植物分子生物學(xué)實驗技術(shù)

1、植物分子生物學(xué)實驗技術(shù)班級：研 122 班專業(yè)：作物生物技術(shù)姓名：陜建國學(xué)號： 20122419授課教師：李紅英老師實驗一：植物DNA和 RNA提取方法的討論一、提取植物DNA和 RNA的用處提取植物組織的 DNA和 RNA，分析其序列，了解序列的排列順序可以更好的從分子水平上進行研究，從分子水平上改良植物或者說農(nóng)作物的一些性狀、品質(zhì)等。（一）提取植物DNA的用處DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物學(xué)研究中占有重要地位， DNA 的提取效率直接決定著后續(xù)實驗的成敗。另外，提取植物 DNA在分子育種方面也有很重要的用處。（二）提取植物 RNA的用處提取 RNA 可以進行 Northern

2、雜交、原位雜交、 RT-PCR 以及 cDNA 文庫構(gòu)建等很多分子生物學(xué)實驗。提取 RNA也是進行基因表達分析及基因克隆等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。二、植物組織DNA的提取方法提取植物 DNA的試驗原理：脫氧核糖核酸（ deoxyribonucleicacid， DNA）是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一。從細胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術(shù)的關(guān)鍵。DNA不溶于 0.14mol/L的 NaCl 溶液中，而 RNA則能溶于 0.14mol/L的 NaCl溶液之中，利用這一

3、性質(zhì)就可以將二者從破碎細胞漿液中分開。制備過程中，細胞破碎的同時就有 Dnase釋放到提取液中，使 DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和 EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離， 再加入陰離子去垢劑 0.15 的 SDS，經(jīng)過 2h 攪拌，或用氯仿異醇除去蛋白，通過離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。 然后用 95的預(yù)冷乙醇即可把 DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來。（一）植物 DNA的SDS提取法：（來自You are so late的新浪空間）試驗試劑：1、研磨緩沖液：稱取 59.63gNaCl ，13.25g 檸檬酸三鈉， 37.2

4、gEDTANa 分別溶解后合并為一，用 0.2mol/L 的 NaOH調(diào)至 pH7.0，并定容至 1000ml。2、10SSC溶液：稱取 87.66gNaCl 和 44.12g 檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至 1000ml。3、1SSC溶液：用 10SSC溶液稀釋 10 倍。4、0.1 SSC溶液：用 1SSC溶液稀釋 10 倍。5、Rnase溶液：用 0.14mol/LNaCl 溶液配制成 25mg/ml 的酶液，用 1mol/L HCl，pH 至 5.0 ，使用前經(jīng) 80水浴處理 5min（以破壞可能存在的 Dnase）。6 氯仿異戊醇：按24ml 氯仿和 1ml 異戊醇混合。7、5mo

5、l/L 高氯酸鈉溶液：稱取 NaClO4H2O70.23g ，先加入少量蒸餾水溶解再容至 100ml。8、SDS（十二烷基硫酸鈉）化學(xué)試劑的重結(jié)晶：將 SDS放入無水酒精中達到飽和為止，然后在 7080的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之后即將濾液放入冰箱，待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用。9、1molL HCl 。10、0.2mol/L NaOH。11、二苯胺乙醛試劑： 1.5g 二苯胺溶于 100ml 冰醋酸中，添加 1.5ml 濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml 乙醛液濃乙醛： H2O 1： 50（VV）。12. 1.0mol/L 高酸溶液（ HClO4）。13、高氯酸溶液。14、0

6、.05mol/L NaOH。15、DNA標(biāo)準(zhǔn)液：取標(biāo)準(zhǔn) DNA25mg溶于少量 0.05mol.L-1NaOH 中，再用 0.05mol/L NaOH定容至 25ml，后用移溶管吸取此液5ml 至 50ml 容量瓶中，加 5.0ml 1mol/L HClO4 ，混合冷卻后用 0.5mol/L HClO4 定容至刻度，則得100g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。實驗步驟：1、稱取植物幼嫩組織 10g 剪碎置研缽中，加 10ml 預(yù)冷研磨緩沖液并加入 0.1g 左右的 SDS，置冰浴上研磨成糊狀。2、 將勻漿無損轉(zhuǎn)入 25ml 刻度試管中加入等體積的氯仿異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振蕩 30s，轉(zhuǎn)入離心管，靜置

