中藥制劑分析

1、幻燈片 1中藥制劑分析第一章緒論中藥制劑分析是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代分析理論和方法研究中藥制劑質(zhì)量的一門應(yīng)用學(xué) 科。第一節(jié)概述一、中藥制劑分析的對(duì)象中藥制劑分析的對(duì)象應(yīng)該是制劑組方中起主要作用的 有效成分、毒性成分、或影響療效的化學(xué)成分，對(duì)其做出 定性、定量等各方面的評(píng)價(jià)?；脽羝?2二、中藥制劑分析的特點(diǎn) 一）中藥制劑分析的對(duì)象是復(fù)雜的混合物。1. 組成中成藥的中藥材具有復(fù)雜性。 中藥材的同名異物，同物異名現(xiàn)象普遍存在。有的中藥更由于形態(tài)相似，容易誤用。2. 中成藥化學(xué)成分的多樣性、復(fù)雜性。 11）由多味中藥組成的復(fù)方制劑，其化學(xué)成分極為復(fù)雜多樣。2）各種化學(xué)成分在中藥中的含量相差懸殊。

2、3）中藥制劑由多種單味藥材組成，所含化學(xué)成分相互影響。3. 中成藥的劑型繁多，所用之輔料多種多樣，在測(cè)定前，樣品必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理，以排除各種輔料的干 擾，必要時(shí)還須進(jìn)行輔料的檢查和測(cè)定。4. 工藝各異，很多在單味中藥鮮品中存在的化學(xué)成分，經(jīng)過(guò)炮制或制備工藝中經(jīng)加熱處理后已不復(fù)存 在，或在制備過(guò)程中因揮發(fā)、分解、成鹽（ 沉淀 ）反應(yīng)等增加了中成藥分析工程的困難?；脽羝?3 二）首先進(jìn)行組方分析，隨方?jīng)Q定測(cè)定主藥，選擇合適的檢測(cè)指標(biāo)，是目前質(zhì)量分析方法的特點(diǎn)之一。 在進(jìn)行質(zhì)量分析時(shí)首先以中醫(yī)理論和用藥原則為指導(dǎo)，進(jìn)行組方分析，按功能主治分出主、輔、從、 次藥味和藥群，選擇某合適的化學(xué)成分為指標(biāo)來(lái)說(shuō)明

3、其與質(zhì)量的關(guān)系?；脽羝?4三、影響中藥制劑質(zhì)量的因素 （ 一 ） 原料藥材的品種、規(guī)格、產(chǎn)地、藥用部位、采收季節(jié)、加工方法的影響 （ 二 ） 炮制方法的影響 （三）生產(chǎn)工藝的影響（ 四 ） 中藥制劑的包裝、貯藏、保管的影響幻燈片 5四、中藥制劑質(zhì)量控制的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 一）國(guó)外藥物分析發(fā)展趨勢(shì) 基本的方法主要為：分離分析法、電化學(xué)法、光譜法和聯(lián)用分析方法等。各種色譜及其聯(lián)用技術(shù)已成為占主導(dǎo)地位的常規(guī)分析方法，如HPTLC HPLG GC HPCE LC-MS聯(lián)用等。體內(nèi)藥物分析研究，趨向于采用在線的聯(lián)用微透析分析技術(shù)，如on-lineMD-CE、on-lineMD LC等。手性藥物作為化學(xué)藥物

4、的特殊群體，以HPLC和CE為主要拆分手段的手性藥物分析方興未艾，已成為全世界藥物分析的研究熱點(diǎn)。幻燈片 6 二）國(guó)內(nèi)中藥制劑分析現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)1、國(guó)內(nèi)中藥制劑分析現(xiàn)狀1) 光譜法的應(yīng)用A比色法如丹參素/丹參注射液，阿魏酸/當(dāng)歸浸膏-定量B紫外-可見(jiàn)分光光度法單波長(zhǎng)法如蒽醌 / 何首烏，香豆素 / 祖師栗膏 - 定量； 雙波長(zhǎng)法靛藍(lán)、靛玉紅 / 喉痛消炎丸 - 定量；三波長(zhǎng)法小檗堿 / 三黃片 - 定量；一階導(dǎo)數(shù)光譜法綠原酸 / 感冒咳嗽沖劑，麻黃堿 /哮喘丸 - 定量 二階導(dǎo)數(shù)光譜法膽酸 /清宮沖劑，血竭 /七厘散 - 定量； 三階導(dǎo)數(shù)光譜法氫溴酸東莨菪堿 / 中麻 2 號(hào)注射液 - 定量。

5、等 幻燈片 7C熒光法丹參素/丹參注射液D紅外分光光度法- 體、 - 體 / 山道年；番木鱉堿、馬錢子堿 / 馬錢子E 質(zhì)譜法F 核磁共振光譜法2) 色譜法的應(yīng)用A 紙色譜法已較少應(yīng)用；B 薄層色譜法應(yīng)用廣泛；C棒狀薄層色譜法小檗堿/復(fù)方黃柏制劑、人參皂甙 /人參、膽酸和去氧膽酸/熊膽-定量；D 氣相色譜法揮發(fā)性成分定量冰片 /復(fù)方丹參片 /牛黃解毒丸 / 冠心蘇合丸等； 厚樸酚、和厚樸酚 /藿香正氣水，麻黃堿 / 葛根湯； 幻燈片 8E高效液相色譜法應(yīng)用廣泛，以反相HPLC為主；黃連素/半夏瀉心湯，紅景天甙/紅景天口服液，甘草酸/千金升白沖劑等。3) 電化學(xué)分析法的應(yīng)用A 庫(kù)侖法B 電位法藥

