分子生物學技術在病理學中的應用

1、醫(yī)學1 第三章第三章 分子生物學技術分子生物學技術 在病理學中的應在病理學中的應 用用 醫(yī)學2 第一節(jié)第一節(jié) 原位分子雜交技術原位分子雜交技術 ( in situ hybridization ，ISH ) 醫(yī)學3 核酸分子雜交概述核酸分子雜交概述 檢測核酸分子間序列同源性的一種檢測核酸分子間序列同源性的一種 技術，主要根據(jù)核酸堿基互補的原技術，主要根據(jù)核酸堿基互補的原 則（則（C-G、A-T、A-U）,用已知順序用已知順序 的核酸片段的核酸片段(DNA或或RNA)作為探針，作為探針， 經特殊標記后，與提純的或組織、經特殊標記后，與提純的或組織、 細胞中的靶核酸進行雜交，對其進細胞中的靶核酸進行

2、雜交，對其進 行檢測。行檢測。 核酸分子雜交可以在核酸分子雜交可以在DNA-RNA、 RNA-RNA、DNA-DNA之間進行。之間進行。 醫(yī)學4 雜交類型雜交類型 按其作用方式大致分為固相雜交和按其作用方式大致分為固相雜交和 液相雜交兩種。液相雜交兩種。 液相雜交技術是指參加反應的兩條液相雜交技術是指參加反應的兩條 核酸鏈都游離在溶液；包括吸附雜核酸鏈都游離在溶液；包括吸附雜 交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交 和復性速率液相分子雜交等和復性速率液相分子雜交等 。 醫(yī)學5 固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈固定固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈固定 在固體的支持物上（常用

3、的有硝酸纖維素在固體的支持物上（常用的有硝酸纖維素 濾膜，其它如尼龍膜等），另一條參加反濾膜，其它如尼龍膜等），另一條參加反 應的核酸鏈游離在溶液中。應的核酸鏈游離在溶液中。 固相雜交有菌落原位雜交（固相雜交有菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點雜交法（）、斑點雜交法（Dot blot）、）、 Southern印跡雜交（印跡雜交（Southern blot）、）、 Northern印跡雜交（印跡雜交（Northern blot）和組）和組 織原位雜交（織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學技），即原位

4、雜交組織化學技 術和原位雜交免疫細胞化學技術。術和原位雜交免疫細胞化學技術。 醫(yī)學6 原位分子雜交原位分子雜交技術技術 （In situ hybridization, ISH) 簡稱原位雜交，簡稱原位雜交，指應用已知堿基順指應用已知堿基順 序并帶有標記物的核酸探針與組織、序并帶有標記物的核酸探針與組織、 細胞中待檢測的核酸按堿基配對的細胞中待檢測的核酸按堿基配對的 原則進行特異性結合而形成雜交體，原則進行特異性結合而形成雜交體， 然后再應用與標記物相應的檢測系然后再應用與標記物相應的檢測系 統(tǒng)，通過組化或免疫組化的方法在統(tǒng)，通過組化或免疫組化的方法在 被測的核酸原位形成帶顏色的雜交被測的核酸原

5、位形成帶顏色的雜交 信號，在顯微鏡或電鏡下顯示出目信號，在顯微鏡或電鏡下顯示出目 的的DNA或或RNA在細胞內定位。在細胞內定位。 醫(yī)學7 可以在組織的石蠟切片、冰凍切片、可以在組織的石蠟切片、冰凍切片、 細胞印片、涂片上進行雜交，因此細胞印片、涂片上進行雜交，因此 能結合病理形態(tài)的變化，檢出細胞能結合病理形態(tài)的變化，檢出細胞 或組織中或組織中200-300拷貝以上的核酸序拷貝以上的核酸序 列。列。 屬于固相核酸分子雜交的范疇屬于固相核酸分子雜交的范疇 醫(yī)學8 區(qū)別：菌落雜交系細菌裂解釋放出區(qū)別：菌落雜交系細菌裂解釋放出 DNA，然后進行雜交；，然后進行雜交；Southern印印 跡雜交法是以

6、鑒定跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定中某一特定 的基因片段，而的基因片段，而Northern印跡雜交印跡雜交 法是用以檢測某一特定的法是用以檢測某一特定的RNA片段片段 的。它們都只能證明該病原體、細的。它們都只能證明該病原體、細 胞或組織中是否存在待測的核酸而胞或組織中是否存在待測的核酸而 不能證明該核酸分子在細胞或組織不能證明該核酸分子在細胞或組織 中存在的部位。中存在的部位。 醫(yī)學9 基本方法基本方法 雜交前準備，包括固定、取材、玻片和雜交前準備，包括固定、取材、玻片和 組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、 減低背景染色等；減低背景染色等； 雜交；

7、雜交； 雜交后處理；雜交后處理； 顯示：包括放射性自顯影和非放射性標顯示：包括放射性自顯影和非放射性標 記的顯色記的顯色 ； 對照實驗和結果的判斷對照實驗和結果的判斷 醫(yī)學10 組織固定組織固定 目的：形態(tài)結構；保存細胞內的目的：形態(tài)結構；保存細胞內的DNA， RNA的水平；探針易于進入的水平；探針易于進入 DNA穩(wěn)定，穩(wěn)定，mRNA相對穩(wěn)定，而相對穩(wěn)定，而RNA則則 易被酶等降解；易被酶等降解； 石蠟包埋切片由于與蛋白質交叉連接的增石蠟包埋切片由于與蛋白質交叉連接的增 加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號 常低于冰凍切片。常低于冰凍切片。 醫(yī)學11 常用固