7、片刻以脫除組織蛋白質(zhì)。以 4000rpm離心 5min。3、 離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿。4、 將試管置 72水浴中保溫 3min（不超過 4min），以滅活組織的 DNA酶，然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加 5mol/L 高氯酸鈉溶液提取液：高氯酸鈉溶液 4： 1 （ VV），使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為 1mol/L 。5、 再次加入等體積氯仿異戊醇混合液至大試管中，振蕩1min，靜置后在室溫下離心（ 4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。6、 用滴管吸 95的預(yù)冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇

8、的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。7、 然后加入 0.5ml 左右的 10SSC，使最終濃度為1SSC。8、 重復(fù)第 6 步驟和第 7 步驟即得到 DNA的粗制品。9、 加入已處理的Rnase 溶液，使其最后的作用濃度為5070g/ml ，并在 37水浴中保溫 30min，以除去 RNA。10、 加入等體積的氯仿異戊醇混合液，在三角瓶中振蕩1min，再除去殘留蛋白質(zhì)及所加 Rnase蛋白，室溫下以 4000rpm 離心 5min，收集上層水溶液。11、 再按 6、7 步驟處理即可得到純化的 DNA液。（二）植物 DNA的 CTAB提取法：（來自 Y

9、ou are so late的新浪空間）試驗步驟：1、 稱取新鮮葉片 2-3g ，剪碎放入研缽中，在液氮中研磨成粉末。2、 將粉末轉(zhuǎn)移到加有 7ml 經(jīng)預(yù)熱的 15CTAB提取緩沖液 15ml 離心管中，迅速混勻后置于 65水浴中，溫育 30min。3、 取出離心管 , 冷卻至室溫，加入氯仿 / 異戊醇 (24:1) ，充分混勻，室溫下 2300 轉(zhuǎn)離心20min。4、 將上清轉(zhuǎn)移至另一新的 15ml 離心管中，加入 1/10 體積 10%的 CTAB和等體積的氯仿 / 異戊醇。充分混勻， 2300rpm離心 20min。5、 轉(zhuǎn)移上清至另一新的 15ml 離心管中，加入等體積 1%的 CTA

10、B沉淀緩沖液，輕輕搖晃至形成 DNA絮狀沉淀。 1000rpm離心 10min，使 DNA沉淀于管底。6、 加入 1.5-2ml 的 1mol/L NaCl 及 5l RNase 置于 56水浴中過夜。7、 待 DNA完全溶解后，加 2- 3ml 4 預(yù)冷的 95%的冰乙醇使 DNA沉淀，挑出 DNA，置于 15ml 離心管中，用 70%乙醇清洗 30min。8、 離心機甩 5s，倒出 70%乙醇，再用 95%乙醇浸泡 5min，倒出 95%乙醇，在超凈工作臺上吹干。.9、 將風(fēng)干的 DNA直接在 4保存?zhèn)溆没蛉苡?00l TE 溶液中于 - 20保存 .（三）植物葉片的提取步驟（來自b04a

11、43e2bbfcd1e1a002dc21）實驗步驟1、在 50ml 帶蓋離心管（放在 -20 度預(yù)冷）中加入 20ml 提取緩沖液 I ，60水浴預(yù)熱。2、水稻幼苗或葉子 510g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動混勻， 60水浴保溫 3060 分鐘（時間長， DNA產(chǎn)量高），不時搖動。3、加入 20ml 氯仿 / 戊醇 / 乙醇溶液，顛倒混勻（需帶手套，防止損傷皮膚），室溫下靜止 510 分鐘，使水相和有機相分層（必要時可重新混勻）。4、室溫下 5000rpm 離心 5 分鐘。5、仔細移取上清液至另一 50ml 離心管，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即

12、出現(xiàn)絮狀 DNA沉淀。6、在 1.5ml eppendorf 管中加入 1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出 DNA絮團，在干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含 TE 的離心管中， DNA很快溶解于 TE。7、如 DNA不形成絮狀沉淀，則可用 5000rpm 離心 5 分鐘，再將沉淀移入 TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于 TE，可在 60水浴放置 15 分鐘以上，以幫助溶解。8、將 DNA溶液 3000rpm 離心 5 分鐘，上清液倒入干凈的5ml 離心管。9、加入 5lRNaseA（10 g/ l ）,37 10 分鐘，除去 RNA（RNA對 DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。10、加入 1

