PCR檢測方法分析性能評價

1、PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價2 醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴增檢驗領(lǐng)域醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴增檢驗領(lǐng)域 的指南的指南CNAS-GL xx 5.5.2) CNAS-GL xx 5.5.2) 實驗室應(yīng)在應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗之前驗證所使用的檢驗方實驗室應(yīng)在應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗之前驗證所使用的檢驗方 法和程序的分析性能法和程序的分析性能. .對于定量檢測項目內(nèi)容至少包括對于定量檢測項目內(nèi)容至少包括 正確度正確度、精密度精密度、可報告可報告( (或線性或線性).).對于定性檢測項目對于定性檢測項目 內(nèi)容應(yīng)包括靈敏度內(nèi)容應(yīng)包括靈敏

2、度、特異性或符合率及重復(fù)性特異性或符合率及重復(fù)性 上海市醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗技術(shù)審核辦法上海市醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗技術(shù)審核辦法 臨床基因擴增檢驗實驗室在技術(shù)審核前應(yīng)完成擬開展臨床基因擴增檢驗實驗室在技術(shù)審核前應(yīng)完成擬開展 檢測項目方法學(xué)驗證。方法學(xué)驗證實驗應(yīng)包括但不限檢測項目方法學(xué)驗證。方法學(xué)驗證實驗應(yīng)包括但不限 于：精密度、正確度、檢測限、線性范圍、可報告范于：精密度、正確度、檢測限、線性范圍、可報告范 圍、特異性試驗圍、特異性試驗 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價3 什么情況下要做性能驗證 開展新項目開展新項目 更換檢測系統(tǒng)更換檢測系統(tǒng): :更換儀器或試劑更換儀器或試

3、劑 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價4 分析性能驗證項目分析性能驗證項目 對配套系統(tǒng)對配套系統(tǒng), ,一般驗證以下指標(biāo)一般驗證以下指標(biāo) 精密度精密度 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 可報告范圍可報告范圍 參考區(qū)間參考區(qū)間 對非配套系統(tǒng)除驗證上述指標(biāo)外對非配套系統(tǒng)除驗證上述指標(biāo)外 分析靈敏度分析靈敏度 分析特異性分析特異性 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價5 依據(jù)文件(CLSI 文件) EP5-A2:EP5-A2:定量測量方法的精密度性能評價定量測量方法的精密度性能評價 EP6-A:EP6-A:定量測量方法的線性評價定量測量方法的線性評價 EP7-A:EP7-A:臨床化學(xué)的干擾實驗臨床化

4、學(xué)的干擾實驗 EP9-A2:EP9-A2:用患者樣本進行方法學(xué)比對及偏倚評估用患者樣本進行方法學(xué)比對及偏倚評估 EP12-A2:EP12-A2:定性實驗方法評價用戶協(xié)議定性實驗方法評價用戶協(xié)議 EP15-A2: EP15-A2: 用戶對精密度和準(zhǔn)確度核實試驗用戶對精密度和準(zhǔn)確度核實試驗 EP17-A: EP17-A: 檢出限和定量檢出限確定方案檢出限和定量檢出限確定方案 C28-A2: C28-A2: 醫(yī)學(xué)實驗室參考區(qū)間的定義和確定醫(yī)學(xué)實驗室參考區(qū)間的定義和確定 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價6 性能驗證前的準(zhǔn)備 應(yīng)熟悉待驗證的檢測系統(tǒng)應(yīng)熟悉待驗證的檢測系統(tǒng) 應(yīng)熟悉驗證方案的步

5、驟應(yīng)熟悉驗證方案的步驟(PCR檢測項目成本高檢測項目成本高、陽性標(biāo)陽性標(biāo) 本來源困難本來源困難,精密度和正確度驗證可以采用精密度和正確度驗證可以采用EP15-A2 文文 件件) 制定質(zhì)量保證措施制定質(zhì)量保證措施 確保足夠的樣本數(shù)量和覆蓋較寬檢測范圍確保足夠的樣本數(shù)量和覆蓋較寬檢測范圍 確定比較方法確定比較方法 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價7 EP15-A2:精密度和準(zhǔn)確度性能的用戶驗證 實驗室驗證方法的操作與廠家的申明一致實驗室驗證方法的操作與廠家的申明一致 為驗證重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度的申明提供方案和數(shù)為驗證重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度的申明提供方案和數(shù) 據(jù)分析據(jù)分析 其他的其他