8、定劑常用固定劑 1. 4%多聚甲醛磷酸緩沖液多聚甲醛磷酸緩沖液 最常用，不與最常用，不與 蛋白質產生廣泛交聯(lián)，不會影響探針穿透蛋白質產生廣泛交聯(lián)，不會影響探針穿透 入組織或細胞，較好的保留入組織或細胞，較好的保留RNA； 2. 3:1乙醇冰醋酸乙醇冰醋酸 增加探針的穿透性，但增加探針的穿透性，但 不能最大限度保存不能最大限度保存RNA，對組織有，對組織有損傷；損傷； 3. 戊二醛戊二醛 較好保存較好保存RNA和組織形態(tài)，但和組織形態(tài)，但 與蛋白質產生廣泛交聯(lián)，影響探針的穿透與蛋白質產生廣泛交聯(lián)，影響探針的穿透 性；性； 醫(yī)學12 玻片和組織切片的處理玻片和組織切片的處理 蓋片和載片應用熱肥皂刷

9、洗，自來水清洗蓋片和載片應用熱肥皂刷洗，自來水清洗 干凈后，置于清潔液中浸泡干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗，清水洗 凈烘干，凈烘干，95%酒精中浸泡酒精中浸泡24h后蒸餾水沖后蒸餾水沖 洗、烘干，烘箱溫度最好在洗、烘干，烘箱溫度最好在150或以上或以上 過夜以去除任何過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條酶。蓋玻片在有條 件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存 放放 。 粘附劑涂抹玻片粘附劑涂抹玻片 醫(yī)學13 增強組織的通透性和核酸探針的增強組織的通透性和核酸探針的 穿透性穿透性 常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑

10、或稱清洗劑或稱清洗劑Triton X-100或某些消化酶如或某些消化酶如 蛋白酶蛋白酶K、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉 酶等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強酶等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強 組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高 雜交信號，但會減低雜交信號，但會減低RNA的保存量和影的保存量和影 響組織結構的形態(tài)，在用量及孵育時間上響組織結構的形態(tài)，在用量及孵育時間上 應慎為掌握。應慎為掌握。 醫(yī)學14 減低背景染色減低背景染色 雜交后（雜交后（Posthybridization ）的酶處理和）的酶處理和 雜交后的洗滌均有助于減低

11、背景染色。雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預雜交（預雜交（Prehybridization）是減低背景）是減低背景 染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液 的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖將的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖將 組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特 異性雜交點的目的，從而減低背景染色。異性雜交點的目的，從而減低背景染色。 減低殘留的內源性的減低殘留的內源性的RNA 醫(yī)學15 防止防止RNA酶的污染酶的污染 手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有 RNA酶，為防止其污染影

12、響實驗結果，酶，為防止其污染影響實驗結果， 在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。 所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前 一日置高溫（一日置高溫（240，最低溫度必須在，最低溫度必須在 150左右）烘烤以達到消除左右）烘烤以達到消除RNA酶的目酶的目 的。的。 雜交前及雜交時所應用的溶液均需經高壓雜交前及雜交時所應用的溶液均需經高壓 消毒處理。消毒處理。 醫(yī)學16 核酸分子雜交探針核酸分子雜交探針 分子雜交是核酸鏈間依堿基配對分子雜交是核酸鏈間依堿基配對 規(guī)則的一種結合方式，是核酸的規(guī)則的一種結合方式，是核酸的 重要理化特性

13、，利用分子雜交特重要理化特性，利用分子雜交特 性來對特定核酸序列進行檢測，性來對特定核酸序列進行檢測， 必須將雜交鏈中的一條用某種可必須將雜交鏈中的一條用某種可 以檢測的分子進行標記，這條鏈以檢測的分子進行標記，這條鏈 稱為核酸探針。稱為核酸探針。 醫(yī)學17 核酸探針的類型核酸探針的類型 根據(jù)標記方法可分為放射性和非放根據(jù)標記方法可分為放射性和非放 射性兩類。射性兩類。 放射性者有污染，顯影時間長等；放射性者有污染，顯影時間長等； 非同位素標記，常用的有生物素、非同位素標記，常用的有生物素、 地高辛、地高辛、5-BrdU(嗅脫氧尿嘧啶核苷嗅脫氧尿嘧啶核苷)、 熒光素等。熒光素等。 非同位素標記

14、操作方便，標記好的非同位素標記操作方便，標記好的 探針可以長期保存，隨時取用，且探針可以長期保存，隨時取用，且 實驗時間短，結果可在光鏡下觀察。實驗時間短，結果可在光鏡下觀察。 醫(yī)學18 醫(yī)學19 根據(jù)探針的核酸性質不同可分為根據(jù)探針的核酸性質不同可分為 DNA探針（單鏈探針（單鏈DNA和雙鏈和雙鏈 DNA ） 、RNA探針、探針、cDNA探針、探針、 cRNA探針和寡核苷酸探針等。探針和寡核苷酸探針等。 cDNA （complementary DNA）探）探 針：以針：以RNA為模板，經逆轉錄酶催為模板，經逆轉錄酶催 化按照化按照RNA的核苷酸順序合成的核苷酸順序合成DNA， 這一途徑與一般

15、遺傳信息的方向相這一途徑與一般遺傳信息的方向相 反，故稱逆轉錄。反，故稱逆轉錄。cDNA是指互補是指互補 于于mRNA的的DNA分子。分子。 醫(yī)學20 醫(yī)學21 醫(yī)學22 寡核苷酸探針寡核苷酸探針 近年應用較多的寡核苷酸探針，常為近年應用較多的寡核苷酸探針，常為20- 30個堿基，分子量小，有利于探針進入個堿基，分子量小，有利于探針進入 細胞內，無須采取提高細胞通透性的措施。細胞內，無須采取提高細胞通透性的措施。 非克隆性非克隆性DNA探針，探針，在無在無cDNA的情況下，的情況下， 可根據(jù)已知文獻發(fā)表的共同序列可根據(jù)已知文獻發(fā)表的共同序列由由DNA 合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成儀依照

16、所需雜交的靶核苷酸序列人工人工 合成合成。 醫(yī)學23 寡核苷酸探針寡核苷酸探針 制造方便，價格低廉，也可進行放制造方便，價格低廉，也可進行放 射性與非放射性標記射性與非放射性標記 特異性不如克隆性探針強，亦不如特異性不如克隆性探針強，亦不如 其雜交信號高其雜交信號高 醫(yī)學24 成套成套ISH試劑盒試劑盒 病毒系列病毒系列(EBV、HBV、HCV、HPV 等等) 癌基因系列（癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、 nm23、P16、P21等）等） 細胞因子系列細胞因子系列(EGF、bEGF ) 醫(yī)學25 原位分子雜交實驗步驟：原位分子雜交實驗步驟： （1）切片脫蠟入水（冰凍切片先用）切片脫蠟