13、/10 體積的 3mol/L NaAc 及 2體積的冰乙醇，混勻， -20 放置 20 分鐘左右，使 DNA形成絮狀沉淀。11、用玻璃撈出 DNA沉淀， 70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。12、將 DNA重新溶解于 1 ml TE 中， 20貯存。三、植物 RNA的提取植物細胞內(nèi)含有細胞質(zhì) RNA、細胞核 RNA和細胞器 RNA。細胞質(zhì) RNA包括 mRNA、rRNA、tRNA。細胞核 RNA主要有細胞質(zhì) RNA的前體及小分子細胞核 RNA(snRNA)、染色質(zhì) RNA(chRNA) 等。細胞器 RNA主要指線粒體 RNA及葉綠體 RNA。這些 RNA統(tǒng)稱細胞總 RNA，其中大量的是 rR

14、NA，占 80左右?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA在總 RNA中只占 1 5。不同的 mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平等方面各不相同，但真核細胞mRNA3末端都具有 20200 個不等的多聚腺苷酸的尾，稱為poly(A) 結(jié)構(gòu)。利用poly(A) 結(jié)構(gòu)可以把mRNA從總 RNA中分離出來。對于Northern 雜交可以使用植物細胞總RNA，也可以使用由總 RNA中分離出的 mRNA。植物細胞 RNA提取中的主要問題是防止 RNA酶的降解作用。 RNA酶是一類水解核糖核酸的內(nèi)切酶， 它與一般作用于核酸的酶類有著顯著的不同， 不僅生物活性十分穩(wěn)定， 耐熱、耐酸、耐堿，作用時不需要任何輔

15、助因子，而且它的存在非常廣泛，除細胞內(nèi)含有豐富的RNA酶外，在實驗環(huán)境中，如各種器皿、試劑、人的皮膚、汗液、甚至灰塵中都有 RNA酶的存在。因而，生物體內(nèi)源、外源 RNA酶的降解作用是導(dǎo)致 RNA提取失敗的致命因素。內(nèi)源 RNA酶來源于材料的組織細胞，提取自始至終都應(yīng)對 RNase活性進行有效抑制。RNA提取過程中將蛋白質(zhì)變性劑與 RNase抑制劑聯(lián)合使用效果較理想。蛋白質(zhì)變性劑包括酚、氯仿、 SDS、Sarkosyl( 十二烷酰肌氨酸鈉 ) 、DOC(脫氧膽酸鈉 ) 、鹽酸胍、異硫氰酸胍、4氨基水楊酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉等； RNA酶抑制劑有 RNasin(RNase阻抑蛋白 ) 、氧釩核糖

16、核苷復(fù)合物等。外源 RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯 C2HsOCOOCOOCxH5)，它能與 RNase分子中的必需基團組氨酸殘基上的咪唑環(huán)結(jié)合而抑制酶活性， 用于水、試劑及器皿的 RNase 滅活。 DEPC與肝素合用效果增強，值得注意的是 DEPC在 Tris 溶液中很不穩(wěn)定，很快分解成 CO2 及 C2H5OH，因而不能用于 Tirs 溶液的 RNase滅活。水及其它溶液的滅活一般使用0.05 0.1 DEPC， 37處理過夜，也有人采用磁攪 0.5 小時以上的做法。 DEPC處理后的溶液還需高壓滅菌，以去除殘存的 DEPC。若 DEPC去除不凈，會破壞 mRNA活性。不

17、能高壓滅菌的試劑要使用經(jīng)過 DEPC處理的滅菌蒸餾水配制，然后用 0.22 m 濾膜過濾。含有Tris 的試劑用經(jīng) DEPC處理過的水配制，再經(jīng)高壓消毒。玻璃器皿可以在 180烘烤 8 小時以上，不能烘烤的器皿用 0.1 的 DEPC水處理過夜后再高壓滅菌。提取全過程必須在清潔無塵的環(huán)境中進行。操作人員要使用一次性的手套拿取物品，盡可能避免一切污染機會。提取時使用的器皿應(yīng)經(jīng)過硅烷化處理，以防止 RNA被吸附在器皿壁上，造成損失。 RNA電泳使用的電泳槽需用去污劑洗滌，水沖洗，乙醇干燥。再浸入3 H202 溶液中，室溫下放置10 分鐘以上，再用DEPC溶液處理過的水沖洗干凈?？傊?，實驗中所用的試

