分子生物學(xué)基因工程生物化學(xué)復(fù)習(xí)題

1、1、蛋白質(zhì)分子（多肽鏈）的方向性（即：N末端和C末端）是如何確定的？ 答：由肽鍵決定即通過(guò)氨基酸NH2和氨基酸COOH的脫水縮合，形成了N末端在左，C末端在右 2、什么是多肽鏈的肽平面？什么是二面角？ 答：肽平面：肽鍵具有一定程度的雙鍵性質(zhì)，參與肽鍵的六個(gè)原子C、H、O、N、C1、C2不能自由轉(zhuǎn)動(dòng)，位于同一平面。 二面角：一個(gè)碳原子相連的兩個(gè)肽平面，由于N1C1和C1C2（羧基碳）兩個(gè)鍵為單鍵。肽平面可以分別圍繞這兩個(gè)鍵旋轉(zhuǎn)，從而構(gòu)成不同的構(gòu)象。 3、維持蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)有哪幾種力？次級(jí)鍵包括哪幾種？ 答：二硫鍵、（氫鍵 疏水性相互作用力、離子鍵、范德法力。）第二小題 4、如何將蛋白質(zhì)變性

2、？如何復(fù)性？ 答：加熱、加乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等；去除上述因素，若變性程度較輕即可復(fù)性。 5、伴侶分子有哪兩種類型？其功能如何？ 答：分子伴侶和伴侶蛋白；輔助新生肽鏈折疊的，催化對(duì)形成功能所必需的共價(jià)鍵盤(pán)變化 6、人熱休克蛋白在新生蛋白質(zhì)折疊過(guò)程的作用是什么？ 答：輔助新生肽鏈正確折疊 7、膜蛋白分為哪兩種類型？它們各通過(guò)何種化學(xué)鍵與膜相結(jié)合？ 答；外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。1）共價(jià)鍵2）疏水性相互作用力 8、瘋牛病得病因是什么？ 蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變而凝集使其由可溶性變成不可溶性。 9、蛋白質(zhì)翻譯后需要進(jìn)行哪些形式的加工才能具有活性？ 肽鍵N末端甲硫氨酸殘基的切除，

3、蛋白質(zhì)前體的酶切修飾以及氨基殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾。 10、胃和胰腺分泌的消化蛋白酶的酶原如何加工才能具有活性？ 酶切加工 11、什么是蛋白質(zhì)的可逆磷酸化？ 蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化分別由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成。 12、什么是蛋白質(zhì)的靶向輸送？靶向輸送的蛋白質(zhì)的N端通常有何序列？ 定向動(dòng)送送執(zhí)行功能的目的地的過(guò)程；信號(hào)肽 13、何謂信號(hào)肽？其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？ 信號(hào)肽：分泌蛋白新生肽段N端的一段能被細(xì)胞轉(zhuǎn)動(dòng)系統(tǒng)識(shí)別的特征性的序列。 特點(diǎn)：該序列約為1630個(gè)氨基酸殘基分為N端堿性區(qū)、疏水核心區(qū)及加工區(qū)三個(gè)區(qū)段，緊接其后的是被信號(hào)肽酶裂解的點(diǎn)。 14、信號(hào)肽識(shí)別顆粒（SRP）的組成如何？其功

4、能是什么？ 一分子7SRNA和6分子蛋白質(zhì)；功能：既能識(shí)別露出核糖體之外的信號(hào)肽并與結(jié)合，又能識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的SRP受體。 15、真核細(xì)胞蛋白質(zhì)如何進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)？ 1）以MRNA為模板，在胞漿游離核糖體上合成多肽鏈；2）當(dāng)包括信號(hào)肽在內(nèi)的一段約70個(gè)氨酸殘基的多肽鏈被合成后，SRP與信號(hào)肽、核糖體及GTP結(jié)合，蛋白翻譯暫停；3）SRP引導(dǎo)核糖體多肽SRP復(fù)合體與SRP受體結(jié)合、啟動(dòng)GTP酶活性，水解GTP使SRP解離并再利用，翻譯功能恢復(fù)；4）核糖體大亞基與ER膜上的核糖體結(jié)合糖蛋白結(jié)合，錨定在ER膜上，水解GTP供能，誘導(dǎo)跨ER膜通道開(kāi)放，新生肽鏈的信號(hào)肽插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 5）信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除