17、入水（冰凍切片先用 多聚甲醛固定）；（多聚甲醛固定）；（2）PBS（0.1M） 洗滌，洗滌，5分鐘分鐘1次（次（RNA雜交用雜交用 DEPC水洗滌）；（水洗滌）；（3）0.1N HCL， 10分鐘；（分鐘；（4）PBS洗滌洗滌3分鐘分鐘2次；次； （5）蛋白酶）蛋白酶K消化：（消化：（6）-（7）- - 醫(yī)學26 雜交后處理雜交后處理 包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的 漂洗。漂洗。 RNA探針雜交時產生的背景染色特別高，探針雜交時產生的背景染色特別高， 但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染 色，獲得較好的反差效果。在雜

18、交后漂洗色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗 中的中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基酶液洗滌能將組織切片中非堿基 配對配對RNA除去。除去。 一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到 低而溫度由低到高。低而溫度由低到高。 切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的 溶液漂洗也很難減少非特異性結合，從而溶液漂洗也很難減少非特異性結合，從而 增強了背景染色。增強了背景染色。 醫(yī)學27 顯示顯示 又稱檢測系統(tǒng)。又稱檢測系統(tǒng)。 根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進 行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行放射自顯影或利用

19、酶檢測系統(tǒng)進 行不同顯色處理。行不同顯色處理。 醫(yī)學28 對照實驗和結果的判斷對照實驗和結果的判斷 常用的對照試驗有下列幾種。常用的對照試驗有下列幾種。 （1 1）將）將cDNAcDNA或或cRNAcRNA探針進行預雜交探針進行預雜交( (吸吸 收試驗收試驗) )。 （2 2）與非特異性）與非特異性( (載體載體) )序列和不相關探針序列和不相關探針 雜交雜交( (置換試驗置換試驗) )。 （3 3）將切片應用）將切片應用RNARNA酶或酶或DNADNA酶進行須酶進行須 處理后雜交。應用同義處理后雜交。應用同義RNARNA探針進行雜交。探針進行雜交。 （4 4）以不加核酸探針雜交液進行雜交）以

20、不加核酸探針雜交液進行雜交( (空空 白試驗白試驗) )。 （5 5）組織對照用已知確定為陽性或陰性組）組織對照用已知確定為陽性或陰性組 織進行雜交對照。織進行雜交對照。 （6 6）應用未標記探針做雜交進行對照。）應用未標記探針做雜交進行對照。 醫(yī)學29 熒光原位雜交熒光原位雜交 熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在是在20世紀世紀80 年代末在放射性原位雜交技術的基年代末在放射性原位雜交技術的基 礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子 細胞遺傳技術細胞遺傳技術,以熒光標記取代同位以熒光標記取代同

21、位 素標記而形成的一種新的原位雜交素標記而形成的一種新的原位雜交 方法方法,探針首先與某種介導分子探針首先與某種介導分子 (reporter molecule)結合結合,雜交后再雜交后再 通過免疫細胞化學過程連接上熒光通過免疫細胞化學過程連接上熒光 染料染料. 醫(yī)學30 FISH的基本原理是將的基本原理是將DNA(或或RNA)探針用探針用 特殊的核苷酸分子標記特殊的核苷酸分子標記,然后將探針直接雜然后將探針直接雜 交到交到DNA切片上切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的再用與熒光素分子偶聯(lián)的 單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測 DNA序列，可對序列，可對DNA定

22、性、定位、相對定定性、定位、相對定 量分析量分析. FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能具有安全、快速、靈敏度高、探針能 長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點,不不 但能顯示中期分裂相但能顯示中期分裂相,還能顯示于間期核還能顯示于間期核. 同時在熒光原位雜交基礎上又發(fā)展了多彩同時在熒光原位雜交基礎上又發(fā)展了多彩 色熒光原位雜交技術。色熒光原位雜交技術。 缺點：方法費時、價格昂貴，所需設備復缺點：方法費時、價格昂貴，所需設備復 雜并需特殊的照相機記錄暫時的信號及不雜并需特殊的照相機記錄暫時的信號及不 能觀察組織形態(tài)學等。能觀察組織形態(tài)學等。 醫(yī)學31 CISH

23、 顯色原位雜交法（顯色原位雜交法（Chromogenic in situ hybridization，CISH） 2000年年Tanner首次報道了采用首次報道了采用CISH 法檢測法檢測HER2基因擴增的可行性基因擴增的可行性,研究顯研究顯 示示CISH與與FISH具有極強的一致性。具有極強的一致性。 高度特異性的地高辛標記探針進行原高度特異性的地高辛標記探針進行原 位雜交，傳統(tǒng)的過氧化物酶顯色反應位雜交，傳統(tǒng)的過氧化物酶顯色反應 染片過程，在普通光學顯微鏡下定量染片過程，在普通光學顯微鏡下定量 檢測基因的擴增，操作簡單，價格遠檢測基因的擴增，操作簡單，價格遠 較較FISH低廉，且信號穩(wěn)定，

24、組織切片低廉，且信號穩(wěn)定，組織切片 儲藏方便，并可做組織學評價。儲藏方便，并可做組織學評價。 醫(yī)學32 原位雜交的應用簡介原位雜交的應用簡介: 特異性高；可以精確定位；能在成特異性高；可以精確定位；能在成 分復雜的組織中進行單一細胞的研分復雜的組織中進行單一細胞的研 究；不需要從組織中提取核酸，對究；不需要從組織中提取核酸，對 于組織中含量極低的靶序列有極高于組織中含量極低的靶序列有極高 的敏感性；可完整地保持組織與細的敏感性；可完整地保持組織與細 胞的形態(tài)。胞的形態(tài)。 由定性進入定量，應用也更加廣泛由定性進入定量，應用也更加廣泛 。 醫(yī)學33 應用應用 基礎研究：如基因組團基礎研究：如基因組