6、物電極測(cè)定法和電位溶出分析法4) 其他A原子吸收光譜法和冷原子技術(shù)B 原子發(fā)射光譜CX射線分析法目前，中藥體系存在的突出問(wèn)題具體表現(xiàn)在： (1) 定量分析指標(biāo)與其主要藥效作用間缺乏相關(guān)性； (2) 與化學(xué)藥物相比，中藥是一個(gè)由多成分、多因素構(gòu)成的復(fù)雜體系，目前還沒(méi)有建立起一套有效的中藥 復(fù)雜體系定量分析標(biāo)準(zhǔn)?；脽羝?92。國(guó)內(nèi)中藥制劑分析發(fā)展趨勢(shì)(1) 中藥有效成分的篩選與確定；應(yīng)用仿生學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的理論和進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)，從 分子、基因、受體、組織和整體水平系統(tǒng)準(zhǔn)確地確定中藥復(fù)雜體系中的藥效物質(zhì)；(2) 中藥有效成分的提取與分析；中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，而且有效成分也具有相對(duì)性。為

7、了高效率地提取中藥有效成分，應(yīng)用各種現(xiàn)代提取技術(shù)，如SFE、SWE UAE等，可用于中藥復(fù)雜體系中有效成分的提取，利用準(zhǔn)確的儀器分析方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)，通過(guò)因子分析方法對(duì)中藥復(fù)雜體系進(jìn)行定性定量評(píng) 價(jià)；(3) 中藥藥效物質(zhì)與中醫(yī)藥理論相關(guān)性研究； 利用現(xiàn)代分析方法研究中藥復(fù)雜體系中藥效物質(zhì)與中醫(yī)藥 理論的定量關(guān)系，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，闡明其作用機(jī)制，在此基礎(chǔ)上對(duì)中藥及其復(fù)方進(jìn)行全面質(zhì)量 控制?；脽羝?10第二節(jié)中藥制劑分析工作的基本程序 中藥制劑分析程序一般可分取樣、測(cè)試樣品溶液的制備和測(cè)定（包括定性鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定） 等。一、取樣 1供試品要具有代表性：原則是均勻、合理。2嚴(yán)格按照規(guī)定

8、的取樣方法進(jìn)行取樣：一般應(yīng)從每個(gè)包裝的四角和中央五處取樣，深度可達(dá)1/32/3處。取得的樣品裝入清潔、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批號(hào)、數(shù)量、取 樣日期及取樣人。3抽取供試品的數(shù)量：各類中藥制劑取樣大致是至少夠3 次檢驗(yàn)的用量。貴重藥品可酌情取樣。粉狀制劑（散劑、顆粒劑）一般取樣ioog，可從包裝的上、中、下三層及周圍間隔相等部位取樣若干，將所得樣品混勻，按四分法從中取出所需供試量?；脽羝?11液體制劑（口服液、藥酒、糖漿、酊劑等）一般取樣200ml。同時(shí)須注意均勻取樣。固體中成藥（丸劑、片劑）成品取樣一般為100g，壓片后取樣200片。丸劑一般取10丸。膠囊劑稱取不少于

9、 20 個(gè)膠囊，傾出其中的藥料，稱定空膠囊的重量，由總重中減去，即為膠囊內(nèi)藥料 的重量。依標(biāo)示量及供試量稱取部分藥料供分析。一般取樣量為100g。注射液的取樣，灌注、熔封，滅菌前后應(yīng)經(jīng)過(guò)兩次分析。灌封前將注射液混合均勻，如液體取樣原則 取樣，再按標(biāo)示量及供試量分別取部分進(jìn)行檢驗(yàn)；經(jīng)滅菌后的注射液須按原來(lái)的方法進(jìn)行分析檢驗(yàn)。已封好的安瓿，取樣量一般為 200支。其它劑型的中成藥，可根據(jù)具體情況隨意抽取一定數(shù)量，作為隨機(jī)抽樣。 供試樣品檢驗(yàn)完畢，應(yīng)保留一半數(shù)量作為留樣觀察?；脽羝?12二、測(cè)試樣品溶液的制備 中藥制劑測(cè)試樣品溶液的制備一般分為提取、分離、凈化等過(guò)程。1. 中藥制劑樣品的提取冷浸法，

10、 61020 倍藥重溶劑，稱重，浸泡 122448 小時(shí)，稱重 , ，等分取樣或取總樣測(cè)定。適宜遇熱 不穩(wěn)定的有效成分； 連續(xù)回流法，樣品置索氏提取器中，利用溶劑反復(fù)提取，提取效率高，溶劑少，遇熱不穩(wěn)定的有效成 分不宜用此法；超聲波提取法，樣品置容器中，溶劑提取，效率高，一般樣品30min 內(nèi)即可完成。幻燈片 132中藥制劑樣品的預(yù)處理液- 液萃取法 :溶劑直接萃取、離子對(duì)萃取，操作繁，易乳化。 沉淀法：采用某些試劑沉淀雜質(zhì)或沉淀待測(cè)成分。蒸餾法：利用待測(cè)成分或其分解產(chǎn)物具有揮發(fā)性的特點(diǎn)，采用蒸餾法、收集餾液進(jìn)行含量測(cè)定，必須 明確測(cè)定成分的結(jié)構(gòu)才可用此法。色譜法（液 - 固萃取法） ，常用凈