5、并膜通道進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。ER信號(hào)肽啟動(dòng)肽鏈轉(zhuǎn)位，新生肽鏈通過(guò)跨降解；6）ER腔內(nèi)的HSP70消耗ATP，促進(jìn)新生肽鏈折疊成空間構(gòu)象；7）核糖體的大、小亞基及mRNA分離并進(jìn)入下一輪循環(huán)。 16、插入ER膜的第類膜蛋白有哪些信號(hào)序列？ 信號(hào)肽錨定序列 17、決定細(xì)胞核蛋白靶向運(yùn)輸和定位的信號(hào)序列是什么？ 核定位信號(hào) 18、泛素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和主要功能是什么？ 標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì)使之被水解，決定轉(zhuǎn)錄方向，模板鍵和轉(zhuǎn)錄效率和組合蛋白結(jié)合位點(diǎn)。 1、什么是操縱子？操縱子的上游調(diào)控區(qū)主要有哪些調(diào)控序列？各具有哪些功能？ 操縱子：原核基因上游的調(diào)控區(qū)及下游轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)共同組成的一個(gè)基因表達(dá)單位；上游調(diào)控區(qū)主

6、要有啟動(dòng)子和操控基因；功能：?jiǎn)?dòng)子：結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；操縱基因：特異性阻遏物的結(jié)合區(qū)。 2、大腸桿菌的啟動(dòng)子通常是什么？ -10區(qū)、-35區(qū)、+1區(qū)、 3、6因子的功能是什么？其主要類型的是什么/？ 識(shí)別啟動(dòng)子。628、632、654、670、 4、LAC操縱子調(diào)控區(qū)有哪些調(diào)控序列（結(jié)合位點(diǎn)）？各具有哪些功能？ 5、為什么LAC操縱子的阻蛋白能夠抑制轉(zhuǎn)錄？ 由于操縱子元件與啟動(dòng)子有部分重疊阻蛋白與操縱元件結(jié)合后，可抑制RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄。 6. cAMP是如何產(chǎn)生的？CAP如何調(diào)節(jié)lac 操縱子的表達(dá)？ CAMP是腺苷酸催化ATP產(chǎn)生的，只有CAP結(jié)合結(jié)合到啟動(dòng)子上游

7、的CAP結(jié)合位點(diǎn)后，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合才能有這轉(zhuǎn)錄。 7. 何謂葡萄糖效應(yīng)？ 細(xì)菌通常優(yōu)先以葡萄糖作為能源，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中有葡萄糖時(shí)，即使加入乳糖，阿拉伯糖等糖類，細(xì)菌也不用這些糖，不產(chǎn)生代謝這些糖的酶，直到葡萄糖消耗完畢代謝其他糖的酶才會(huì)根據(jù)相應(yīng)的糖是否存在被誘導(dǎo)產(chǎn)生，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)。 8. (p)ppGpp的功能是什么？ 調(diào)節(jié)活性大分子的協(xié)調(diào)性 9. 乳糖操縱子如何由CAP和阻遏蛋白共同調(diào)控？ 10. 在trp 操縱子中，何謂前導(dǎo)序列？其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？ 11. 何謂衰減子？它在是如何形成的？其功能是什么？ 12. 原核生物mRNA翻譯起始位點(diǎn)的特點(diǎn)是什么？ AUG上游10

8、個(gè)堿基處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與16S rRNA 3端識(shí)別 13. mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)如何控制翻譯起始？ MRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可隱蔽SD序列，使核糖體無(wú)法序列。 分子是如何產(chǎn)生的？其功能如何？RNA反義14. 15. 真核生物基因表達(dá)如何在染色質(zhì)（染色體）進(jìn)行調(diào)控？各舉一例說(shuō)明。 16. DNA甲基化發(fā)生在哪個(gè)堿基的哪個(gè)位點(diǎn)？ 17. DNA甲基化為什么使基因不能表達(dá)？ 甲基化影響基因表達(dá)的機(jī)制有下列幾種：直接作用：基因的甲基化直接改變了基因的構(gòu)型，影響DNA特異順序與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使基因不能轉(zhuǎn)錄；間接作用：基因5端調(diào)控序列甲基化后與核內(nèi)甲基化CG序列結(jié)合蛋白結(jié)合，阻止了轉(zhuǎn)錄因子 與基因形