25、團(Gene mapping)，轉基因檢測，基因表達，轉基因檢測，基因表達 定位，核定位，核DNA和和mRNA的排列和運的排列和運 輸、復制和細胞的分類等；輸、復制和細胞的分類等； 臨床研究：如細胞遺傳學，產前診臨床研究：如細胞遺傳學，產前診 斷，腫瘤和傳染性疾病的診斷，生斷，腫瘤和傳染性疾病的診斷，生 物學劑量測定和病毒學的病原學診物學劑量測定和病毒學的病原學診 斷等。斷等。 醫(yī)學34 (1)在腫瘤研究中的應用在腫瘤研究中的應用: （A）.檢測腫瘤組織中癌基因，抗癌基因檢測腫瘤組織中癌基因，抗癌基因 的表達的表達,以判斷預后。如發(fā)現(xiàn)原癌基因以判斷預后。如發(fā)現(xiàn)原癌基因C- myc在在Burki

26、tt 淋巴瘤淋巴瘤,大腸癌，小細胞肺大腸癌，小細胞肺 癌中有擴增；癌中有擴增；CerbB-2的擴增與乳癌淋巴的擴增與乳癌淋巴 結轉移呈正相關。結轉移呈正相關。 醫(yī)學35 （B）檢測腫瘤標志物）檢測腫瘤標志物mRNA,對腫瘤的早對腫瘤的早 期診斷及治療有重要的意義。如檢測人肝期診斷及治療有重要的意義。如檢測人肝 臟和癌旁肝細胞中臟和癌旁肝細胞中AFPmRNA，在肝癌細，在肝癌細 胞及癌旁組織均發(fā)現(xiàn)了胞及癌旁組織均發(fā)現(xiàn)了AFPmRNA,但癌但癌 組織中組織中AFPmRNA陽性較均一陽性較均一,而癌旁肝而癌旁肝 中中AFPmRNA陽性呈散在分布陽性呈散在分布. 醫(yī)學36 醫(yī)學37 (2)組織、細胞中

27、病毒組織、細胞中病毒DNA或或RNA 的檢測的檢測 在淋巴瘤細胞及鼻咽癌細胞中發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤細胞及鼻咽癌細胞中發(fā)現(xiàn) E B V ， 在 肝 炎 、 肝 癌 細 胞 找 到， 在 肝 炎 、 肝 癌 細 胞 找 到 HBVDNA，尤其是在原發(fā)性肝癌中，尤其是在原發(fā)性肝癌中 其整合率可達其整合率可達90%; 粥樣硬化的主動脈內發(fā)現(xiàn)了單純皰粥樣硬化的主動脈內發(fā)現(xiàn)了單純皰 疹病毒；疹病毒； 檢測細菌，瘧原蟲等的核酸序列。檢測細菌，瘧原蟲等的核酸序列。 醫(yī)學38 醫(yī)學39 醫(yī)學40 醫(yī)學41 (3)細胞的生物合成細胞的生物合成 及遺傳疾病研究中的應用及遺傳疾病研究中的應用 組織，細胞內組織，細胞內mRNA

28、可以反映組織合成某可以反映組織合成某 種蛋白質或多肽的能力，其敏感性要比直種蛋白質或多肽的能力，其敏感性要比直 接測定蛋白質高接測定蛋白質高1000倍，以倍，以cDNA作為探作為探 針的針的ISH結合免疫組化技術，可以了解單結合免疫組化技術，可以了解單 個細胞內個細胞內mRNA的翻譯水平，即蛋白質合的翻譯水平，即蛋白質合 成能力，從而了解組織器官的代謝和功能成能力，從而了解組織器官的代謝和功能 狀態(tài)，以及器官組織內不同細胞的功能差狀態(tài)，以及器官組織內不同細胞的功能差 異，并能同時進行形態(tài)學觀察。異，并能同時進行形態(tài)學觀察。 醫(yī)學42 醫(yī)學43 第二節(jié)第二節(jié) 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應 (poly

29、merase chain reaction ， PCR) 醫(yī)學44 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。 特異、敏感、產率高、特異、敏感、產率高、 快速、快速、 簡便、重簡便、重 復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個 試管內將所要研究的目的基因或某一試管內將所要研究的目的基因或某一DNA 片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使使 肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛

30、發(fā)、 一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的 DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾 星期才能做到的事情，用星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可幾小時便可 完成。完成。 PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性 創(chuàng)舉和里程碑。創(chuàng)舉和里程碑。 醫(yī)學45 Korana于于1971年最早提出核酸體外擴增的年最早提出核酸體外擴增的 設想設想 1985年美國年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室公司人類遺傳研究室 的的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合 酶鏈反應。酶鏈反應。

31、 1993年年Mullis獲得了諾貝爾化獲得了諾貝爾化 學獎學獎. . Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 I 的的Klenow片段片段;1988年初，年初， Keohanog改用改用T4 DNA聚合酶進行聚合酶進行PCR; 1988年年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜等從溫泉中分離的一株水生嗜 熱桿菌熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種中提取到一種 耐熱耐熱DNA聚合酶。聚合酶。 PCR技術簡史技術簡史 醫(yī)學46 PCR原理原理 PCR實際上是以實際上是以DNA為模板，在引物和為模板，在引物和 4種核苷酸存

32、在的條件下，在種核苷酸存在的條件下，在DNA聚合酶聚合酶 作用下出現(xiàn)的酶促合成反應。作用下出現(xiàn)的酶促合成反應。 PCR最重要的組分是引物，是根據(jù)模板最重要的組分是引物，是根據(jù)模板 DNA的序列設計合成的兩條的序列設計合成的兩條20個核苷酸個核苷酸 左右的寡核苷酸鏈，這兩個引物分別特異左右的寡核苷酸鏈，這兩個引物分別特異 性結合在模板性結合在模板DNA二條鏈的兩側（二條鏈的兩側（3 端）。端）。 醫(yī)學47 反應體系：反應體系：DNA模板，一種引物，四種模板，一種引物，四種 三磷酸核苷，三磷酸核苷，TaqDNA聚合酶及含聚合酶及含 MgCL2的緩沖液。的緩沖液。 醫(yī)學48 循環(huán)循環(huán) （1）變性）變