11、化劑有三氧化二鋁、氧化鎂、硅膠、活性炭、大孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù) 脂、硅藻土、鍵合相硅膠 C18、 C8 等。其中離子交換樹(shù)脂、硅藻土、鍵合相硅膠C18、C8等目前有較多商品預(yù)處理柱，使用方便，操作簡(jiǎn)單，凈化效率高?；脽羝?14三、定性鑒別、檢查和含量測(cè)定1定性鑒別1）性狀鑒別系指中成藥的形狀、顏色、氣味等，凡藥典收載品，在藥典中均有規(guī)定，可按要求進(jìn)行檢 查。2）顯微鑒別因?yàn)楹兄兴幵鄣闹谐伤幘Ａ糁兴幉牡娘@微特征?？梢酝ㄟ^(guò)這些特征，對(duì)中成藥進(jìn)行 定性鑒別。3）理化鑒別藥典中常用的方法有：熒光法、顯色法、沉淀法、微量升華法；紙色譜法、薄層色譜、液 相色譜、氣相色譜等。中藥定性鑒別應(yīng)選擇其中主藥（

12、君藥） 、輔藥（臣藥）作為主要對(duì)象，其次應(yīng)鑒別毒劇藥及貴重藥材。 幻燈片 152檢查 按我國(guó)藥典要求，中藥制劑需要檢查的項(xiàng)目大致可分為三類：1）污染型中成藥一般雜質(zhì)檢查項(xiàng)目有：異物、灰分、酸不溶性灰分、重金屬、砷鹽等；衛(wèi)生學(xué)檢查： 微生物細(xì)菌檢查；以及有的產(chǎn)品要求農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。2）特殊雜質(zhì)型原料藥材摻假、有毒成分的限量檢查。3）劑型的要求檢查類型（制劑通則要求檢查項(xiàng)目） 中成藥一般質(zhì)量要求的檢查有：揮發(fā)油測(cè)定、水分測(cè)定（固體制劑） 、乙醇含量測(cè)定、總固體、相對(duì)密 度、pH值（酊劑、藥酒）、裝量差異（片重差異）、崩解度（片劑、膠囊劑）、熔點(diǎn)測(cè)定、旋光度測(cè)定等。 幻燈片 16 3含量測(cè)定 中成

13、藥含量測(cè)定所采用的方法除經(jīng)典的重量法、容量法（ 包括中和法、容量沉淀法、絡(luò)合滴定法、氧化還原法及非水溶液滴定法等 ） 外，還可采用電位法、庫(kù)倫滴定法、比色法、可見(jiàn) - 紫外分光光度法、紅 外分光光度法、液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、雙波長(zhǎng)薄層掃描法等。1）對(duì)有效成分明確的中藥制劑要進(jìn)行有效成分的含量測(cè)定。2）大致明確有效成分，要求測(cè)定這些成分的總量。3）對(duì)有效成分已知但無(wú)理想的測(cè)定方法的中藥制劑，可通過(guò)測(cè)定其中某些化學(xué)成分的含量間接控制有 效成分的含量。4）對(duì)有效成分不明確的中藥制劑可采用以下方法：選擇可能的有效成分或主要成分（指示性成分）進(jìn) 行含量測(cè)定；測(cè)定藥物的總固體

14、量；選擇在原料加工炮制時(shí)或制備、貯存過(guò)程中易損失、破壞的成分 進(jìn)行含量或限量測(cè)定。5）中藥制劑中含有劇毒性成分則要測(cè)定其含量。6）貴重藥材在制劑中投料量應(yīng)加以測(cè)定?；脽羝?17第二章中藥制劑定量分析方法 第一節(jié)可見(jiàn) - 紫外光譜法 一、單一物質(zhì)的定量定量依據(jù)是Beer-Lambert定律，A=IC。測(cè)定單一物質(zhì)時(shí)，先測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，然后選擇最大吸收 峰的波長(zhǎng)max進(jìn)行定量分析。一個(gè)物質(zhì)若有幾個(gè)吸收峰時(shí)，可選擇吸收峰較高，在此吸收峰處吸光度隨波長(zhǎng)變化較小，并且其它物 質(zhì)無(wú)吸收的波長(zhǎng)作為定量條件。一般不選擇光譜最左邊的末端吸收峰作定量測(cè)定的波長(zhǎng)。常用定量方法：1. 對(duì)照法C樣=C標(biāo)A樣/A標(biāo)；