9、成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。 18. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)如何影響基因表達(dá)？ 19. 何謂順式作用元件？何謂反式作用因子? 舉例說(shuō)明。 順式作用元件：真核生物基因中的調(diào)控序列決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。 反式作用元件：能直接或間接結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì) 順式：?jiǎn)?dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、衰減子、終止子 反式：DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子 20. 真核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有哪幾種模體? 每種模體的主要特點(diǎn)是什么？ 1）鋅指：借助半脫氨基酸和組氨基與鋅離子結(jié)合2）間源異型域：具有螺旋回折螺旋結(jié)構(gòu)3）亮氨基拉鏈：使兩個(gè)單位結(jié)合并形成DNA結(jié)構(gòu)域4）螺旋環(huán)螺旋：易于形成二聚體，

10、能與免疫蛋白K鏈基因增強(qiáng)子結(jié)合的反式E12和E17具有這種結(jié)構(gòu)。 21. 原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要是哪一種模體？ 22. 轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域的主要特點(diǎn)是什么？有哪幾種模體? 哪種模體的激活能力最強(qiáng)? 23. 何謂染色質(zhì)重塑? 改變?nèi)旧w位置和結(jié)構(gòu)，改變?nèi)旧wDNA可接近程度 24. 何謂反式作用因子的組合調(diào)控? 每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，但反式作用因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子結(jié)合發(fā)揮特定的作用。 25. 真核pre-mRNA 需要進(jìn)行哪些加工? 真核pre-mRNA需要進(jìn)行5端加帽，選擇性剪接，3端加定 26. 5-帽

11、子結(jié)構(gòu)分為哪幾種類型?脊椎動(dòng)物的帽子結(jié)構(gòu)中有幾個(gè)甲基？帽子的功能是什么？ 5-帽子結(jié)構(gòu)分為CAP0、CAP、CAP；三個(gè)；1）決定mRNA穩(wěn)定性，2）通過(guò)核膜輸送3）翻譯 27. 真核mRNA 3-端多聚腺苷酸化的信號(hào)是什么？poly (A)尾的功能是什么? poly (A)尾的功能是保護(hù)mRNA不受降解 28. 為什么tRNA和rRNA分子要比mRNA穩(wěn)定得多? 有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)rRNA和tRNA29. 什么是蛋白質(zhì)同質(zhì)異形體? 蛋白質(zhì)同質(zhì)異形體的功能是否相同？ 蛋白質(zhì)同質(zhì)異形體：不同基因翻譯表達(dá)同一蛋白質(zhì)；有可能相同有可能不同； 30. 人類大約有多少個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因? 人體內(nèi)有多少種蛋白質(zhì)

12、？為什么一個(gè)基因可以編碼多種蛋白質(zhì)？ 人類大約有24000左右個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，10萬(wàn)種蛋白質(zhì) 31. 舉例說(shuō)明真核mRNA的5-UTR和3-UTR如何在翻譯水平調(diào)解基因表達(dá)水平? 32. 不穩(wěn)定的真核mRNA的3端序列的特點(diǎn)是什么? 以不完全互補(bǔ)的形式結(jié)合在3端AU段，富含AU序列被核苷酸切割易識(shí)別 33. 線蟲(chóng)編碼小分子miRNA（lin-4）如何調(diào)解基因（lin-14）的表達(dá)? 34. 真核基因表達(dá)調(diào)控有哪幾個(gè)主要階段? 1）轉(zhuǎn)錄2）轉(zhuǎn)錄加工3）mRNA降解4）翻譯5）翻譯加工6）蛋白質(zhì)分選7）蛋白質(zhì)降解 35. 何謂基因表達(dá)的“統(tǒng)一理倫” ? 36. 何謂CTD ? CTD的功能是什么

13、？ CTD：RNAP最大的亞基C端結(jié)構(gòu)域；功能：CTDRNA加工過(guò)程中起著平臺(tái)作用通過(guò)CTD 加工因子進(jìn)行相應(yīng)加工。pre-mRNA磷酸化來(lái)調(diào)整及招募不同基因工程試卷B 一 名詞解釋（每個(gè)2分，共20分） 1、轉(zhuǎn)化: 2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移性: 3、DNA文庫(kù): 4、RACE: 5、選擇標(biāo)記基因: 6、降落PCR 7、載體: 8、感受態(tài)細(xì)胞: 9CaMV35s: 10、ORF: 二、選擇題（每題1分，共15分） 1( ) 限制性核酸內(nèi)切酶是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其生理意義是 A 修復(fù)自身的遺傳缺陷 B 促進(jìn)自身的基因重組 C 強(qiáng)化自身的核酸代謝 D 提高自身的防御能力 2( )生物工程的下游技術(shù)是 A 基因工程

