三葉木通的組織培養(yǎng)和多倍體誘導(dǎo)

1、三葉木通的組織培養(yǎng)和多倍體誘導(dǎo)摘要：以三葉木通種子為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，再用不同濃度的秋水仙素溶液對叢生芽進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo)，并用染色體計(jì)數(shù)法檢測材料倍性。結(jié)果表明，叢生芽誘導(dǎo)的較好方式為消毒好的種子沿其背腹線縱切成半后接種于 MS+1.0 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出無菌苗，然后將無菌苗接種于 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 的繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 0.3%的秋水仙素處理 24 h 效果最好， 多倍體誘導(dǎo)率達(dá)12%。關(guān)鍵詞：三葉木通；組織培養(yǎng)；叢生芽；多倍體中圖分類號：S567.904 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（ 2016） 05-

2、0069-03三葉木通 Akebia trifoliate（ Thunb.） Koidz.為木通科木通屬藤本植物，全株均可入藥，具有通經(jīng)下乳、清熱利尿等功效，主要分布于甘肅、貴州、河北、河南、山東等地1 。三葉木通果實(shí)具有發(fā)達(dá)的胎座組織，味甜可口，具有獨(dú)特的風(fēng)味，含有許多人體必需營養(yǎng)成分2-3 ，是一種具有開發(fā)潛力的保健水果，但存在果皮厚、種子多、可食率低的問題。多倍體植株具有生物產(chǎn)量增加、藥用活性成分增加、抗逆性增強(qiáng)、植株育性下降、少籽或無籽等特點(diǎn)，多倍體育種可成為三葉木通遺傳改良的途徑之一。植物離體誘導(dǎo)多倍體的方法已成功地在許多植物中取得成功，其中建立組培快繁體系是其必要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)旨在以

3、三葉木通幼嫩種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得叢生芽，再用秋水仙素對叢生芽進(jìn)行處理，以獲得三葉木通多倍體材料，為無籽三葉木通的研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料三葉木通果實(shí)采自貴州省貴陽市花溪區(qū)棉花關(guān)，植株經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙財(cái)副教授鑒定為木通科木通屬植物三葉木通。1.2 方法1.2.1 外植體處理2014 年 8 月中旬摘取三葉木通幼嫩果實(shí)，毛刷刷去表面塵土洗潔精浸泡7 min 自來水沖洗20min 超凈工作臺中取出種子無菌水清洗種子數(shù)次濾紙吸干表面水分75%乙醇消毒 15 s 0.1% HgCl2浸泡 7 min 無菌水沖洗3 次。將消毒好的種子橫切成半、沿背腹線縱切成半，以不切作對照

4、處理，然后分別接種到MS 培養(yǎng)基（添加蔗糖 30 g/L、瓊脂 7 g/L，pH 值 5.8 6.0，下同）中。每個(gè)處理接種 20 個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶 4 粒種子。（ 252）黑暗培養(yǎng) 40 d，統(tǒng)計(jì)出苗情況。1.2.2 無菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)采用合適的切種方式，將消毒好的種子接種在含6-BA 不同濃度（ 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L ）的 MS 培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌苗誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種10 個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶放 5 粒種子。（ 25 2）黑暗培養(yǎng) 30 d 后，統(tǒng)計(jì) 6-BA 不同濃度處理下出苗率（出苗率 =萌發(fā)外植體數(shù) / 接種外植體數(shù) 100%）。1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)以 MS 培

5、養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基， 設(shè)置不同激素組合的處理，共 8 種培養(yǎng)基（見表 1 中 A1A8 號培養(yǎng)基）。將無菌苗接種于這些培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶 3 個(gè)外植體。（25 2）光照培養(yǎng)（光照時(shí)間12 h/d ，光照度 1 000 lx） 45 d 統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。表 1 繼代增殖培養(yǎng)基編號培養(yǎng)基 A1MS+0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A2MS+0.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A3MS+1.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A4MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A5MS+2.0 mg/L 6-BA+0.0 m