33、性(denaturation)：在：在95 左右，左右， 常規(guī)采用常規(guī)采用94，30秒秒-1分鐘，在高溫條件分鐘，在高溫條件 下使模板下使模板DNA解鏈為單鏈模板；解鏈為單鏈模板； （2）退火）退火(annealing)：在較低溫度下，：在較低溫度下， 引物特異地結合到引物特異地結合到DNA模板上，溫度在模板上，溫度在55 左右，時間左右，時間30秒秒-1分鐘；分鐘； （3）延伸）延伸(extension)：在：在72 條件下，條件下， DNA聚合酶根據(jù)模板的序列，在引物的聚合酶根據(jù)模板的序列，在引物的3 端新合成的互補鏈不斷延伸。根據(jù)模板的端新合成的互補鏈不斷延伸。根據(jù)模板的 長度，延伸時間

34、一般長度，延伸時間一般1-2分鐘。分鐘。 醫(yī)學49 醫(yī)學50 醫(yī)學51 醫(yī)學52 PCR的反應動力學的反應動力學 PCR反復進行，使反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。擴增量呈指數(shù)上升。 反應最終的反應最終的DNA 擴增量可用擴增量可用Y(1X)n 計算。計算。Y代表代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，片段擴增后的拷貝數(shù)， X表示平均每次的擴增效率，表示平均每次的擴增效率，n代表循環(huán)代表循環(huán) 次數(shù)。次數(shù)。 平均擴增效率的理論值為平均擴增效率的理論值為100%，反應初，反應初 期，靶序列期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，片段的增加呈指數(shù)形式， 隨著隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的產物的逐漸積累，

35、被擴增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期 或靜止期，即出現(xiàn)或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應停滯效應”，這種效應，這種效應 稱平臺期。稱平臺期。 醫(yī)學53 PCR擴增產物擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩可分為長產物片段和短產物片段兩 部分。部分。 短產物片段的長度嚴格地限定在兩短產物片段的長度嚴格地限定在兩 個引物鏈個引物鏈5端之間，是需要擴增的特端之間，是需要擴增的特 定片段定片段 短產物片段和長產物片段是由于引短產物片段和長產物片段是由于引 物所結合的模板不一樣而形成的物所結合的模板不一樣而形成的 醫(yī)學54 分析與鑒定分析與鑒定 PCR產物的

36、分析，可依據(jù)研究對象產物的分析，可依據(jù)研究對象 和目的不同而采用不同的分析方法。和目的不同而采用不同的分析方法。 常用方法如凝膠電泳分析、瓊脂糖常用方法如凝膠電泳分析、瓊脂糖 凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、 酶切分析、分子雜交（酶切分析、分子雜交（Southern印印 跡雜交、斑點雜交）、核酸序列分跡雜交、斑點雜交）、核酸序列分 析等。析等。 醫(yī)學55 PCR反應體系與反應條件 （一）、標準的（一）、標準的PCR反應體系：反應體系： 10擴增緩沖液擴增緩沖液 10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 各各10-100pmol 模板模板

37、DNA 0.1-2ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul 醫(yī)學56 PCR反應五要素：反應五要素： 引物引物:PCR特異性反應的關鍵，特異性反應的關鍵，PCR 產物產物 的特異性取決于引物與模板的特異性取決于引物與模板DNA互補的互補的 程度。程度。 酶及濃度酶及濃度:濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過高可引起非特異性擴增， 濃度過低則合成產物量減少。濃度過低則合成產物量減少。 dNTP: dNTP的質量與濃度和的質量與濃度和PCR擴增效擴增效 率有密切關系，率有密切關系， 模板模板:模板核酸的量與純化程度，是模板核酸

38、的量與純化程度，是PCR 成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一 . Mg2+ :Mg2+對對PCR擴增的特異性和產量擴增的特異性和產量 有顯著的影響有顯著的影響 醫(yī)學57 PCR常見類型 1逆轉錄逆轉錄PCR(RT-PCR)： RNA經逆轉經逆轉 錄后可作為錄后可作為PCR的模板的模板.,用來擴增用來擴增RNA。 2競爭逆轉錄競爭逆轉錄PCR( C-RT-PCR) ：低豐：低豐 度度RNA定量的好方法。定量的好方法。 3多重多重PCR（multiples PCR）：在同）：在同 一一PCR體系中加入多對引物可用于基本體系中加入多對引物可用于基本 長度很長，發(fā)生多處缺失的檢測。擴增同長度

39、很長，發(fā)生多處缺失的檢測。擴增同 一模板的幾個區(qū)域。一模板的幾個區(qū)域。 4多種多種PCR：可同時加入多套以生物素：可同時加入多套以生物素 標記的引物標記的引物PCR反應。反應。 醫(yī)學58 5反向反向PCR（iverse polymerase chain reaction）：對一個已知的）：對一個已知的DNA片段兩片段兩 側的未知序列進行擴增和研究。側的未知序列進行擴增和研究。 6不對稱不對稱PCR:在在PCR反應體系中，限制反應體系中，限制 引物之一的濃度（引物之一的濃度（50100:1）進行擴增，）進行擴增， 可得到單鏈可得到單鏈PCR產物產物,可用于制備單鏈測可用于制備單鏈測 序模板或單鏈

40、序模板或單鏈DNA雜交探針。雜交探針。 7錨定錨定PCR（anchored polymerase chain reaction） 8著色互補試驗或熒光著色互補試驗或熒光PCR 9雙溫雙溫PCR（two-temperature PCR） 醫(yī)學59 PCR技術的應用技術的應用 研究：基因克?。谎芯浚夯蚩寺?；DNA測序；分析突變；基因重測序；分析突變；基因重 組與融合；鑒定與調控蛋白質結組與融合；鑒定與調控蛋白質結 合合DNA序列；轉序列；轉 座子插入位點的繪圖；檢測基因的修飾；合成基座子插入位點的繪圖；檢測基因的修飾；合成基 因的構建；構建克隆因的構建；構建克隆 或表達載體；檢測某基因的或表達載

