生化分離技術(shù)主要內(nèi)容

1、生化分離技術(shù)：描述回收生物產(chǎn)品分離過程原理和方法的術(shù)語，是指從動(dòng)植物組織培養(yǎng)液或微生物發(fā)酵液中分離、純化生物產(chǎn)品過程中所采用的方法和手段的總稱。生化分離過程是生物技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力不可缺少的重要環(huán)節(jié)，其技術(shù)進(jìn)步程度對生物技術(shù)的發(fā)展有著舉足輕重作用，為突岀其在生物技術(shù)領(lǐng)域中的地位和作用，常稱它為生物技術(shù)的下游工程。毗t廣誓iWW Flaln4ihar (Hrnvmnraimn m maaarMBraarar ii那產(chǎn)擲j離心介離WpH研荃ft為鼻干Ji結(jié) 豈陽:1生涼曲術(shù)下舒忙寸坦時(shí)陽棘野麻扯牌單元扭中分離純化過程的難點(diǎn)：目的產(chǎn)物在細(xì)胞或反應(yīng)液中含量不高，雜質(zhì)種類多，數(shù)量大；雜質(zhì)性質(zhì)與產(chǎn)物相似；產(chǎn)

2、物穩(wěn)定性不高。生化分離技術(shù)的主要種類：沉淀分離（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性變性沉淀、非離子聚合物沉淀）；膜分離（透析、微濾、超濾、納濾、反滲透）；層析分離（吸附、凝膠、離子交換、疏水、反相、親和層析）；電泳分離（SDS-PAGE、等電聚焦、雙向電泳、毛細(xì)管電泳）；離心分離（低速、高速、超速離心分離技術(shù)） ，生化分離的特點(diǎn)：成分復(fù)雜；含量甚微；易變性 /易被破壞；具經(jīng)驗(yàn)性；均一性的相對性。預(yù)處理需注意的條件： 溫度盡可能低提取液的量要保證充分浸入”加入足量酚類吸附劑加入足量氧化酶抑制劑攪拌轉(zhuǎn)速要恰當(dāng) pH控制在合適范圍，一般 5.571i1版纖F吐JR4+5E 皐，康 ft.山s；2*叵空西-即

3、幵ftWV增報(bào)巧乃世 血妙睥過K事ffl aa 他感曲臓討槌的滸妻細(xì)胞的破碎：用一定方法（機(jī)械/物理/化學(xué)/酶法）打開細(xì)胞壁或膜，使細(xì)胞內(nèi)含物有效釋放出來。 *34堀艷罐碑的方法細(xì)膽的磁碎4I1HM岸機(jī)梟Iff倬剪切 +Tti一-;1超聲at機(jī)昨拌壓力研講旅力1化于M硏*和硏1Hu Rhea空弋希茁從百母淮機(jī).喪曲tit嘩血帥忖忸舟1機(jī)x佯帶相.fitChaikcffFLK擠壓：微生物細(xì)胞在高壓下通過一個(gè)狹窄的孔道高速?zèng)_岀，因突然減壓而引起一種空穴效應(yīng)，使細(xì)胞破碎沉淀：溶液中溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。本質(zhì)：通過改變條件使膠粒發(fā)生聚結(jié)，降低其在液相中的溶解度，增加固相中的分配率。作用：分離、

4、澄清、濃縮、保存廣 業(yè)析/ | 帶機(jī)牡倒況.健廠乂匸臨于華茉佯起班注 1； （ 2）理論塔板數(shù)N盡可能大；（3） k工0 o 對極性組分： 用極性較小溶劑溶解樣品 /上樣 /吸附；用極性較大 的溶劑作洗脫劑。凝膠過濾層析原理：利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用， 據(jù)被分離物分子大小不同進(jìn)行分離 .凝膠過濾層析優(yōu)點(diǎn)：分離條件溫和；樣品回收率高；實(shí)驗(yàn)重復(fù) 性高；操作時(shí)間短，簡便，經(jīng)濟(jì) o 凝膠參數(shù)：排阻極限（用 A 類分子中最小分子量表示） ；工作（分級）范圍（ B 類分子的分子量范圍） o溶質(zhì)洗脫的異常：分配系數(shù)Kd 1 :凝膠對溶質(zhì)分子可能有吸附作用（疏水、親和、靜電作用） 惰性； 穩(wěn)定； 色