14、及分離工程 B 蛋白質(zhì)工程及發(fā)酵工程 C 基因工程及蛋白質(zhì)工程 D分離工程 及蛋白質(zhì)工程 3 ( )基因工程操作常用的酶是:(I 內(nèi)切酶II 連接酶III 末端轉(zhuǎn)移酶IV聚合酶 A. I + II B. I + III + IV C. II + III + IV D. I +II + IV + III 4 ( )限制性內(nèi)切核酸酶的星活性是指： A 在非常規(guī)條件下，識(shí)別和切割序列也不發(fā)生變化的活性。 B 活性大大提高 C 切割速度大大加快 D識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同 5( )下列五個(gè) DNA 片段中含有回文結(jié)構(gòu)的是 A. GAAACTGCTTTGAC B. GAAACTGGAAACTG C. G

15、AAACTGGTCAAAG D. GAAACTGCAGTTTC 6 ( )關(guān)于cDNA的不正確的提法是： A同mRNA互補(bǔ)的單鏈RNA B同mRNA互補(bǔ)的含有內(nèi)含子的DNA C以mRNA為模板合成的雙鏈RNA D以上都不正確 7 ( )下列有關(guān)連接反應(yīng)的敘述，錯(cuò)誤的是 A. 連接反應(yīng)的最佳溫度為 37 B. 連接反應(yīng)緩沖體系的甘油濃度應(yīng)低于 10% C. 連接反應(yīng)緩沖體系的 ATP 濃度不能高于 1mM 倍2-5 連接酶通常應(yīng)過(guò)量D. 8 ( ) T -DNA 連接酶是通過(guò)形成磷酸二酯鍵將兩段 DNA 片段連接在一起，其底物 4的關(guān)鍵基團(tuán)是 A. 2 -OH 和 5 P B. 2 -OH 和

16、3 -P C. 3 -OH 和 5 P D. 5 -OH 和 3 -P 9 ( )載體的功能是 A. 外源基因進(jìn)入受體的搭載工具 B. 不能為外源基因提供整合能力 C. 不能提供復(fù)制能力 D. 不能為外源基因提供表達(dá)能力 10 ( ) 黏性末端連接法，不僅操作方便，而且 A產(chǎn)生新切點(diǎn) B易于回收外源片段 C載體不易環(huán)化 D影響外源基因的表達(dá) 11 ( )下列哪種克隆載體對(duì)外源DNA的容載量最大? A質(zhì)粒 B黏粒 C酵母人工染色體(YAC) D噬菌體 12 ( )考斯質(zhì)粒（cosmid）是一種 A. 容量最大一種載體 B. 由 -DNA 的 cos 區(qū)與一質(zhì)粒重組而成的載體 C.是一種單鏈DNA

17、環(huán)狀載體 D. 不能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但可以表達(dá) 13 ( )某一重組 DNA 的載體部分有兩個(gè) BamHI 酶切位點(diǎn)。用 BamHI酶切后凝膠電泳上出現(xiàn)四條長(zhǎng)度不同的帶子，其長(zhǎng)度總和與已知數(shù)據(jù)吻合，該重組分子插入片段上的 BamHI 酶切位點(diǎn)共有 A.4 個(gè) B. 3 個(gè) C. 1 個(gè) D. 2 個(gè) 14( )下列哪一種酶作用時(shí)需要引物? A限制酶 B末端轉(zhuǎn)移酶 C反轉(zhuǎn)錄酶 D DNA連接酶 15用下列方法進(jìn)行重組體的篩選，只有( )說(shuō)明外源基因進(jìn)行了表達(dá)。 (a)Southem印跡雜交 (b)Northem印跡雜交 (c)Western印跡 (d)原位菌落雜交 三、簡(jiǎn)答題（每題5分，共25