6、g/L NAA A6MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A7MS+3.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A8MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA1.2.4 多倍體誘導(dǎo)將生長良好的幼嫩叢生芽接入抽濾滅菌的秋水仙素溶液中，搖床振蕩培養(yǎng)。試驗(yàn)采用2 因素3 水平 L9（ 32）正交試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為50 r/min，培養(yǎng)溫度設(shè)定為24 ，光照24 h/d ，光照強(qiáng)度為1 000 lx。處理完畢后轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。1.2.5 多倍體鑒定取出

7、小叢生芽塊，放入卡諾氏固定液（無水乙醇冰乙酸體積比3 1）中， 0 固定 1 周后，將小叢生芽塊取出放到載破片上，用鑷子搗碎小叢生芽塊，用改良寶品紅染色液染色12 min ，蓋上蓋破片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。根據(jù)染色體數(shù)確定加倍處理材料的倍性。2 結(jié)果與分析2.1 切種方式對種子出苗的影響從表 3 可知，沿背腹線縱切成半的種子出苗率最高（325%），橫切成半的次之， 不切半的種子出苗率最低（ 75%）；縱切成半的種子平均出苗天數(shù)最短（ 15 d），不切半的種子平均出苗天數(shù)最長（35 d）。表明縱切種子能加快種子出苗，其原因可能是縱切處理使種子的胚暴露于培養(yǎng)基中，胚無種皮限制而得以直接從培養(yǎng)

8、基中吸收養(yǎng)分而快速生長；橫切可能破壞了胚的完整性或沒有使胚完全暴露于培養(yǎng)基中而對種子出苗沒有太大影響。2.26-BA 濃度對種子出苗的影響消毒好的種子沿背腹線縱切成半，接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 15 d 左右種子便開始萌發(fā)，繼續(xù)培養(yǎng)15 d 后無菌苗高度可達(dá) 2 cm 左右（圖 1）。由表 4 可知， MS 培養(yǎng)基添加6-BA后能提高種子出苗率。隨著 6-BA 濃度升高， 種子出苗率呈先升高后下降的趨勢。 當(dāng) 6-BA 濃度為 1.0 mg/L 時(shí)出苗率最高，為 60%。2.3 繼代增殖培養(yǎng)基篩選由表5 可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加6-BA 時(shí)， NAA處理的無菌苗增殖系數(shù)均為 1；當(dāng) 6-BA 濃度一

9、定時(shí)， 添加 0.3 mg/L NAA 與不添加 NAA 的相比， 無菌苗增殖系數(shù)均有所提高； 當(dāng)NAA 濃度一定，隨著6-BA 濃度升高，無菌苗增殖系數(shù)先上升后下降，當(dāng)6-BA 濃度為 2.0 mg/L 時(shí)無菌苗增殖系數(shù)最高（ 5.70）。無菌苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后其基部可分化出白色的不定芽（圖 2）；對不定芽繼代增殖后，能得到數(shù)目眾多的叢生芽，這些叢生芽具有分化成完整植株的能力。2.4 秋水仙素對叢生芽多倍體誘導(dǎo)的影響秋水仙素濃度越低，叢生芽死亡率也越低（表6）。0.1%的秋水仙素處理下的叢生芽死亡率低，0.5%的秋水仙素處理過的叢生芽死亡率最高。0.1%的秋水仙素處理的叢生芽

10、雖然有較低的死亡率，但并未得到加倍的叢生芽；0.5%的秋水仙素處理過的叢生芽得到了2 塊加倍的叢生芽；0.3%的秋水仙素處理叢生芽后得到加倍的叢生芽塊數(shù)最多，其中以處理24h 的效果較好，誘導(dǎo)率為12%。同一濃度的秋水仙素在不同時(shí)間處理下多倍體誘導(dǎo)率并未呈現(xiàn)常見的先上升后下降趨勢，其原因可能是高濃度的秋水仙素對叢生芽的傷害大，使得存活下來的叢生芽數(shù)減少，并且生活力下降，從而使檢測到加倍的叢生芽塊數(shù)相應(yīng)很少。2.5 多倍體鑒定對三葉木通正常的根尖和叢生芽進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，得出正常的三葉木通染色體數(shù)2n=2x=16，為二倍體（圖3），這與熊大勝等得出的結(jié)果4 一致。成功加倍成多倍體的叢生芽染色體數(shù)為