15、C標(biāo)A樣/（ A標(biāo)C樣）=樣品% C樣和C標(biāo)分別為樣品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品濃 度， C 樣為樣品標(biāo)示濃度。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法：從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度 -濃度曲線求得樣品濃度。 幻燈片 18二、混合物的含量測(cè)定一）混合物中有 a, b兩種組分，若兩者的最大吸收峰不重合，且在a的1max處，b無(wú)吸收；在b的2max處，a無(wú)吸收?？煞謩e在 1max、2max處用單一物質(zhì)的定量方法從混合物中測(cè)定a、b的濃度。二）混合物中有 a，b兩種組分，吸收光譜部分重疊，在 a的1處，b無(wú)吸收；在b的2處，a有吸收。 先在2處測(cè)定總吸收 Aa+b,再在1處測(cè)定Aa1;先從Aa1直接求出a的濃度，根據(jù)a的濃度求出Aa2。 再?gòu)腁a+b

16、減去Aa2后求得Ab2，就可求得b的濃度?；脽羝?19（三）雙波長(zhǎng)測(cè)定法中藥制劑分析中常用的方法為等吸收波長(zhǎng)法和系數(shù)率法。1 等吸收波長(zhǎng)法1 ）基本原理根據(jù)左圖選出兩個(gè)波長(zhǎng) 1 與 2，其選擇原則是干擾組分 a 在 1 與 2 處吸收度相等，即Aa仁Aa2。而待測(cè)組分 b在1與2處的差吸收度A應(yīng)比較大，再在1與2處測(cè)混合組分溶液的差吸度 A。設(shè) 1 為參比波長(zhǎng)， 2為測(cè)量波長(zhǎng)，則等吸收波長(zhǎng)法原理示意圖 A=Aa+b2-Aa+b1=（Aa2+Ab2） -（Aa1+Ab1）=Ab2-Ab1= （b2-b1 ） CbL幻燈片 202）應(yīng)用舉例喉痛消炎丸中靛藍(lán)、靛玉紅的測(cè)定i）選擇等吸收波長(zhǎng)：用28g

17、/ml的靛藍(lán)及靛玉紅的氯仿溶液在分光光度計(jì)上掃描，并用同 法掃描出空白樣品溶液的吸收曲線。從左圖可知靛藍(lán)在 540nm、 634.4nm 處有合適的等吸收波長(zhǎng)；靛玉紅卻是在514. 2nm和566nm處有等吸收波長(zhǎng)，而空白樣品液在上述波長(zhǎng)處的吸收曲線幾乎成一條直線、不干擾測(cè)圖 2-1-3 靛藍(lán)、靛玉紅的吸收曲線（1）靛藍(lán) 靛玉紅 無(wú)青黛樣品定，選取靛藍(lán)的測(cè)定波長(zhǎng)s1 = 566nm參比波長(zhǎng)R仁514.2nm?？蛇x靛玉紅的測(cè)定波長(zhǎng)s2=540nm 參比波長(zhǎng) R2=634.4nm?；脽羝?21ii ）標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取靛藍(lán)對(duì)照品溶液0.25、0.50、2.0ml ;靛玉紅對(duì)照品溶液 0.20、0.

18、40、1.40ml ，分別放入 10ml 量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，分別在上述等吸收波長(zhǎng)處測(cè)其差吸收度：A1=A566nm-A514.2nm；A2=A540nm-A634.4nm；然后用A對(duì)C作標(biāo)準(zhǔn)曲線；并求出其一元回歸方程：A1= 0.02241 C1（r1 = 1.0000）A2= 0.04060 C2+0.0055（r2 = 1.0000）iii）含量測(cè)定：精稱喉痛消炎丸細(xì)粉約 0.2g于索氏提取器中，用氯仿提取至無(wú)藍(lán)色，用氯仿定容于50ml 量瓶中，再精密吸取 5ml置10ml量瓶中，加氯仿至刻度即為樣品溶液。將樣品溶液在s1與R1，處測(cè)出A樣1值，用以上A1式求出靛藍(lán)的濃度及樣品中靛

19、藍(lán)的含量。同樣，在s2與R2處測(cè)出A樣2,用以上A2式求出靛玉紅的濃度及樣品中靛玉紅的含量。2聯(lián)立方程法 Aa+b1=Aa1+Ab1=a1CaL+b1CbL Aa+b2=Aa2+Ab2=a2CaL+b2CbL 幻燈片 22（四）三波長(zhǎng)測(cè)定法 此法要求在任一吸收曲線上，能找出滿足下述條件的三個(gè)波長(zhǎng)：即在干擾組分的吸收曲線上，與三個(gè) 波長(zhǎng)相應(yīng)的點(diǎn)，能在一條直線上。1基本原理 左圖中 1、2、 3 為在任一吸收曲線上，任意 選擇的三個(gè)波長(zhǎng)。 A1、A2、A3 為在三個(gè)波長(zhǎng)處 分別測(cè)出的吸收度。根據(jù)相似三角形的等比性質(zhì)，可推導(dǎo)出下式， A=A2- （mA1+ nA3 / （ m+rj）=2 -（ m1