18、分） 1、簡(jiǎn)述獲得目的基因常用的幾種方法。 2、什么是-互補(bǔ)篩選？ 3、簡(jiǎn)述酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件？ 4、核酸操作的基本技術(shù)有哪些？ 5、限制性核酸內(nèi)切酶有幾種類型？常用是哪種類型并簡(jiǎn)述其特性。 分）40分，共10四、論述題（每題1論述重組子的篩選和鑒定常用的方法。 2基因工程基本操作程序。 3試述5RACE技術(shù)原理和方法 4試舉例說(shuō)明基因工程中為什么常用大腸桿菌作為工程菌？ 基因工程試題標(biāo)準(zhǔn)答案及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)B 一、選擇題（每題1分，共15分） 1、D 2、A 3、A 4、D 5、D 6、C 7、A 8、C 9、D 10、C 11、C 12、B 13、D 14、C 15、C 二、名詞解釋（每題2

19、分，共20分） 1、嚴(yán)格地說(shuō)是指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過(guò)程 2、質(zhì)粒不親和性：在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種不同質(zhì)粒不能夠在同一宿主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。 3、cDNA文庫(kù)：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而成的克隆的集合。 4、RACE：是一種通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄，成cDNA第一鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到3或5端之間未知序列的方法。 5、基因文庫(kù)：通過(guò)克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的某種生物，組織，器官或細(xì)胞類型的所有DNA片段而構(gòu)成的克隆集合體。 6、RT-PCR:先用逆轉(zhuǎn)錄酶作

20、用于mRNA，以寡聚dT為引物合成cDNA第一鏈，然后用已知一對(duì)引物，擴(kuò)增嵌合分子，這種方法稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR 7、載體：指基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具，它的本質(zhì)是DNA復(fù)制子。 8、S-D序列：在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16S，核糖體RNA 3末端堿基互補(bǔ)的序列，該序列最初由Shine 、Dalgarno發(fā)現(xiàn)，故后來(lái)命名為ShineDalgarno 序列，簡(jiǎn)稱S-D序列。 9、穿梭質(zhì)粒載體：指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)的選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 10、MCS：指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限

21、制核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的DNA片段。 三、簡(jiǎn)答題（共25分，每題5分） 1、什么是包涵體？ 重組蛋白在胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，常常以不溶性蛋白聚集成的晶狀物形式存在，這種晶狀體即包涵體。包涵體的形成是外源蛋白的高效表達(dá)時(shí)的普遍現(xiàn)象，這是由于肽鏈折疊過(guò)程中部分折疊的中間態(tài)發(fā)生了錯(cuò)誤聚合，而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。 2、什么是-互補(bǔ)篩選？ laclacZ插入到它的，可造成表達(dá)半乳糖苷酶基因（DNAZ），當(dāng)外源質(zhì)粒載體具有-后的-半乳糖苷酶失活，利用這一點(diǎn)就可以通過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在添加有X-gal-IPTGlacZ基因的部分編碼培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子。有些大腸桿菌上帶有序列，

22、質(zhì)粒載體中含有別一部分編碼序列，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入載體后，可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。lacZ這種基因上缺失了一部分編碼序列的突變體與帶有這一部分編碼序列的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫互補(bǔ)。 3、限制性核酸內(nèi)切酶的活性受哪些因素影響？ 酶的純度。 樣品的純度。DNADNA的甲基化程度。 酶切反應(yīng)的溫度與時(shí)間。 DNA分子的構(gòu)型。 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液。 4、核酸操作的基本技術(shù)有哪些？ 核酸提取與純化核酸的檢測(cè)與保存核酸的凝膠電泳核酸分子雜交 5、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是什么？ 是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明。 理論上的三大發(fā)現(xiàn)： 證實(shí)了DNA是遺傳物質(zhì) 揭示了DNA分子的雙

23、螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理 遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定 技術(shù)上的三大發(fā)明： 限制核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA切割 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接 基因工程載體的研究與應(yīng)用 四、問(wèn)答題（每題10分，共40分） 1如何有效地提高外源基因的表達(dá)效率？ 提高啟動(dòng)子強(qiáng)度 縮短啟動(dòng)子同克隆基因間距離 高效的翻譯起始序列 高效的轉(zhuǎn)錄終止區(qū) 提高質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性 用以下方法提高翻譯水平：調(diào)整SD序列與AUG間的距離用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基增加mRNA的穩(wěn)定性的 減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷：誘導(dǎo)表達(dá)表達(dá)載體的誘導(dǎo)復(fù)制 提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解：克隆一段原核序列，表達(dá)融合蛋白采用某種突變菌株表