18、劑、器皿都要經(jīng)過RNase滅活處理。盡管如此，有時還會出現(xiàn)在提取的后期RNA被降解的問題。這是因為RNase活性的抑制只是一個暫時的現(xiàn)象，一旦抑制劑濃度下降RNase就有可能恢復(fù)活性。對于RNA提取來說，這是一個潛伏的危險。在提取的前階段，提取液中無疑是有足夠的抑制劑，但到了提取后期，抑制成分逐漸減少，殘存的RNase就會復(fù)活而引起RNA降解。另外，提取后期發(fā)生的 RNase污染，那怕是極輕微的，也會使到手的產(chǎn)品降解，因而提取后期要更加小心。影響植物 RNA提取的另一個問題是水溶性的細胞代謝物如酚、多糖等易與RNA結(jié)合成膠凍狀的不溶物或有色的復(fù)合物，它們能影響RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量。人們采用了多種

19、處理方法來解決這個問題，如對組織提取液進行高速離心去除多糖；采用低pH 值的提取緩沖液抑制酚的解離及氧化；或用巰基乙醇、PVP來抑制酚類的干擾等。（一）小麥葉片及不同時期種子的RNA的提?。?趙雙宜，吳耀榮，夏光敏. 介紹一種簡單高效的植物總 RNA提取方法山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 , 濟南）1、取 510g 材料放入研缽中，加入過量液氮，迅速研磨成均勻的粉末（在研磨過程中，保證材料始終浸在液氮中，研磨約 30min 左右）。2、待液氮自然揮發(fā)干凈后，將材料轉(zhuǎn)入 100ml 的離心管中，加入 68 倍體積的裂解緩沖液，輕輕攪拌后， 0冰浴 20min。3、12000r/min ，4離心 15min

20、。4、取上清液，加 1/3 體積的 3mol/L 醋酸鈉（ pH 5.3 ）， 1/5 體積的氯仿 - 異戊醇（ 24:1) ，輕輕混勻， 0冰浴 20min（加 5 倍體積裂解緩沖液溶解沉淀以提取 DNA)。5、12000r/min ，4離心 15min。6、取上清，加入等體積冰浴冷卻的異丙醇，混勻且冰浴10min。7、5000r/min ，4離心 10min。將沉淀溶于 5ml 含有 0.1%的 SDS緩沖液中，加入 8mil/L LiCl 使終濃度至 2.5mol/L ，冰浴 4過夜。8、12000r/min ，4離心 10min。9、70%乙醇洗滌沉淀兩次，空氣干燥10min 后，溶于

21、 DE-PC處理的 TE 或水中。加入1/10體積 10%重復(fù)第四、六步進一步除去蛋白質(zhì)。-70 冰箱保存。裂 解 緩 沖 液 成 分 ： 7mol/L尿 素 ， 50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LNa2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris飽和酚 pH8.0,0.1% SDS+0.1%LDS。裂 解 緩 沖 液 成 分 ： 7mol/L尿 素 ， 50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LNa2EDTA,pH8.0,3.5mol/L NaCl,6.25% Tris飽和酚 pH8.0,0.1% SDS+1%LDS。（二）植

22、物總 RNA的提?。ò俣任膸欤?Trizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總 RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細胞、 降解蛋白質(zhì)和其它成分 , 使蛋白質(zhì)與核酸分離 , 失活 RNA酶 , 同時能保持 RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后， RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀 RNA。Trizol試劑配制苯酚飽和液（ 38%） -380ml/l 、硫氰酸胍鹽（ 0.8M-118.16g ） 、硫氰酸銨（ 0.4M） - 76.12g 、醋酸鈉 pH 5（0.1M）- 33.4ml 、甘油 50ml ，加水至 1L實驗試劑1、無 RNA酶的無菌水： 用將高溫烘

23、烤的玻璃瓶 （180 2 小時）裝蒸餾水，然后加入 0.01% 的 DEPC（體積 / 體積），處理過夜后高壓滅菌。2、75%乙醇：用 DEPC處理水配制 75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、氯仿 : 異戊醇 24 : 1（ v/v)4、異丙醇、無水乙醇、 70乙醇。5、Trizol試劑。、氯仿。操作步驟1、取植物嫩葉，液氮研磨，每1.5ml tube分裝 0.1 克樣品；.每管加入0.5ml Trizol液，迅速混勻，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的 10%。、室溫下靜置5分鐘以利于核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的解離、加入 0.5ml 的氯仿，