41、體；檢測某基因的 內切酶多態(tài)性內切酶多態(tài)性 診斷：細菌診斷：細菌(螺旋體、支原體、衣原體、分支桿菌、螺旋體、支原體、衣原體、分支桿菌、 立克次氏體、白喉桿菌、致立克次氏體、白喉桿菌、致 病大腸桿菌、痢疾桿病大腸桿菌、痢疾桿 菌等菌等)；病毒；病毒(HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、 CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、輪狀病毒、細小，麻疹病毒、輪狀病毒、細小 病毒病毒B19)；寄生蟲；寄生蟲(瘧疾瘧疾 等等)；人遺傳病；人遺傳病(地貧、血地貧、血 友病等友病等) 免疫學：免疫學：HLA分裂；分裂；T細胞受體或抗體多樣化的定細胞受體或抗體多樣化的定 性；自身免疫病基因作圖；淋性；自身免疫

42、病基因作圖；淋 巴因子定量巴因子定量 醫(yī)學60 人類基因組工程：用散布重復序列產生人類基因組工程：用散布重復序列產生DNA標標 志；遺傳圖譜的構建志；遺傳圖譜的構建(檢測檢測DNA、 多態(tài)性或精子多態(tài)性或精子 繪圖繪圖)；物理圖譜的構建；測序，表達圖譜；物理圖譜的構建；測序，表達圖譜 法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場標本分析；法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場標本分析；HLA-DQ 腫瘤：胰癌、結腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素腫瘤：胰癌、結腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素 瘤、血液惡性腫瘤瘤、血液惡性腫瘤 組織和群體生物學：遺傳聚類研究；動物保護研組織和群體生物學：遺傳聚類研究；動物保護研 究；生態(tài)學；環(huán)境科學；實驗遺究；生態(tài)學；環(huán)境科

43、學；實驗遺 傳學。傳學。 古生物學：考古與博物館標本分析古生物學：考古與博物館標本分析 動物學：動物傳染病的診斷等動物學：動物傳染病的診斷等 植物學：檢測植物病原等植物學：檢測植物病原等 PCR技術的應用技術的應用 醫(yī)學61 病理學中應用的病理學中應用的PCR種類：種類： （1）普通）普通PCR：對病理檔案資料進：對病理檔案資料進 行回顧性研究。行回顧性研究。 因普通因普通PCR是將核酸提取后再進行是將核酸提取后再進行 擴增，無法明確樣本擴增，無法明確樣本DNA的定位。的定位。 醫(yī)學62 （2）原位）原位PCR Hasse等于等于1990年建立的技術年建立的技術 原位原位PCR是保持細胞或組織

44、的完整性，是保持細胞或組織的完整性， 使使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，反應體系滲透到組織和細胞中， 在細胞的靶在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因所在的位置上進行基因 擴增，擴增， 在擴增劑中摻入示蹤劑，或擴增在擴增劑中摻入示蹤劑，或擴增 后再作原位雜交，用該法檢測細胞內單拷后再作原位雜交，用該法檢測細胞內單拷 貝基因片段比單用原位雜交的敏感性有極貝基因片段比單用原位雜交的敏感性有極 大的提高。不但可以檢測到靶大的提高。不但可以檢測到靶DNA，而，而 且還可以了解靶且還可以了解靶DNA存在于何種細胞中，存在于何種細胞中， 更有利于探討靶更有利于探討靶DNA與細胞之間的關系。與細胞之間的關

45、系。 醫(yī)學63 原位原位PCRPCR檢測宮頸組織中檢測宮頸組織中HPV 16-DNA HPV 16-DNA （陽性細胞核為黑色）（陽性細胞核為黑色） 免疫組化檢測細胞角蛋白（棕黃色）免疫組化檢測細胞角蛋白（棕黃色） 醫(yī)學64 醫(yī)學65 （3）逆轉錄）逆轉錄PCR （retrotranscription PCR,RT-PCRretrotranscription PCR,RT-PCR） 以以RNA為模板，經逆轉錄獲得與為模板，經逆轉錄獲得與RNA互互 補的補的DNA鏈即鏈即cDNA，以，以cDNA鏈為模板鏈為模板 進行的進行的PCR反應。反應。 常用新鮮組織或細胞提取的常用新鮮組織或細胞提取的RN

46、A經逆轉經逆轉 錄酶作用后合成互補錄酶作用后合成互補DNA（cDNA），再），再 以此以此cDNA為模板進行擴增，以檢測組織，為模板進行擴增，以檢測組織， 細胞內特定基因的表達或檢測病人標本中細胞內特定基因的表達或檢測病人標本中 的的RNA病毒。病毒。 醫(yī)學66 醫(yī)學67 （1）檢測外源性基因片段，）檢測外源性基因片段， 病毒性，病毒性， 寄生蟲性及細菌性疾病的診斷，寄生蟲性及細菌性疾病的診斷，提高提高 檢出率，集中在病毒感染的檢查上；檢出率，集中在病毒感染的檢查上； 在特殊染色，免疫組化或原位雜交陰在特殊染色，免疫組化或原位雜交陰 性的組織中性的組織中PCR檢測可獲陽性結果，檢測可獲陽性結果

47、， 如結核桿菌，如結核桿菌，如如HIV、HPV、HBV、 CMV， EB病毒，瘧原蟲，弓形蟲等。病毒，瘧原蟲，弓形蟲等。 醫(yī)學68 病原微生物的檢測病原微生物的檢測 可根據(jù)病原體的基因序列，選擇特可根據(jù)病原體的基因序列，選擇特 異的順序作為異的順序作為PCR引物，后檢測是引物，后檢測是 否有否有PCR產物而測知病原體的存在。產物而測知病原體的存在。 觀察病原體在體內分布規(guī)律。觀察病原體在體內分布規(guī)律。 醫(yī)學69 （2）內源性基因片段，如人體）內源性基因片段，如人體 的單基因病、重組基因、易位的的單基因病、重組基因、易位的 染色體、染色體、Ig的的mRNA片段、癌基片段、癌基 因片段等。因片段等