24、達(dá)分泌蛋白質(zhì) 2試述載體構(gòu)建一般方法 A 目的基因分析（1）ORF 分析（2）酶切位點(diǎn)分析 B 載體選擇與分析（1）多克隆位點(diǎn)分析（2）抗性標(biāo)記分析（3）啟動(dòng)子與其他篩選標(biāo)記分析 C 連接體系與連接時(shí)間確定 3 試述5RACE技術(shù)原理和方法 PCR用于擴(kuò)增代表mRNA轉(zhuǎn)錄物某一單位點(diǎn)與其3或5末端之間區(qū)域的部分cDNA稱為快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)（RACE）。如果已知mRNA的一片段鏈內(nèi)短序列，據(jù)此或設(shè)計(jì)基因特異引物，用原先存在的poly(A)尾（3末端）或附加的同聚尾（5末端）互補(bǔ)的序列做末端引物，就可以獲得從未知末端直到已知區(qū)域的部分cDNA序列。為獲得5末端部分cDNA克隆需用基因特異引

25、物，產(chǎn)物第一鏈產(chǎn)物，可用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶及dATP加poly(A)尾。通過(guò)QT引物和反轉(zhuǎn)錄使用的上游基因特異引物生成第二鏈cDNA。 4 大腸桿菌作為基因工程受體菌的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？ 優(yōu)點(diǎn)：大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的背景知識(shí)清楚，對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理也比較了解，而且歷經(jīng)二十年的基因工程實(shí)踐，大腸桿菌已發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，有多種適用的寄主菌株和載體系列，大腸桿菌易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。 缺點(diǎn)：在通常情況下，細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物需要經(jīng)過(guò)翻譯后的加工修飾，如正確的折疊和組裝，而細(xì)菌中通常并沒(méi)

26、有這樣的修飾機(jī)制，從而可能導(dǎo)致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產(chǎn)物無(wú)法產(chǎn)生有活性的蛋白；外源真核基 因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細(xì)菌的蛋白酶識(shí)別，并被當(dāng)做“異已分子”降解掉。三、關(guān)于酶的組題（答題要簡(jiǎn)潔，條理清晰，有針對(duì)性。如果你要回答的內(nèi)容在前面已經(jīng)給 出，可以采用“參見(jiàn)”的引用方式，以便節(jié)省答題時(shí)間） 4分）1 酶為什么具有催化功能？（）屬于絲氨酸蛋白水解酶家族？你還知道那些絲氨酸蛋為什么糜蛋白酶（Chymotrypsin2 4分）白水解酶以及蛋白水解酶家族？（4pH值？（3 酶為什么具有最適催化溫度和 分）糜蛋白酶的催化動(dòng)力學(xué)曲線與肌紅蛋白的 4酶轉(zhuǎn)氨甲酰線類似；天冬氨酸曲氧合它的催化動(dòng)力學(xué)

27、（ATCase）是一個(gè)變構(gòu)酶，為什曲線是否與血紅蛋白的氧合曲線類似， 么？（4分）糜蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其激活過(guò)程如圖所5 4示，這個(gè)激活順序能否顛倒？給出理由（ 分）、對(duì)于人工酶（如環(huán)糊精）、核酶（RNA6 抗體酶、同工酶、以及具有催化功能的脂類分子集合體等具有明顯區(qū)別的概念或?qū)ο?，”“催化你能用什么基本原理將他們統(tǒng)一在 4分）的旗幟下？給出理由（enzyme overproduced drug that inhibits an as III. You are working on a compound a potential steady-state cell proliferation (

28、cancer). A whose uncontrolled activity leads to uncontrolled kinetic analysis of the enzyme-catalyzed reaction was carried out, with velocities measured as a function of the concentration of the substrate in the absence and in the presence of 10 nM inhibitor. The results of the kinetics experiment a

29、re plotted for you below. Please answer the following questions. (10 pts) What type of inhibitor is this compound (be as specific as you can)? Show the diagram of 1. denoting substrate, enzyme, S denoting I denoting s the inhibitormechanism (by E inhibitor; for example: ). E+PESE+Sappappof presence

30、in , Kthe inhibitor K in the absence of andK , 2. Calculate the Kcatcatmminhibitor (app denoting apparent. The total concentration of enzyme is 2nM). . 3.Calculate the inhibitor constant KI-linkages 1,4-catalyzing the hydrolysis of Lysozyme destroys the cell wall of bacteria by IV. a residues in and