24、蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 秒，室溫靜置分鐘、 10000r/min離心 10 分鐘、取上清液（水相）轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入等體積異丙醇，室溫放置10 分鐘，10000r/min 離心 10 分鐘。、棄去上清液，加入至少1ml 的 70%乙醇，渦旋混勻， 4下 r/min離心分鐘。、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10 分鐘，注意不要干燥過分，否則會5降低 RNA的溶解度。然后將 RNA溶于 TE或 DEPC處理過的水中，必要時可 55- 60水溶 10 分鐘。RNA可進行 mRNA分離，或貯存于 70%乙醇并保存于 - 70 （三） CTAB方法提取植物葉片 RNA（百度文庫）

25、操作步驟1、取葉片材料兩克，液氮中研磨成細粉末。2、每管加入 10ml65預(yù)熱的 CTAB提取液和 500 l - 巰基乙醇，劇烈渦旋勻漿， 65 水浴溫育 30min。3、每管加入 10ml 氯仿：異戊醇（ 24：1），渦旋混勻，冰浴 10min。4， 12000rpm 離心10min。4、取上清，加入 13 體積的 8M LiCl 和 500l- 巰基乙醇， -20 沉淀過夜。5、4， 12000rpm離心 20min。6、棄上清，沉淀用 4ml 異硫氰酸胍變性液溶解， 加入 120l - 巰基乙醇和 880l 2MNa Ac (pH4.0), 混勻后加入 5ml 的酚：氯仿：異戊醇（ 2

26、5：24： 1）， 渦旋混勻，冰浴 5min。4， 12000rpm離心 10min。7、取上清，加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），渦旋混勻，冰浴5min。4，12000rpm離心 10min。8、取上清，加入等體積氯仿：異戊醇（24： 1），渦旋混勻，冰浴5min。 4， 12000rpm離心 10min。9、取上清，加入 110 體積的 3MNaAc(pH5.2) 和 2.5 倍體積的無水乙醇， -20 放置過夜。10、4， 14000rpm離心 20min。棄上清，沉淀用預(yù)冷的 75%乙醇漂洗 2 次，每次洗滌后，14000rpm離心 10min，棄上清。冰上干燥 RNA沉淀

27、。11、加入 100l RNase-free-ddH 2O溶解沉淀。取 10l 稀釋 200 倍檢測 UV 230、260、280 下的 OD值，檢測 RNA樣品的純度與濃度。取5 g 進行 RNA樣品的電泳檢測，以檢測rRNA的完整性，其余樣品加入 3 倍體積的無水乙醇于 70下保存。（四）硅藻土 - 苯酚法（一種廣泛適用的 RNA 提取方法）（來自李曉宇的方法）利用硅藻土能夠有效吸附 RNA 酶的特性，結(jié)合高鹽、 PVP 及乙二醇丁醚沉淀等過程，建立了高效高質(zhì)量 RNA 提取方法 . 該方法適應(yīng)性廣，可以從富含RNase 及多糖、多酚等代謝產(chǎn)物提取 RNA 困難的動、植物及微生物材料中提取

28、高質(zhì)量總RNA 植物組織 RNA提取的難點及對策。具體步驟：（全過程均在冰上操作，保持樣品溫度在0 4）1、樣品液氮速凍，于研缽中研磨成細微粉末并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管；2、按照 4 ml/g 的比例加入硅藻土提取緩沖液，充分震蕩后加入1/2 體積的水飽和酚和1/2 體積的氯仿異戊醇 (24 1) ，震蕩混勻；3、412 000g 離心 10 min，取上清加入等體積 5mol/L KAc(pH 4.8) ，混勻后冰浴 10 min；4、413 000g 離心 10 min ，液相轉(zhuǎn)入新管，重復(fù)上述酚仿抽提，直至界面清亮；5、上清移入新管，加入等體積乙二醇丁醚，混合均勻后，冰上放置1 h ；6、41