6、的 CLSI CLSI 文件為廠家做出精密度文件為廠家做出精密度(EP5-A2)(EP5-A2)和準(zhǔn)確和準(zhǔn)確 度度(EP9-A2)(EP9-A2)的申明提供指南的申明提供指南 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價8 精密度驗證精密度驗證 重復(fù)性重復(fù)性: :指在相同條件指在相同條件 ( (時間、操作者、儀器時間、操作者、儀器) )下獲得下獲得 的精密度的精密度, ,也稱批內(nèi)精密度也稱批內(nèi)精密度 實驗室內(nèi)精密度實驗室內(nèi)精密度: :同一實驗室內(nèi)，使用相同的設(shè)備同一實驗室內(nèi)，使用相同的設(shè)備, , 在在 不同時間內(nèi)獲得的精密度不同時間內(nèi)獲得的精密度, ,也稱總精密度也稱總精密度.(.(不包括大

7、的不包括大的 設(shè)備維護、儀器校準(zhǔn)和更換試劑批號等設(shè)備維護、儀器校準(zhǔn)和更換試劑批號等) ) PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價9 實驗要求 試劑試劑: :同一批號同一批號 實驗樣本實驗樣本 以前分析過的病人樣本以前分析過的病人樣本 其他已知值的物質(zhì)其他已知值的物質(zhì) 濃度要求濃度要求: : 醫(yī)學(xué)決定水平醫(yī)學(xué)決定水平 廠家說明書精密度指標(biāo)所用濃度廠家說明書精密度指標(biāo)所用濃度 內(nèi)容內(nèi)容 重復(fù)性重復(fù)性 實驗室內(nèi)精密度實驗室內(nèi)精密度 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價10 實驗步驟 根據(jù)廠家申明的精密度比例關(guān)系可分為根據(jù)廠家申明的精密度比例關(guān)系可分為3 3種情況種情況: : 1)

8、1)如果如果批內(nèi) 批內(nèi)2/3 2/3 2/3 總 總: :每天分析 每天分析1 1批次批次,2,2個濃度個濃度, ,每個每個 濃度重復(fù)測定濃度重復(fù)測定3 3次次, ,連續(xù)連續(xù)3 3天天. . 3)3)如果如果批內(nèi) 批內(nèi)與 與 總 總相對關(guān)系未知 相對關(guān)系未知: :每天分析每天分析1 1批次批次,2,2個個 濃度濃度, ,每個濃度重復(fù)測定每個濃度重復(fù)測定4 4次次, ,連續(xù)連續(xù)5 5天天. . 每天做室內(nèi)質(zhì)控每天做室內(nèi)質(zhì)控, ,如果失控如果失控, ,剔除數(shù)據(jù)剔除數(shù)據(jù), ,重新進行測定重新進行測定 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理: :批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差、實驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差、實驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差

9、PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價11 結(jié)果判斷 重復(fù)性驗證重復(fù)性驗證: : 批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差 廠家申明廠家申明, , 則通過計算驗證值進行則通過計算驗證值進行 差異的顯著性檢驗差異的顯著性檢驗, , 批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差 驗證值驗驗證值驗 證通過證通過 實驗室內(nèi)精密度驗證實驗室內(nèi)精密度驗證: : 實驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差實驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差 廠家申廠家申 明明, ,則通過計算驗證值進則通過計算驗證值進 行差異的顯著性檢驗行差異的顯著性檢驗, , 實驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差實驗室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差 驗證驗證 值值, ,驗證通過驗證通過 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價12 準(zhǔn)確度與正確度、精密度的關(guān)系

10、 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價13 正確度驗證正確度驗證 比對方法比對方法: :用臨床病人樣本進行方法學(xué)比對用臨床病人樣本進行方法學(xué)比對, ,類似類似EP9- EP9- A2A2文件文件 參考物質(zhì)參考物質(zhì) PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價14 兩種方法間病人標(biāo)本結(jié)果的比較 實驗設(shè)計實驗設(shè)計: : 1)1)收集收集2020份病人樣本份病人樣本, ,其濃度分布整個線性范圍其濃度分布整個線性范圍, ,不使不使 用超出線性范圍的標(biāo)本用超出線性范圍的標(biāo)本 2)2)在在3-43-4天時間內(nèi)天時間內(nèi), ,每天用實驗和比對方法測定每天用實驗和比對方法測定5-75-7份樣份樣 本