31、 N-acetyl-D-glucosamine (NAG) between N-acetylmuramic acid (NAM) peptidoglycan. Six hexoses of the substrate fit into the active site of lysozyme, a deep cleft across part of the globular protein surface this cleft. Figure A shows the hydrolytic process of of profile shows the pH-activity NAM and NA

32、G and figure B 1,4-linkages between lysozyme. Please calculate the ratio of the enzyme molecules which really work at pH 3.8, 5.2, 6.6 to all enzyme molecules, and explain figure B according to your calculation (pH = pKa + 0.72.1GluAsp-5). ，126/HA)； pKa = 5.9, pKa10 = 4.5；10lg(A B A 三、關(guān)于酶的組題（答題要簡(jiǎn)潔，條

33、理清晰，有針對(duì)性。如果你要回答的內(nèi)容在 前面已經(jīng)給出，可以采用“參見(jiàn)”的引用方式，以便節(jié)省答題時(shí)間） 4分）7酶為什么具有催化功能？（降低活化能的因素有：，使反應(yīng)速度加快答：酶可以降低反應(yīng)的活化能，【2分】分】，包括反應(yīng)物的商減少效）酶與底物的相互誘導(dǎo)結(jié)合產(chǎn)生結(jié)合能【（11）活應(yīng)、脫溶劑效應(yīng)、電子云的定向重排效應(yīng)、酶對(duì)過(guò)渡態(tài)的穩(wěn)定效應(yīng)；（2分】，包括酸堿催化、共鍵催化、金屬離子性中心特殊基團(tuán)的催化作用【1 催化等。）屬于絲氨酸蛋白水解酶家族？你還知道那Chymotrypsin8為什么糜蛋白酶（ 些絲氨酸蛋白水解酶以及蛋白水解酶家族？（4分）】1殘基在蛋白質(zhì)水解反應(yīng)中起重要的催化作用【答：糜蛋白

34、酶活性中心的Ser 】。1酸堿催化和共價(jià)催化【其它絲氨酸蛋白酶如：trypsin （胰蛋白酶）， elastase （彈性蛋白酶），subtilisin （枯草桿菌蛋白酶，thrombin（凝血酶），plasmin（血纖維蛋白溶酶）等【中英文皆可，寫(xiě)出兩個(gè)以上給1分，寫(xiě)出1個(gè)給0.5分】。 其它蛋白水解酶家族：天冬氨酸（Asp）蛋白水解酶家族，光氨酸（Cys）蛋白水解酶家族，金屬蛋白水解酶家族等【中英文皆可，寫(xiě)出兩個(gè)以上給1分，寫(xiě)出1個(gè)給0.5分】。 9酶為什么具有最適催化溫度和pH值？（4分） ：溫度的升高可以使任何化最適溫度答：分】；過(guò)高的1學(xué)反應(yīng)的速度加快【使酶的催化溫度會(huì)使酶的構(gòu)象變化

35、，分】，矛盾雙方的調(diào)和1能力降低【 使酶有一個(gè)最佳的催化溫度。：酶的酸堿或共價(jià)催化需值最適pH要催化基團(tuán)處于質(zhì)子化或脫質(zhì)子化狀有依賴性；同時(shí)pH1分】，對(duì)態(tài)【的變化對(duì)穩(wěn)定酶構(gòu)象的相互作用，pH1特別是靜電相互作用有較大影響【分】。上述因素的綜合，會(huì)使酶有一 值。個(gè)最佳的催化pH糜蛋白酶的催化動(dòng)力學(xué)曲線與肌紅蛋白的氧合曲線類似；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨 10）是一個(gè)變構(gòu)酶，它的催化動(dòng)力學(xué)曲線是否與血紅蛋白的氧甲酰酶（ATCase 4分）合曲線類似，為什么？（和血紅蛋白都屬于寡聚體變構(gòu)（別構(gòu)）蛋白，分】。理由：ATCase答：類似【2效應(yīng)/效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)【1分】；某一結(jié)合位點(diǎn)與底物它們包含多個(gè)與底物/效應(yīng)物的