29、4 000 g離心 15 min ，沉淀用 75%乙醇洗 2次，空氣干燥后用適量DEPC-H2O 溶解， - 70 保存。硅藻土提取緩沖液： 20 mmol/L 檸檬酸鈉 (pH 7.0) ， 10 mmol/L EDTA ， 0.5% SDS，1% -巰基乙醇， 100 mmol/L NaCl，1.9 g/L處理過的硅藻土。 (121 高壓滅菌 20 min，冷卻后再加入 1% - 巰基乙醇， 4保存 )。硅 藻 土 的 處 理 ：5g 硅藻土用 50 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.6) 溶解，于 100 放置 5 min 。室溫 2500g 離心 5min。棄上清，沉

30、淀用40 ml 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重懸。重復(fù)離心和重懸的步驟兩次。超聲 1 min 。室溫 3500g 離心 15min. 。沉淀用 30ml50mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)重懸。 4儲存。.實驗二： PCR 及 QPCR普通的 PCR是進行定性分析的，而 QPCR是進行定量分析的，是檢測初始量的，并且在進行 PCR是標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是非常重要的。一、 PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈 DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與

31、母鏈模板 DNA互補的子鏈 DNA的過程。是一項 DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的 DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。（一） PCR的原理DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈 DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在 DNA聚合酶的參與下， 根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)， DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制 DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物， DNA聚合酶、 dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR技術(shù)的基本原理類似于 DNA

32、的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。（二） PCR反應(yīng)體系（百度文庫）10擴增緩沖液10 l4 種 dNTP混合物200l引物10 100l模板 DNA0.1 2gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水100 l1、無 Mg2 buffer ：由純水、 kcl 、 Tris組成。 Tris 用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，使 Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。 kcl 可降低退火溫度，但不能超過 50 mmol/L ，否則會抑制DNA聚合酶活性。2、Mg2: 終濃度為 1.5 2.0mmol/L ，其對應(yīng) dNTP為 200 mol/L ，注意 M

33、g2 與 dNTPs之間的濃度關(guān)系， 由于 dNTP與 Taq 酶竟?fàn)?Mg2 ，當(dāng) dNTP濃度達到 1 mmol/L 時會抑制 Taq 酶的活性。其濃度越小，酶的特異性就越高。3、 BSA：一般用乙?；?BSA，起著減少 PCR管對 Taq 酶的吸附作用，對 Taq 酶有保護作用。4、底物（ dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用 NaOH調(diào) pH 值至 7.0 7.5 ，一般存儲濃度為 10 mmol/L ，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為 20200mol/L 。高濃度可加速反應(yīng)， 但同時增加錯誤摻入和實驗成本； 低濃度可提高精確性， 而反應(yīng)速度會降低。5、Taq 酶：能耐

34、 95高溫而不失活， 其最適 pH值為 8.3 8.5 ，最適溫度為 7580，一般用 72。能催化以 DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎(chǔ)，按 5 3方向逐個將 dNTP分子連接到引物的3端，合成一條與模板DNA互補的新的 DNA子鏈。6、模板：不含有對 PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、 TqaDNA聚合酶抑制劑、能與 DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板 DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。7、引物：引物濃度一般為0.1 0.5 mol/L ，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般 1530 個堿基，引物過長或過

35、短都會降低特異性。其 3末端一定要與模板 DNA配對，末位堿基最好選用 A、 C、 G（因 T 錯配也能引發(fā)鏈的延伸）。( 三)PCR引物設(shè)計（百度百科）PCR反應(yīng)中有兩條引物， 即 5端引物和 3引物。 設(shè)計引物時以一條 DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴增片段 5端上游的一小段 DNA序列相同；3端引物與位于待擴增片段 3端的一小段 DNA序列互補。引物設(shè)計的基本原則：引物長度： 15-30bp ，常用為 20bp 左右。引物堿基： G+C含量以 40-60%為宜， G+C太少擴增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC最好隨機分布，避免 5 個以上的嘌呤

36、或嘧啶核苷酸的成串排列。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物 3末端連續(xù) 8 個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。引物 3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是G和 C。引物的 5 端可以修飾。 如附加限制酶位點， 引入突變位點， 用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。（四） PCR的步驟（百度文庫）PCR由變性 - 退火 - 延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：第一步、模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至

37、93左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；第二步、模板 DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；第三步、引物的延伸： DNA模板 - 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈；重復(fù)循環(huán)變性 - 退火 - 延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。（八） PCR的種類（百度文庫）種類原