48、。 醫(yī)學70 A）癌基因的研究：）癌基因的研究：如用如用PCR方法發(fā)方法發(fā) 現(xiàn)在胰腺癌，結腸癌，甲狀腺癌等標現(xiàn)在胰腺癌，結腸癌，甲狀腺癌等標 本中有本中有ras基因的突變，且基因的突變，且ras基因的基因的 突變與腫瘤發(fā)生的早期階段有關。在突變與腫瘤發(fā)生的早期階段有關。在 結腸，直腸息肉和癌旁組織中發(fā)現(xiàn)結腸，直腸息肉和癌旁組織中發(fā)現(xiàn)C- myc-mRNA的表達水平明顯增高，其的表達水平明顯增高，其 表達水平與腫瘤組織學分型和體積大表達水平與腫瘤組織學分型和體積大 小明顯有關，和結腸，直腸息肉的惡小明顯有關，和結腸，直腸息肉的惡 性潛力有關。性潛力有關。 腫瘤的診斷和研究腫瘤的診斷和研究 醫(yī)學7

49、1 B）抗癌基因的研究）抗癌基因的研究 肺癌，結腸癌和乳腺癌等肺癌，結腸癌和乳腺癌等P53抗癌基抗癌基 因點突變而滅活因點突變而滅活 視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生關鍵是患者視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生關鍵是患者 抗癌基因抗癌基因RbRb的缺失或點突變，使細的缺失或點突變，使細 胞不能產生具有正常功能的蛋白，胞不能產生具有正常功能的蛋白， 或形成無功能蛋白產物。或形成無功能蛋白產物。 醫(yī)學72 C）腫瘤相關病毒基因的檢）腫瘤相關病毒基因的檢 測測 可檢測宮頸癌，肝癌，鼻咽癌等與可檢測宮頸癌，肝癌，鼻咽癌等與 病毒密切相關的腫瘤中病毒在細胞病毒密切相關的腫瘤中病毒在細胞 基因中整合狀態(tài)和其位點，研究病基因中整合狀

50、態(tài)和其位點，研究病 毒和腫瘤的關系，為腫瘤的防止提毒和腫瘤的關系，為腫瘤的防止提 供理論依據(jù)供理論依據(jù) ； 醫(yī)學73 D）其他）其他 腫瘤的早期診斷和篩檢腫瘤的早期診斷和篩檢 原位雜交技術在肝癌細胞和癌旁細胞中均原位雜交技術在肝癌細胞和癌旁細胞中均 發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了AFPmRNA，在癌組織中，在癌組織中 AFPmRNA陽性細胞分布均一，而在癌旁陽性細胞分布均一，而在癌旁 組織則中則呈散在分布。另外發(fā)現(xiàn)組織則中則呈散在分布。另外發(fā)現(xiàn)HBV DNA與與AFPmRNA可同時出現(xiàn)于肝硬變組可同時出現(xiàn)于肝硬變組 織肝細胞內，提示織肝細胞內，提示HBV感染與感染與AFP基因活基因活 躍表達有關，亦為研究躍表達

51、有關，亦為研究HBV、AFP、肝硬、肝硬 變與肝癌的關系提供了科學依據(jù)。變與肝癌的關系提供了科學依據(jù)。 醫(yī)學74 （2 2）腫瘤療效監(jiān)測腫瘤療效監(jiān)測 腫瘤細胞產生多藥耐藥性（腫瘤細胞產生多藥耐藥性（multid rug resistance,MDR）,MDR細胞中有種特異細胞中有種特異 mRNA，轉錄這種，轉錄這種mRNA的基因為的基因為MDR 基因，細胞中基因，細胞中MDR的的mRNA含量越多，含量越多， 細胞的耐藥性就越強。細胞的耐藥性就越強。 MDR的的mRNA含含 量低的白血病患者容達到緩解，并且可以量低的白血病患者容達到緩解，并且可以 較長時間維持完全緩解，若化療過程中較長時間維持完

52、全緩解，若化療過程中 MDR mRNA逐漸升高，化療反應會逐漸逐漸升高，化療反應會逐漸 不敏感。不敏感。 醫(yī)學75 （3）檢測導入基因）檢測導入基因 在轉基因動物、器官移植、基因治在轉基因動物、器官移植、基因治 療等過程中，原位療等過程中，原位PCR技術可用于技術可用于 研究外源基因導入機體后與受體細研究外源基因導入機體后與受體細 胞之間的相互作用關系。胞之間的相互作用關系。 Yoshioka T等將綠色熒光蛋白基因等將綠色熒光蛋白基因 插入干細胞基因組，隨后采用原位插入干細胞基因組，隨后采用原位 PCR技術與熒光顯微鏡分析干細胞技術與熒光顯微鏡分析干細胞 移植后在受體中的生長發(fā)育情況。移植后

53、在受體中的生長發(fā)育情況。 醫(yī)學76 （4） 遺傳病基因檢測遺傳病基因檢測 鐮刀狀紅細胞貧血是珠蛋白基因的鐮刀狀紅細胞貧血是珠蛋白基因的 點突變所致，可將點突變所致，可將PCR產物與特異產物與特異 性探針進行斑點雜交而加以證實，性探針進行斑點雜交而加以證實， 對少量羊水細胞或絨毛進行檢測，對少量羊水細胞或絨毛進行檢測， 即可達到產前診斷的目的即可達到產前診斷的目的 地中海貧血地中海貧血 醫(yī)學77 生物芯片生物芯片 蘇州大學醫(yī)學蘇州大學醫(yī)學部部 鄧敏鄧敏 醫(yī)學78 一、何為生物芯片一、何為生物芯片? 一般說來，生物芯片就是在一塊厘一般說來，生物芯片就是在一塊厘 米見方的玻璃片、硅片、塑料膜等米見方