20、+ r3 / （ m+r） CL三波長(zhǎng)分光光度法的原理說(shuō)明厶A與待測(cè)組分濃度 C成正比?；脽羝?23 2應(yīng)用舉例 二陳丸中陳皮甙的測(cè)定1）總干擾組分的制備及其吸收光譜1 ）除去陳皮甙后，陳皮其他組分提取液的制備：用溶劑（含0.1 %氫氧化鈉的75%乙醇液）提取陳皮粉，提取液經(jīng)薄層分離，刮取除陳皮甙以外的所有斑點(diǎn)洗脫，得除陳皮甙以外陳皮其他組分提取液（I） 。ii ）二陳丸空白粉提取液的制備：按處方比例 配制除陳皮以外的二陳丸空白粉，用上述溶 劑提取，得二陳丸空白粉提取液（n）。將、（n）按處方比例混合，得二陳丸總干 擾成分液（川）。分光光度計(jì)分別測(cè)定陳皮甙對(duì) 照品和（川）的吸收光譜。見(jiàn)左圖。其

21、他成分對(duì) 陳皮甙的測(cè)定有干擾，用6批不同來(lái)源的原料按上法制備（川），并測(cè)其吸收光譜，結(jié)果譜形相似?？刹捎萌ㄩL(zhǎng)法消除干擾?；脽羝?242 ）選擇三個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)作圖法粗選，再計(jì)算精選在 （川）的A=0處，即為精選的三個(gè)波長(zhǎng)：入仁318.0nm,入2=286.0nm，入3=275.0rm。3 ）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制不同濃度的陳皮甙對(duì)照品溶液，在選出的三個(gè)波長(zhǎng)處，分別測(cè)定吸收度，并算出厶A值，對(duì) A值與濃度C進(jìn)行直線回歸，回歸方程為： A=9.9059C - 0.0024（r=0.9990）4）樣品測(cè)定精密稱取二陳丸細(xì)粉約0.1g，加100.0ml上述溶劑浸泡提取 15小時(shí)，過(guò)濾，取續(xù)濾液2.0ml ,用溶劑

22、稀釋至5.0ml，在選出的三波長(zhǎng)處，分別測(cè)定吸收度，計(jì)算其厶A值，再按回歸方程算出陳皮甙含量。本法平均回收率： 98.28 %, RSD： 2.12%?；脽羝?25（五）差示光譜法1 基本原理 差示光譜法的關(guān)鍵有二,其一,提供一個(gè)近似理想的參比溶液。其二,使待測(cè)組分發(fā)生特征光譜變化, 而賦形劑或其他共有組分卻不引起光譜變化,因而可消除它們的干擾。設(shè)Ax、Ay分別代表兩種不同介質(zhì)中待測(cè)組分在測(cè)定波長(zhǎng)處的吸收度，Az代表背景和干擾組分的吸收度，其不受測(cè)定介質(zhì)改變的影響。根據(jù)吸收度加和性原理,則 A=A樣-A 參=(Ax+Az)-(Ay+Az)=Ax-Ay=(e x- e y)CL 差示光譜中的振幅

23、，即最大吸收與最小吸收之差值，也可進(jìn)行定量測(cè)定，這可提高本法的專屬性。幻燈片 262應(yīng)用舉例 差示光譜法測(cè)定含牛黃的中成藥中膽紅素的含量 1)測(cè)定原理膽紅素具有高度共軛體系結(jié)構(gòu)，在波長(zhǎng)453nm 處為最大吸收，在可見(jiàn)光照射下膽紅素易氧化成藍(lán)色產(chǎn)物，在 453nm處吸收度顯著降低。2) 選用日光下照射 30分鐘或在紅外燈下照射 4小時(shí)測(cè) A值。3) 精密稱取膽紅素 2mg于50ml棕色量瓶中， 加入適量冷(10 C以下)的酸性氯仿(150ml氯 仿中含 0.05ml 濃鹽酸 ) ，于冰水浴中超聲振蕩 20 分鐘，稀釋至刻度，制成儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取 0， 4、08、1， 2、1.6 、2.0ml 儲(chǔ)

24、備液于 10ml 量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，測(cè)其光照前后在453nm處的吸收度?；貧w方程膽紅素在酸性氯仿溶液中的吸收光譜為A=0.0804C+0.00570(r=0.9995)。a光照前b.光照后除光照反應(yīng)外，其余操作均需避光?；脽羝?274 )分別制得六應(yīng)丸、六神丸、牛黃消炎丸的空白樣品對(duì)照液，在453nm處測(cè)得各自光照前后的A值,計(jì)算 A。實(shí)驗(yàn)表明三種成藥 A值為零或幾乎為零。說(shuō)明其他干擾組分在以上光照條件下不干擾膽紅 素的測(cè)定。5) 精密稱取六應(yīng)丸、六神丸各60mg牛黃消炎丸120mg置10ml帶塞的試管中，準(zhǔn)確加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振蕩20分鐘，過(guò)濾，棄去初濾液，測(cè)續(xù)濾液光

25、照前后的A值，算出 A值。由回歸方程算得樣品的含量。本法加樣回收率：六應(yīng)丸為98.8 %, RSD=1.8% ;六神丸為100.7 %, RSD=2.2% ;牛黃消炎丸為 93.0 %, RSD= 1.1 %?；脽羝?28(六) 導(dǎo)數(shù)光譜法1 導(dǎo)數(shù)光譜及其特征通常的吸收光譜,其吸收度是波長(zhǎng)的函數(shù)A=C- E=C-(入)。對(duì)波長(zhǎng)求導(dǎo)，將其微分系 數(shù)(dnA/d入n入)對(duì)波長(zhǎng)掃描可得導(dǎo)數(shù)光 譜圖。特征：(1) 導(dǎo)數(shù)光譜的階數(shù)愈高,峰形愈尖銳且數(shù)量亦增多。(2) 在零階光譜的極大處,其相應(yīng)的奇階光 譜通過(guò)零點(diǎn)。在零階光譜的兩拐點(diǎn)處,奇階 導(dǎo)數(shù)光譜為極大或極小。(3) 偶階導(dǎo)數(shù)光譜的形狀與零階光譜類似

