歸模型的預(yù)測值的相對誤差為0.74 ，說明利用均勻設(shè)計優(yōu)化實驗是可行性的。4 小四、結(jié)論4.1 1.作者本研究表明，采用改進的平板升華技術(shù)可以快速篩選得到高效的菲降解菌。降解菌株H為鞘氨醇單胞菌屬, 該菌株在搖瓶培養(yǎng)條件下，48h內(nèi)對菲(50mgL -/ 1l) 的幾乎可完全降解，降解率大于98%，并對高濃度的菲(500mg/Ll - 1)也能快速降解，降解率為70%，高于目前已報道的鞘氨醇單胞菌屬對菲的降解效能(11，13，14Boldein et al.,1993；Fredrickson et al.,

23、1995；Fang et al.,2000)。2.4.2 采用均勻設(shè)計替代正交實驗，試驗布點的均勻性比正交設(shè)計試驗點的均勻性更好，試驗點具有更好的代表性。進一步說明運用均勻設(shè)計理念設(shè)計降解條件優(yōu)化實驗的思路是可行的。本研究所獲得的高效菲降解菌株H將為探索菲的生物代謝途徑提供模式菌株，同時為將來研究PAHs 生物降解的分子機制，構(gòu)建能降解PAHs 的基因工程菌奠定基礎(chǔ)。參考文獻：1 方開泰，.1994，.均勻設(shè)計與均勻設(shè)計表M，北京：科學(xué)出版社。2 方開泰.，馬興長等，.2001.正交與均勻試驗設(shè)計M，北京：科學(xué)出版社。3 韓清鵬，方昉，秦利峰，王平等， . 2003，.多環(huán)芳烴降解菌的獲得及應(yīng)

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