11、2n=4x=32，為四倍體（圖4）。這說明用秋水仙素誘導(dǎo)三葉木通獲得多倍體的方法是有效的。3 結(jié)論與討論沈國林等以三葉木通葉片、莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，但污染率高5 。本試驗(yàn)選用三葉木通幼嫩種子為外植體，建立三葉木通組織培養(yǎng)體系。選用幼嫩種子為外植體具有材料多 （1 個(gè)果實(shí)約有種子150 200 粒）、污染率低（幼嫩種子在果實(shí)里處于一種相對無菌的環(huán)境）等優(yōu)勢。繼代增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，篩選合適的增殖培養(yǎng)基才能達(dá)到離體快繁目的6 。在無菌苗的繼代增殖過程中，6-BA 和 NAA 組合是常用的激素組合7-8 。在三葉木通無菌苗繼代增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用NAA 不能使無菌苗增殖，單獨(dú)使

12、用 6-BA 可以使無菌苗增殖， 附加 NAA 后增殖系數(shù)提高，表明 6-BA 在三葉木通繼代增殖培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用。叢生芽結(jié)構(gòu)完整、材料幼嫩，可直接形成小植株，而且成苗率高，經(jīng)化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)處理后，易于獲得純的多倍體植株，所以本試驗(yàn)采用了叢生芽作為誘導(dǎo)材料。秋水仙素是常用的化學(xué)誘變劑，通過抑制紡錘體微管的形成而導(dǎo)致染色體不能移向細(xì)胞兩極從而產(chǎn)生多倍體。秋水仙素對不同的植物和植物不同部位的誘導(dǎo)所需要的濃度和處理時(shí)間不同。三葉木通為木質(zhì)藤本，對秋水仙素處理的濃度要求較高，在本試驗(yàn)中體現(xiàn)在 0.1%的秋水仙素處理叢生芽 24、 48、 72 h 均未檢測到多倍體細(xì)胞。雖然較高濃度秋水仙素處理過的叢生

13、芽存活率小，但憑借其快速增殖的優(yōu)勢，能獲得大量的加倍的叢生芽。三葉木通多倍體的研究國內(nèi)僅見熊大勝等用秋水仙素處理種子和幼苗的報(bào)道 9-10 。熊大勝等對加倍誘導(dǎo)的材料只進(jìn)行了生理學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定。目前流式細(xì)胞儀能用于鑒定植株的倍性 11-12 ，使得常規(guī)誘導(dǎo)多倍體方法有了可靠的鑒定方法。但組培技術(shù)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合的離體培養(yǎng)誘導(dǎo)法已成為一種最常用的染色體加倍方法。離體培養(yǎng)誘導(dǎo)法與常規(guī)的誘變育種方法相比，具有明顯的優(yōu)越性。首先在組織培養(yǎng)條件下可以反復(fù)大批量地在培養(yǎng)瓶中處理植物愈傷組織、叢生芽，提高多倍體誘導(dǎo)的成功率；其次由于組織培養(yǎng)技術(shù)不受節(jié)氣等自然調(diào)節(jié)的影響，可以大大縮短誘導(dǎo)時(shí)間，并在短期內(nèi)快速鑒

14、定出大批量株系，繁殖大量試管苗。本試驗(yàn)從種子無菌材料的獲得、無菌苗的誘導(dǎo)、繼代增殖培養(yǎng)及叢生芽多倍體誘導(dǎo)過程中建立了三葉木通無菌苗的組織培養(yǎng)體系，進(jìn)行了三葉木通多倍體誘導(dǎo)和鑒定研究，可為三葉木通多倍體育種奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1 貴州植物志編輯委員會 .貴州植物志 （第二卷） M. 貴陽：貴州人民出版社，1985： 141-142.2 劉倫沛，錢增秀 . 三葉木通果中主要營養(yǎng)成分含量的測定 J. 黔東南民族師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2002，20（ 6）：39-41.3 王曄，魯靜，林瑞超 .三葉木通藤莖的化學(xué)成分研究 J.中草藥， 2004， 35（ 5）： 495-498.4 熊大勝，朱金桃，李

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