26、, 零階光譜的峰值對(duì)應(yīng)于偶階導(dǎo)數(shù)光譜的極值, 零階光譜的拐點(diǎn)在偶階導(dǎo)數(shù)光譜中通過(guò)零點(diǎn)。(4) 導(dǎo)數(shù)光譜譜帶的極值數(shù)等于導(dǎo)數(shù)階數(shù)加 1。高斯曲線及其一至四階導(dǎo)數(shù)曲線幻燈片 29導(dǎo)數(shù)分光光度的優(yōu)點(diǎn)：a 能檢出兩個(gè)或兩個(gè)以上的重疊吸收帶；b 能分辨在強(qiáng)吸收曲線“肩部”的弱吸收帶；c .能精密確定單一吸收峰位置；d 能消除基線（背景）的影響；e .能進(jìn)行定量測(cè)定。2 基本原理吸收光譜服從 Beer定律：A=C L根據(jù)導(dǎo)數(shù)光譜的定義，對(duì)上式求導(dǎo)，則：dA/d 入=（d & /d 入） CL； d2A/d 入 2= （d2 /d 入 2） CL；dnA/d 入 n= （dn e /d 入 n） CL；式中

27、L為定值，給定物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處的de /d入、d2 e /d入2dn e /d入n也是定值，因此， dA/d入 x C, d2A/d 入 2 * CdnA/d 入 n * C?；脽羝?30常用的定量參數(shù)的選擇方法有：1）峰 - 谷法測(cè)量相鄰峰、谷之間的距離。左圖中的hl h2（振幅，用D表示）。2）基線法取相鄰二同向峰 （ 正或倒 ） 的 公切線為基線,以中間的反向峰峰尖至基線的距離為測(cè)量值。左圖中 p1。3）峰 - 零法測(cè)量峰值到零線間的垂直距離,左圖中 p2。4）面積法根據(jù)一階或二階導(dǎo)數(shù)光譜面 導(dǎo)數(shù)光譜的測(cè)量積,進(jìn)行定量測(cè)定。3 共存組分干擾吸收的消除1 ）一階導(dǎo)數(shù)光譜法消除線性干擾吸收A

28、= e 入 CL+a入 +bdA/d 入=（d e /d 入）CL+a說(shuō)明線性干擾在一階導(dǎo)數(shù)光譜中對(duì)定量參數(shù)D（振幅）沒(méi)有影響，D只與待測(cè)組分濃度成正比。D=（dA/d 入）峰-（dA/d 入）谷=（d e /d 入）峰-（d e /d 入）谷CL幻燈片 312）高階導(dǎo)數(shù)光譜法消除非線性干擾吸收及用于重疊峰的分離,定量 若干擾組分吸收對(duì)波長(zhǎng)呈非線性,為一近似的二次吸收曲線,則總吸收度為A= e 入 CL+e入 2+f 入 +g對(duì)其求一階、二階導(dǎo)數(shù)得：dA/d 入=（d e /d 入）CL+e入 +fd2A/d 入 2= （d2 e /d 入 2） CL+e4. 導(dǎo)數(shù)光譜法中的主要參數(shù)1）微分階

29、數(shù)（n）n的選擇主要由干擾組分吸收曲線的形狀而定。n越大，分辨力愈強(qiáng)，但信噪比將降低。2）波長(zhǎng)間隔（入）入愈大，測(cè)量靈敏度增大，但分辨率降低，通常入選12nm為好。3）中間波長(zhǎng)（入m）通常需選兩個(gè)入m,即入m1、入m2其選擇原則：待測(cè)組分的導(dǎo)數(shù)曲線在入m1、入m2處的形狀易辨認(rèn),較特征；而干擾組分在此處的導(dǎo)數(shù)值相等或相近?；脽羝?325. 應(yīng)用舉例1) 肺露中丹皮酚含量的測(cè)定(i )干擾丹皮酚測(cè)定情況的考察：按處方配比，分別取藥材，加水適量，蒸餾提制成 22 味藥材的模擬液，以 水為空白，分別繪制紫外吸收光譜圖。從圖中看出，牡丹皮蒸提液紫外吸 收很強(qiáng)，枇杷葉和蘆根蒸提液紫外吸收較弱，干擾丹皮酚

30、的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)表明：丹皮酚在堿性溶液中的吸收光譜發(fā)生紅移，入=35 土 2nm。1牡丹皮2 .枇杷葉3.蘆根幻燈片 33(ii) 選擇測(cè)定波長(zhǎng)精取丹皮酚對(duì)照液2ml，枇杷葉和蘆根蒸提液各10ml，分別于25ml量瓶中，加0.1mol/L 氫氧化鈉溶液至刻度，混勻。以 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液為空白，繪制吸收光譜(零階)和一 階導(dǎo)數(shù)光譜，如下圖。按中間波長(zhǎng)選擇原則，選 330 和 370nm為中間波長(zhǎng)，則測(cè)定波長(zhǎng)為328nm和332nm, 368nm和372nmo蒸提液在 0.1mol L 氫氧化鈉溶液中的光譜圖一階導(dǎo)數(shù)光譜圖1. 肺露 2.丹皮酚 3.枇杷葉 4.蘆根 1.丹皮酚 2.枇杷