38、理備注反 向PCR( Inverse反向 PCR是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種PCR, IPCR)技術(shù)方法主要原理是用一種在已知序列中無切點的限制性內(nèi)切酶消化基因組 DNA后酶切片段自身環(huán)化以環(huán)化的 DNA作為模板，該方法的不足是： 需要從許多酶中選擇限制酶， 或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大.用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引小的 DNA片段。這種選擇不物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產(chǎn)能在非酶切位點切斷靶物是線性的 DNA片段，大小取決于上述限制DNA。大多數(shù)有核基因組性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼 DNA序列內(nèi)部的含有大量中度和高度重復(fù)酶切位點分布情況。用不同的限制性內(nèi)切序列，而

39、在 YAC或 Cosmid中酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再的未知功能序列中有時也通過反向 PCR獲得未知片段 。會有這些序列， 這樣，通過反向 PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。錨 定PCR(Anchored 用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄 cDNA3 - 末端應(yīng)用：它可用于擴增未知或PCR, APCR)技術(shù)加上一段已知序列 , 然后以此序列為引物全知序列 , 如未知 cDNA的制結(jié)合位點對該 cDNA進行擴增 , 稱為 APCR。備及低豐度 cDNA文庫的構(gòu)建。不對稱兩種引物濃度比例相差較大的 PCR技術(shù)稱應(yīng)用：可制備單鏈 DNA片段PCR(asymmetricPCR) 不對稱

40、 PCR。在擴增循環(huán)中引入不同的引物用于序列分析或核酸雜交的技術(shù)濃度 , 常用 501001比例。在最初的探針。1015個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈 DNA,但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后 , 高濃度引物介導(dǎo)的 PCR反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈 DNA。反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse當(dāng)擴增模板為 RNA時,需先通過反轉(zhuǎn)錄酶RT - PCR應(yīng)用非常廣泛 , 無transcription, RT-將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA才能進行擴增。論是分子生物學(xué)還是臨床檢PCR)技術(shù)驗等都經(jīng)常采用。修飾引物 PCR技術(shù)為達到某些特殊應(yīng)用目的 , 如定向克隆、定點突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等,可在引物的 5 - 端加上酶切位點、突變

41、序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析結(jié)合位點等。巢式 PCR(NEST PCR)技先用一對靶序列的外引物擴增以提高模板主要用于極少量 DNA模板的術(shù)量 , 然后再用一對內(nèi)引物擴增以得到特異擴增。的 PCR帶, 此為巢式 PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式 PCR。為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長些 , 且用量較少 ,同時在第一次 PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度 , 這樣在第一次 PCR時,由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合,故只有外引物擴增產(chǎn)物, 經(jīng)過若干次循環(huán) , 待外引物基本消耗盡 , 無需取出第一次 PCR產(chǎn)物 , 只需降低退火即可直接進行P

42、CR擴增。這不僅減少操作步驟 , 同時也降低了交叉污染的機會。這種 PCR稱中途進退式 PCR( drop-in, drop-out PCR)。等位基因特異性 PCR技ASPCR依賴于引物 3 - 端的一個堿基錯術(shù)配 , 不僅減少多聚酶的延伸效率 , 而且降低引物 - 模板復(fù)合物的熱穩(wěn)定性。單鏈構(gòu)型多態(tài)性SSCP- PCR是根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長 DNAPCR(single-單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移strandconformational率變化來檢測基因變異。在不含變性劑的polymorphism PCR,中性聚丙烯酰胺凝膠中 , 單鏈 DNA遷移率除SSCPPCR)技術(shù)與 DNA

43、長度有關(guān)外 , 更主要取決于 DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象 , 相同長度的單鏈 DNA因其順序不同或單個堿基差異所形成的構(gòu)象就會不同 ,PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后進行單鏈DNA凝膠電泳時 , 每條單鏈處于一定的位置 , 靶 DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個堿基置換時 , 就會出現(xiàn)泳動變位 , 從而提示該片段有基因變異存在。低嚴(yán)格單鏈特異性引物L(fēng)SSP- PCR 是建立在 PCR 基礎(chǔ)上的又一種PCR新型基因突變檢測技術(shù)。要求是“二高一(Lowstringencysingle低” , 高濃度的單鏈引物 (5- 端/ 3-specific primer PCR,端引物均可 ), 約 4. 8Lmol,高濃