11、本 3)3)每天做室內(nèi)質(zhì)控每天做室內(nèi)質(zhì)控, ,如果失控如果失控, ,剔除剔除, ,問題糾正后重新測問題糾正后重新測 定該批標(biāo)本定該批標(biāo)本 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價15 實驗數(shù)據(jù)處理 計算每個標(biāo)本兩種方法間結(jié)果的差異計算每個標(biāo)本兩種方法間結(jié)果的差異 偏倚偏倚bi bi= =實驗方法結(jié)果 實驗方法結(jié)果i i- -比較方法結(jié)果比較方法結(jié)果i i 偏倚偏倚%=100%(%=100%(實驗方法結(jié)果實驗方法結(jié)果i i- -比較方法結(jié)果比較方法結(jié)果i i)/)/比較方法結(jié)果比較方法結(jié)果I I 畫出每個標(biāo)本兩種方法結(jié)果的偏倚或百分比偏倚圖畫出每個標(biāo)本兩種方法結(jié)果的偏倚或百分比偏倚圖, ,

12、比較兩種方比較兩種方 法間在檢測的濃度范圍內(nèi)標(biāo)本結(jié)果差異是否一致法間在檢測的濃度范圍內(nèi)標(biāo)本結(jié)果差異是否一致 計算兩種方法間的平均偏倚計算兩種方法間的平均偏倚 計算偏倚或百分比偏倚的標(biāo)準(zhǔn)差計算偏倚或百分比偏倚的標(biāo)準(zhǔn)差 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價16 結(jié)果判斷 如果偏倚如果偏倚 廠家指標(biāo)廠家指標(biāo)( (實驗室指標(biāo)實驗室指標(biāo)),),則通過計算驗證值則通過計算驗證值 進行差異的顯著性檢驗進行差異的顯著性檢驗, , 在驗證限范圍內(nèi)在驗證限范圍內(nèi), ,驗證通過驗證通過 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價17 選擇廠家申明中使用的比較方法為本方案的比較方法選擇廠家申明中使用的比

13、較方法為本方案的比較方法 如如兩種方法在檢測的濃度范圍內(nèi)標(biāo)本結(jié)果差異不一致兩種方法在檢測的濃度范圍內(nèi)標(biāo)本結(jié)果差異不一致, , 應(yīng)參考應(yīng)參考EP9-A2EP9-A2文件文件( (用病人標(biāo)本進行方法學(xué)比對和偏倚用病人標(biāo)本進行方法學(xué)比對和偏倚 評估評估) )來進行實驗來進行實驗 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價18 使用參考物質(zhì)的正確度方案 參考物質(zhì)參考物質(zhì) 1) 1)新鮮冰凍人血清或其他一些未摻入成分的人體物質(zhì)新鮮冰凍人血清或其他一些未摻入成分的人體物質(zhì): : 已用參考方法或決定性方法定值已用參考方法或決定性方法定值 2)2)從能力比對實驗中獲得的參考物從能力比對實驗中獲得的參考物

14、3)3)廠家提供的正確度確認(rèn)物或質(zhì)控物廠家提供的正確度確認(rèn)物或質(zhì)控物 4)4)實驗室室間質(zhì)評物被眾多的實驗室分析實驗室室間質(zhì)評物被眾多的實驗室分析, ,他們的均值他們的均值 可用于評估一致性可用于評估一致性 5)5)由第三方提供的已用一些不同方法定值的物質(zhì)由第三方提供的已用一些不同方法定值的物質(zhì) PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價19 實驗步驟 至少至少2 2個物質(zhì)個物質(zhì), ,濃度為可報告范圍中高和低的測量范圍濃度為可報告范圍中高和低的測量范圍 在在3-53-5天內(nèi)每天測定一次天內(nèi)每天測定一次, ,每次重復(fù)每次重復(fù)2 2次次 將結(jié)果與設(shè)定要求進行比較將結(jié)果與設(shè)定要求進行比較, ,比

15、如與能力比對實驗組織比如與能力比對實驗組織 者的接受標(biāo)準(zhǔn)或醫(yī)學(xué)允許總誤差來比較者的接受標(biāo)準(zhǔn)或醫(yī)學(xué)允許總誤差來比較 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價20 定量檢出限的驗證(EP17-A) PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價21 概念 能可靠檢出分析物的最低實際濃度能可靠檢出分析物的最低實際濃度, ,并在該濃度下的總并在該濃度下的總 誤差符合準(zhǔn)確度要求誤差符合準(zhǔn)確度要求 總誤差目標(biāo)來源總誤差目標(biāo)來源: :實驗室的需求、室間質(zhì)評結(jié)果、廠家實驗室的需求、室間質(zhì)評結(jié)果、廠家 的申明的申明 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價22 實驗樣本 低濃度參考物質(zhì)低濃度參考物質(zhì)