31、葉 3.蘆根幻燈片 34(iii) 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取丹皮酚對(duì)照液(0.1mg/ml)0.5 、1.0、3.0ml，分別于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，混勻，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，在測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)吸收度，計(jì)算一系列A值。 A=(A328-A332)-(A368-A372)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為： A=-11.08C+0.0009(r=0.9997 )(iv )樣品測(cè)定取同一批號(hào)或不同批號(hào)樣品，分別精密量取10ml于25ml量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液至刻度，混勻，以 0.1mol/L氫氧化鈉溶液為空白，在測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)其吸收度，算出A,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的

32、回歸方程,計(jì)算樣品中丹皮酚含量。本法平均回收率 99.57 , RSD=0.82%?；脽羝?352)清宮沖劑中膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定法(i)干擾情況的考察膽酸對(duì)照液與樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜顯示，在397nm, 386nm波長(zhǎng)處有相應(yīng)的吸收峰和吸收谷。陰性樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜呈近乎平直線條，見(jiàn)下左圖。豬去氧膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜將360420nm區(qū)間的吸收消除為二次無(wú)關(guān)吸收，不干擾樣品中膽酸的含量測(cè)定如下中圖。下右圖表明，膽酸二階導(dǎo)數(shù)光譜，其峰-谷振幅值D與濃度具有良好的線性關(guān)系，因此，可用397nm, 386nm兩波長(zhǎng)的振幅 D為定量參數(shù)，用峰-谷法進(jìn)行測(cè)定。樣品,膽酸對(duì)照品溶膽酸、豬去氧膽酸二對(duì)照品溶液

33、 液二階導(dǎo)數(shù)光譜階導(dǎo)數(shù)光譜二階導(dǎo)數(shù)光譜A.樣品B.膽酸對(duì)照品C.陰性樣品1.膽酸2 .豬去氧膽酸幻燈片 36(i )測(cè)定條件零階光譜掃描波長(zhǎng)：190550nm；二階導(dǎo)數(shù)光譜掃描波長(zhǎng)，360420nm； 入=5nm(i )標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱定膽酸對(duì)照品約30mg,置100ml量瓶中，加入60%醋酸稀釋至刻度，分別精密吸取0.1、0.21.0ml于15ml具塞刻度試管中， 加60%醋酸至1.0ml ,加入稀硫酸14. 0ml,搖勻，70C 水浴中放置 20 分鐘，取出靜置 20 分鐘后，用 1.0ml60 %醋酸加 14.0ml 上述稀硫酸作空白，測(cè)二階導(dǎo) 數(shù)光譜。中間波長(zhǎng) 397nm, 386nm,

34、測(cè)出各峰-谷振幅值D,得回歸方程：D=57.3066C - 0.1547(r=1. 000)(iv )樣品測(cè)定精密稱取約 2.5g樣品粉末加50ml氯仿回流提取4小時(shí)，常壓回收氯仿至干，用 60%醋 酸溶解，定容于 10ml 量瓶中，精密吸取 1.0ml 樣品液于 15ml 具塞刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作， 測(cè)峰-谷振幅值D,按回歸方程計(jì)算樣品中膽酸含量。本法平均回收率： 102.9 %, RSD= 0.6 %?；脽羝?37第二節(jié) 薄層色譜法薄層色譜法 (TLC) 是一種微量的分離分析技術(shù)， 具有設(shè)備簡(jiǎn)單， 檢出靈敏， 測(cè)定快速， 應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。 薄層色譜定量的方法可分為二類，一類是薄層

35、洗脫定量法，將被測(cè)化合物從薄層上洗脫下來(lái)，萃取后， 再選擇適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)定。另一類是在展開(kāi)后的薄層上直接進(jìn)行測(cè)定。一、薄層洗脫定量 1點(diǎn)樣在薄層板的起始線上，將定量的樣品液點(diǎn)成一條狀，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)避免任何損失。在板的兩邊，點(diǎn) 上對(duì)照品作為定位劑，如圖 A,然后，在選好的溶劑中層開(kāi)，斑點(diǎn)要集中，不應(yīng)有拖尾現(xiàn)象。2定位對(duì)本身有顏色的化合物可直接定位，對(duì)有熒光的化合物可在紫外光下觀察定位，對(duì)多數(shù)無(wú)色化 合物不可在薄層上直接噴顯色劑定位，此時(shí)，應(yīng)將待測(cè)組分的薄層部分用玻璃板懸空蓋住后再噴，這 樣可利用兩邊的對(duì)照點(diǎn)顯色定位。幻燈片 38 3捕集、洗脫和測(cè)定定位后，應(yīng)捕集洗脫，若為軟板，可將待測(cè)組分的帶狀區(qū)域