44、度的 TaqLSSP- PCR)技術(shù)酶 ( 16Lmol/ 100ml) ,低退火溫度( 30 ), 所用的模板必須是純化的 DNA片段。在這種低嚴(yán)格條件下 ,引物與模板間發(fā)生不同程度的錯配 , 形成多種大小不同的擴增產(chǎn)物 , 經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。對同一目的基因而言 ,所形成的帶型是固定的 , 因而稱之為“基因標(biāo)簽”。復(fù)合 PCR(multiplex在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴增幾種基PCR)技術(shù)因片段 , 如果基因的某一區(qū)段有缺失 , 則相應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。重組 PCR技術(shù)重組 PCR技術(shù)是在兩個 PCR擴增體系中 , 兩對引物分別由其中之一在其5 - 端和3-端引物上帶

45、上一段互補的序列 , 混合兩種PCR擴增產(chǎn)物 , 經(jīng)變性和復(fù)性 , 兩組 PCR產(chǎn)物互補序列發(fā)生粘連 , 其中一條重組雜合鏈能在 PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng) , 產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。這樣有點突變的模板進行PCR擴增后檢測不到擴增產(chǎn)物 , 可用于檢測基因點突變。這是一種檢測基因突變或進行遺傳鑒定的快速敏感方法。復(fù)合 PCR主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。二、 QPCRQPCR的英文全名是 Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)

46、，簡稱QPCR。其就是利用熒光信號的變化實施檢測 PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過 Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析。.（一） QPCR的原理（來自 You are so late的新浪空間）實時 PCR就是在 PCR擴增過程中，通過熒光信號，對 PCR進程進行實時檢測。一般來講，定量 PCR儀包括：實時熒光定量 PCR儀主要由樣品載臺、基因擴增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計算機及應(yīng)用軟件組成。其中基因擴增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴增儀大致相同，不同廠家不同型號的產(chǎn)品分別采用空氣加熱、壓縮機制冷、半導(dǎo)體加熱制冷等工作方式。獨特是這個微量熒

47、光檢測系統(tǒng)。有由熒光激發(fā)光學(xué)部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統(tǒng)組成。（二） Real-time qPCR 的種類熒光定量 PCR最常用的方法是 DNA結(jié)合染料 SYBR Green的非特異性方法和 Taqman 水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這 2 種方法，其它方法請參考其它熒光定量 PCR 資料。第一種：非特異性SYBR Green I 染料法SYBRGreen I 是一種結(jié)合于所有 dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料 （結(jié)合示意圖），在游離狀態(tài)下， SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA結(jié)合后，熒光大大增強。因此， SYBRGreen I 的

48、熒光信號強度與雙鏈 DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出 PCR體系存在的雙鏈 DNA數(shù)量。第二種：特異性Taqman水解探針法Taqman熒光定量技術(shù)是以 Taqman熒光探針為基礎(chǔ)， Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時， Taq 酶的 5 3外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR產(chǎn)物形成完全同步。從而實現(xiàn)定量。常用的熒光基團是 FAM, TET,

49、VIC, HEX 。（三） Real-time qPCR 實驗設(shè)計1. 引物設(shè)計一般 real-time PCR引物的設(shè)計遵循下面一些原則：擴增產(chǎn)物長度在80-150bp引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)物長度一般在15-30 堿基之間G+C含量在 40%-60%之間堿基要隨機分布引物自身不能有連續(xù)4 個堿基的互補引物之間不能有連續(xù)4 個堿基的互補引物 5端可以修飾引物 3端不可修飾引物 3端要避開密碼子的第3 位2. Real-time qPCR 操作過程（百度文庫）（ 1） RNA提取和反轉(zhuǎn)錄RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致 RNA酶的污染。由于 RN

50、A酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則：a. 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌，可能污染 RNA的抽提并成為 RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。b. 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提 RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的 RNA 酶交叉污染。例如，使用 RNA探針的實驗室可能用 RNA酶 A 或 T1 來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含 RNA酶。c. 在提取裂解液中， RNA是隔離在 RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150的烘箱中烘烤4 小時。塑料器皿可以在 0.5M NaOH中浸泡 10 分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。（ 2）Mix 配制一般來講，進行 real-timeqPCRMasterMix 都是 2的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 靈敏度高，所以每個樣品至少要做 3 個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于 Ct 相差較多或者 SD太大，無法進行統(tǒng)計分析。通常來講，反應(yīng)體系