16、 已知濃度或活性的樣品適當(dāng)稀釋成已知濃度或活性的樣品適當(dāng)稀釋成3-5個低濃度實驗樣個低濃度實驗樣 品品 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價23 實驗步驟 至少至少2525個重復(fù)測量個重復(fù)測量 每個樣品重復(fù)測量的結(jié)果與該樣品的參考值比較每個樣品重復(fù)測量的結(jié)果與該樣品的參考值比較, ,以確以確 定是否超出目標(biāo)誤差定是否超出目標(biāo)誤差, ,超過誤差目標(biāo)的結(jié)果數(shù)量可用于超過誤差目標(biāo)的結(jié)果數(shù)量可用于 評價此方法在該濃度是否合適評價此方法在該濃度是否合適. . PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價24 20-1000個檢測值符合超出LoB預(yù)期95%比例 的下限 檢測數(shù)檢測數(shù) 觀察比例的

17、下限觀察比例的下限(%)(%)檢測數(shù)檢測數(shù) 觀察比例的下限觀察比例的下限(%(%） 20 8520 85 30 8730 87 40 8840 88 50 8850 88 60 8860 88 70 8970 89 80 8980 89 90 9090 90 100 90 100 90 150 91150 91 200 92200 92 250 92250 92 300 92300 92 400 93400 93 500 93500 93 1000 941000 94 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價25 分析測量范圍:概念 分析測量范圍分析測量范圍( (線性范圍線性范圍):):

18、指患者樣本未經(jīng)任何處理指患者樣本未經(jīng)任何處理 ( (稀釋、濃縮或其他預(yù)處理稀釋、濃縮或其他預(yù)處理),),由檢測系統(tǒng)直接測量得到由檢測系統(tǒng)直接測量得到 的可靠結(jié)果范圍的可靠結(jié)果范圍, ,在此范圍內(nèi)一系列不同樣本分析物的在此范圍內(nèi)一系列不同樣本分析物的 測量值與其實際濃度測量值與其實際濃度( (真值真值) )呈線性比例關(guān)系呈線性比例關(guān)系. . 臨床可報告范圍臨床可報告范圍: :指定量檢測項目向臨床能報告的檢測指定量檢測項目向臨床能報告的檢測 范圍范圍, ,患者樣本可經(jīng)稀釋、濃縮或其他預(yù)處理患者樣本可經(jīng)稀釋、濃縮或其他預(yù)處理. . 線性線性: :檢測樣本時檢測樣本時, ,在一定范圍內(nèi)可以直接按比例關(guān)

19、系在一定范圍內(nèi)可以直接按比例關(guān)系 得出分析物含量的能力得出分析物含量的能力. . PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價26 實驗樣品準(zhǔn)備 選擇與臨床樣本同樣的基質(zhì)選擇與臨床樣本同樣的基質(zhì), ,不含干擾物質(zhì)不含干擾物質(zhì); ; 或廠家推薦的產(chǎn)品或廠家推薦的產(chǎn)品 數(shù)量數(shù)量 驗證實驗驗證實驗:5-7:5-7個不同濃度的樣本個不同濃度的樣本, ,高值樣本應(yīng)高于高值樣本應(yīng)高于 線性上限線性上限30%,30%,低值樣本低于線性下限低值樣本低于線性下限, , PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價27 實驗方法 上限的高值樣本按一定比例稀釋為至少上限的高值樣本按一定比例稀釋為至少5 5種濃度

20、種濃度, ,按試按試 劑說明書操作劑說明書操作, ,將每一濃度樣本重復(fù)檢測將每一濃度樣本重復(fù)檢測2 2次次, ,計算線性計算線性 相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù) PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價28 結(jié)果判斷 線性范圍應(yīng)符合制造商規(guī)定的要求線性范圍應(yīng)符合制造商規(guī)定的要求, ,且線性相且線性相 關(guān)系數(shù)關(guān)系數(shù)|r|0.97|r|0.97 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價29 定性檢測項目的性能驗證 PCR檢測方法分析性能評價檢測方法分析性能評價30 兩種方法 診斷明確的定性檢測性能評估診斷明確的定性檢測性能評估: :靈敏度、特異性靈敏度、特異性 診斷不明確的定性檢測性能評估診斷不明確的定性檢測性能評估: :結(jié)果的一致