54、的玻璃片、硅片、塑料膜等 材料上，通過特殊的表面化學處理材料上，通過特殊的表面化學處理 連接上相關的生物分子，經過特殊連接上相關的生物分子，經過特殊 設計的生物化學反應，然后由專用設計的生物化學反應，然后由專用 的儀器收集檢測信號，再用計算機的儀器收集檢測信號，再用計算機 分析數(shù)據(jù)結果。生物芯片是微電子分析數(shù)據(jù)結果。生物芯片是微電子 學、化學、物理學、信息學和生物學、化學、物理學、信息學和生物 學相互交叉形成的一項高新技術。學相互交叉形成的一項高新技術。 醫(yī)學79 高通量、微型化和自動化高通量、微型化和自動化 芯片上集成的成千上萬的密集芯片上集成的成千上萬的密集 排列的分子微陣列，能夠在短排列

55、的分子微陣列，能夠在短 時間內分析大量的生物分子，時間內分析大量的生物分子， 快速準確地獲取樣品中的生物快速準確地獲取樣品中的生物 信息，效率是傳統(tǒng)檢測手段的信息，效率是傳統(tǒng)檢測手段的 成百上千倍。成百上千倍。 主要特點主要特點 醫(yī)學80 魚桿釣魚：以前的基因檢測技術均只魚桿釣魚：以前的基因檢測技術均只 有一個有一個“魚鉤魚鉤”，一次只能釣到一條，一次只能釣到一條 魚（即找到一種基因）。而基因芯片魚（即找到一種基因）。而基因芯片 突出的優(yōu)點是能在龐大的基因庫中，突出的優(yōu)點是能在龐大的基因庫中， 一次發(fā)現(xiàn)眾多的異?；?，就好比在一次發(fā)現(xiàn)眾多的異?；?，就好比在 一根魚桿上垂有成千上萬個釣鉤，可一

56、根魚桿上垂有成千上萬個釣鉤，可 同時捕捉許多不同的魚，從而實現(xiàn)快同時捕捉許多不同的魚，從而實現(xiàn)快 速多樣化檢測。速多樣化檢測。 醫(yī)學81 基因芯片：計算機芯片是基因芯片：計算機芯片是Intel還還 AMD？其實無論是？其實無論是Intel還是還是AMD， 其本質都一樣，都屬于半導體芯片。其本質都一樣，都屬于半導體芯片。 相似：半導體芯片和生物芯片都使相似：半導體芯片和生物芯片都使 用了微加工、光學、光刻等類似技用了微加工、光學、光刻等類似技 術，都把龐大的系統(tǒng)進行了縮微，術，都把龐大的系統(tǒng)進行了縮微， 最后輸出的信號都是數(shù)字信號。最后輸出的信號都是數(shù)字信號。 具具 有超微化、高度集成、信息貯存

57、量有超微化、高度集成、信息貯存量 大等特點大等特點. 生物芯片與計算機芯片的相同生物芯片與計算機芯片的相同 醫(yī)學82 第一，輸入的信號不一樣。半導體芯片很第一，輸入的信號不一樣。半導體芯片很 怕水，接觸到水溶液就會短路，而生物芯怕水，接觸到水溶液就會短路，而生物芯 片恰恰要分析液體，輸入其中的可能是血片恰恰要分析液體，輸入其中的可能是血 液、尿液、唾液等體液，不會出現(xiàn)短路現(xiàn)液、尿液、唾液等體液，不會出現(xiàn)短路現(xiàn) 象；象； 第二，半導體芯片是永久性固定使用，而第二，半導體芯片是永久性固定使用，而 生物芯片是一次性使用，并伴隨著相應的生物芯片是一次性使用，并伴隨著相應的 生物化學反應；生物化學反應；

58、 第三，從材料上來說，半導體芯片以硅為第三，從材料上來說，半導體芯片以硅為 基本材料，而制備生物芯片使用的材料則基本材料，而制備生物芯片使用的材料則 比較廣泛，除了硅，還可以使用玻璃、塑比較廣泛，除了硅，還可以使用玻璃、塑 料等其他材料。料等其他材料。 生物芯片與計算機芯片的不同生物芯片與計算機芯片的不同 醫(yī)學83 雖然僅有十幾年的發(fā)展歷史，但雖然僅有十幾年的發(fā)展歷史，但 在諸如在諸如生命科學、醫(yī)學、化學、生命科學、醫(yī)學、化學、 新藥開發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭、司法新藥開發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭、司法 鑒定、食品與環(huán)境監(jiān)督等眾多領鑒定、食品與環(huán)境監(jiān)督等眾多領 域域已顯示出巨大力的潛力和誘人已顯示出巨大力的潛力

59、和誘人 的前景的前景, ,帶來巨大的革新甚至革帶來巨大的革新甚至革 命。命。 什么是生物芯片什么是生物芯片(Biochips)？ 生物芯片是將大量生物識別分子按預先設生物芯片是將大量生物識別分子按預先設 置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片及高聚 物載體等）表面，利用生物分子的特異性親和反物載體等）表面，利用生物分子的特異性親和反 應，如核酸雜交反應，抗原抗體反應等來分析各應，如核酸雜交反應，抗原抗體反應等來分析各 種生物分子存在的量的一種技術。種生物分子存在的量的一種技術。 醫(yī)學85 芯片是大約半英寸芯片是大約半英寸(1.28cm(1.28cm）的）

60、的玻玻 璃片或硅片璃片或硅片小片，在片上排列著約小片，在片上排列著約 6400064000小方格，小格邊長約為頭發(fā)小方格，小格邊長約為頭發(fā) 絲的一半。在此片上將大量已知的絲的一半。在此片上將大量已知的 探針，按順序列陣固定于片基上，探針，按順序列陣固定于片基上， 從而獲得一高密度（通常探針的密從而獲得一高密度（通常探針的密 度在度在6500065000600000/cm600000/cm2 2）的探針）的探針 陣列。可陣列?？芍苽涑霭苽涑霭?00萬個萬個DNA 探針的人類基因檢測芯片。這些探針的人類基因檢測芯片。這些 DNA分子的粘貼位置和其中的基因分子的粘貼位置和其中的基因 狀態(tài)等信息