36、/物的結(jié)合通過(guò)構(gòu)象變化會(huì)影響（加強(qiáng)或減弱）到其它位點(diǎn)與底物Michaelis-Menten它們的催化或結(jié)合動(dòng)力學(xué)不遵從分】。結(jié)合（變構(gòu)效應(yīng)）【1 S形曲線。方程（雙曲線），一般為糜蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其激活過(guò)程如圖所示，這個(gè)激活順序能否顛倒？ 11 分）給出理由（4分】。理由：可能糜蛋白酶原上只暴露有胰蛋白酶的切割位點(diǎn)2答：不能顛倒【分】；當(dāng)胰蛋白酶對(duì)糜蛋白（水解），而糜蛋白酶的切割位點(diǎn)尚未暴露【1-Chymotrypsin, ?結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生調(diào)整變化，才暴露出糜蛋白酶（酶原進(jìn)行切割后， 分】。1）的切割位點(diǎn)【-Chymotrypsin?12 對(duì)于人工酶（如環(huán)糊精）、核酶（RNA）、抗體酶、同工酶、

37、以及具有催化功能的脂類分子集合體等具有明顯區(qū)別的概念或?qū)ο?，你能用什么基本原理將他們統(tǒng)一在“催化”的旗幟下？給出理由（4分） 答：用酶的催化機(jī)理來(lái)統(tǒng)一【2分】。理由：這些對(duì)象雖然屬于不同物質(zhì)類別或分子整體結(jié)構(gòu)大不相同，但他們一定有能與他們各自的底物相結(jié)合的活性中心，通過(guò)各種效應(yīng)（參見(jiàn)答1）來(lái)完成催化功能【2分】，因此，酶不一定是蛋白質(zhì)，只要是能提供執(zhí)行催化機(jī)理的有序基團(tuán)集合（即活性中心）的物質(zhì)（分子）結(jié)構(gòu)，就具有酶的功能。 III答案要點(diǎn) 1 Noncompetitive inhibitor，a special mixed inhibitor【1pts】 【2pts】 1pt】M【 1/0.8

38、 1.25 2Km56 】 mM/s【） 510 V/E 1/（2101ptKmaxcatapp 】M【1pt 1.25 Km56app 】【1.2510）/ （2101pt mM/s） K（ 1/4catapp 1ptV / V】【 ? (1I/K) 3maxmaxI6app6 】 mM 3.310【 1) 10102pts4/（1） / V K I/( V maxImax IV. 】【21pH3.81/5 4.5 = -0.7，Asp-/HAsp pH pKa 3.8 lg(Asp-/HAsp) Asp所占比例起堿作用的1/6 Asp-）Asp-） Asp-/（5Asp-HAspAsp-

39、/（1/126 ，-2.1Glu-/HGlu 5.9 同理，lg(Glu-/HGlu) 3.8 所占比例起酸作用的Glu126/127 ）HGluHGlu/126（HGlu/ ）Glu-HGlu（HGlu/真正能工作的酶分子比例（1/6）（126/127） 16.5% 2. pH5.2【2】 類似1的計(jì)算，此時(shí)真正能工作的酶分子比例（5/6）（5/6） 69.4% 3. pH 6.6【2】 類似1的計(jì)算，此時(shí)真正能工作的酶分子比例（126/127）（1/6） 16.5% 此計(jì)算說(shuō)明，反應(yīng)體系pH值的變化影響作為催化基團(tuán)GLu35和Asp52的解離狀態(tài)，從而影響酸堿催化和共價(jià)催化。要使溶菌酶保持

40、高活性，需要一個(gè)恰當(dāng)?shù)?】。4值【pH所謂最佳催化-值pH一、填空（不要求很深的機(jī)理） 1、丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)的第一步反應(yīng)，即丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA的過(guò)程，是由丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化的。 2、肝細(xì)胞能維持血糖濃度的穩(wěn)定，是因?yàn)楦渭?xì)胞具有葡萄糖-6-磷酸酶,腦細(xì)胞和肌肉細(xì)胞無(wú)此酶。 3、在肌肉組織中,由于缺乏葡萄糖-6-磷酸酶肌糖原不能直接補(bǔ)充葡萄糖. 4、Ketone bodies are fuels for extrahepatic tissues. They are actone,acetoacetate and 5、Lipids are carried in the blood plasma from one tissue to another as plasma lipoproteins. LDL Is responsible for carrying cholesterol to extrahepatic tissue. 二、是非（清楚字眼，如氧化、還原） 1、細(xì)胞培養(yǎng)物由供氧條件轉(zhuǎn)為厭氧條件時(shí),葡萄糖的利用速度提高.R 2、哺乳動(dòng)物體內(nèi)不能合成的脂肪酸是油酸和亞油酸.W 3、膽固醇合成的限速酶是HMG CoA合酶. 4、All the reactions of T