36、用捕集器收集，如圖(B)。若為硬板，可直接用捕集器收集，也可用刀片將樣品區(qū)帶的吸附劑定量地刮下，再用合適溶劑洗 脫后，進(jìn)行定量測(cè)定，如圖 (C) 。幻燈片 39 洗脫溶劑，一般應(yīng)選極性較大，對(duì)待測(cè)化合物溶解度亦較大的溶劑，如乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲 醇等，在單一溶劑洗脫效果欠佳時(shí)，可采用混合溶劑。洗脫方法可采用滲濾法、多次浸出法、加熱溫浸法、索氏回流提取法等。對(duì)不易洗脫的化合物，也可 不經(jīng)洗脫，在吸附劑中加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使其定量反應(yīng)，然后離心或過(guò)濾后再進(jìn)行測(cè)定?；脽羝?40二、薄層上直接定量 薄層上直接定量的方法有目測(cè)法、測(cè)面積法、儀器測(cè)量法。 ，目前，用薄層掃描儀掃描測(cè)定斑點(diǎn)中化合 物含

37、量的方法已成為薄層定量的主要方法，此法也可用于紙色譜、電泳凝膠及其他介質(zhì)的色譜。( 一 ) 測(cè)定原理與方法1吸收測(cè)定法(1)Kubelka-Munk 原理及方程：當(dāng)強(qiáng)度為 I0 的單色光照射到厚度為 X 的薄層后，其情況如下圖所示。 I0為入射光強(qiáng)度i (x)為x處的透射光強(qiáng)。j (x)為x處的反射光強(qiáng)。X為固定相厚度。幻燈片 41Kubelka-Munk指出，當(dāng)強(qiáng)度為I0的單色光照射到厚度為X的薄層后，光的反射和透射符合下述微分方 程：-di/dX=-(S+K)i+Sj dj/dX=-(S+K)j+SiS:單位厚度薄層固定相的散射系數(shù)；K為薄層色譜斑點(diǎn)或單位厚度薄層固定相的吸收系數(shù)；X為由載

38、板表面算起的薄層厚度。i與j的一般解為：i=Asinh(bSx)+Bcosh(bSx)j=(aA-bB)sinh(bSx)+(aB-bA)cosh(bSx)A, B 常數(shù)，a= (S+K /S, b= (a2-1) 1/2 , Sinh= (ex-e-x ) /2 ；Cos=(ex+e-x)/2 ，A/B=a/b。 為討論方便,一般計(jì)算邊界的 i 和 j ,即薄層下表面的透射光和上表面的反射光。X=0 時(shí)，j=0 , i=I0TX=X時(shí)，i=IO , j=IOR則 T=b/asinh （bSX）+bcosh（bSX）R=sinh（bSX）/asinh （bSX）+bcosh（bSX）SX稱作散

39、射參數(shù)，它與薄層厚度、散射系數(shù)有關(guān)。Merck硅膠板的SX=3青島硅膠板SX= 3,日本和光硅膠 F 板 SX=7?；脽羝?42SX數(shù)值大小直接影響薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度-濃度曲線偏離Beer定律的程度。薄層色譜斑點(diǎn)中物質(zhì)的含量包含于a及b兩個(gè)參數(shù)中，已知 a=（ S+K /S，b=（ a2-1）1/2，乘以 X,貝Ua=（ SX+KX） /SXb=KX（2SX+KX） 1/2/SXKX為吸收參數(shù)，相當(dāng)于薄層色譜單位面積中物質(zhì)的含量（g/cm2）,即KX=C幻燈片 43薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度：理想的空白薄層板的 K=0,但一般K0。為消除影響，通常以空白板為基準(zhǔn)，測(cè)定相對(duì)透光率及相對(duì)反 射率來(lái)計(jì)算

40、薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度。透射法 A=-lg （ T/T0 ）反射法 A=-lg （ R/R0）-IgT/TO或-IgR/RO為儀器檢測(cè)部分所獲得的信號(hào)，它們和KX間的關(guān)系曲線相當(dāng)于一般分光光度法中的A-C曲線，在溶液中，A-C曲線為一直線，而在薄層上，-lgT/T0或-lgR/R0和濃度間不呈線性關(guān)系， 比較下圖可以看出彎曲度隨SX增加而增加。不同SX時(shí)，吸光度與 KX間關(guān)系曲線a.透射法測(cè)定-lgT/T0與KX間關(guān)系b.反射法測(cè)定-lgR/R0與KX間關(guān)系幻燈片 44目前對(duì)Kubelka-Munk曲線處理采用兩類方法：曲線校直法和計(jì)算機(jī)回歸法。島津CS系列采用前者，CAMAGZ器采用后者。1. 校正前的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2.校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線校直法是一種簡(jiǎn)便的薄層色譜掃描定量校準(zhǔn)方法，但比較粗糙，且有時(shí)難于知道薄層板的SX的準(zhǔn)確值?；脽羝?452. 熒光測(cè)定法熒光測(cè)定法的定量依據(jù)為：F= $ I0abCF為熒光強(qiáng)度；$為熒光效率；I0為入射光強(qiáng)度；a為吸收系數(shù)；b為薄層厚度；c為樣品濃度。F與C 成正比,二者之間存在線性關(guān)系。熒光測(cè)定法與吸收測(cè)定法不同,其測(cè)量值與斑點(diǎn)形狀無(wú)關(guān)。本身具 有熒光或經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的化合物均可