5、譜性能好。單體：丙烯酰胺 CH2=CH-CONH2 交聯(lián)劑：N,N -甲叉雙丙烯酰胺CH2=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2型號Bio-Gel p-x中，x范圍：2300其中x=工作范圍上限/1000（二）穩(wěn)定性1 、化性穩(wěn)定pH范圍2112、物性同 Sephadex（三）色譜性能1、 總工作范圍：10040萬2、吸附：離子 I 0.02 mol/L 交聯(lián)丙烯基葡聚糖（ Sephacryl）一）結(jié)構(gòu)單體：烯丙基右旋糖苷 交聯(lián)劑：N,N -甲叉雙丙烯酰胺 凝膠：較硬，強(qiáng)度大型號： Sephacryl S-200， S-300， S-400， S-500， S-1000型號愈高，孔徑

6、愈大，其分子量分離范圍可查表（二）穩(wěn)定性pH 2 11較 Sephadex 抗壓（三）色譜性能工作范圍：10007億吸附性： I 0.05 mol/L瓊脂糖凝膠（ Sepharose）一）結(jié)構(gòu)B -D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結(jié)合所形成的 線性多聚糖糖濃度越大，網(wǎng)孔越小型號：Sepharose 2B 4B、6B表示糖濃度 2%Bio-Gel A 0.5150M 表示工作范圍上限 （二）穩(wěn)定性1 、化性穩(wěn)定pH范圍4.59.02、物性抗熱性：較差，只能在 045 C使用 抗壓性：較好，與濃度有關(guān)凝膠過濾色譜應(yīng)用： . 分離1. 組別分離：A類與B類、B類與C類、A類與C類間2. 分級

7、分離：B類分子間的分離（三）色譜性能總工作范圍：1034X 107 （4000萬）吸附性：I 0.02 mol/L交聯(lián)瓊脂糖（ Sepharose CL-XB ） 結(jié)構(gòu)強(qiáng)堿條件下用 2,3二溴丙醇或環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交聯(lián) 穩(wěn)定性化性：pH 314物性：抗熱、抗壓均提高 色譜性能工作范圍： 同 Sepharose吸附性：下降 . 分子量測定：需先作標(biāo)準(zhǔn)曲線，常用VelgMw凝膠過濾色譜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)：1.高分辨率；2.回收率高（減少峰寬，可提高回收率）；3.減少稀釋；4.短時(shí)間凝膠過濾色譜應(yīng)用舉例：脫鹽；緩沖液交換；測定多聚物的分子量分布；混合物的分級分離；蛋白質(zhì)的復(fù)性離子交換層析 IEC 原理：因溶

8、質(zhì)分子帶不同性質(zhì)電荷和不同電荷量， 變化，從而達(dá)到分離目的的技術(shù)。離子交換劑是離子交換技術(shù)的核心和基礎(chǔ)： 基質(zhì)：母體和骨架，水不溶性化合物 功能基團(tuán)：共價(jià)結(jié)合在基質(zhì)上 反離子 （平衡離子 ）：與功能基團(tuán)帶相反電荷 功能基團(tuán)決定了離子交換劑的基本性質(zhì)：1、功能基團(tuán)的類型決定離子交換劑的類型 功能基團(tuán)是酸性基團(tuán)陽離子交換劑 功能基團(tuán)是堿性基團(tuán)陰離子交換劑2、功能基團(tuán)的解離性質(zhì)決定離子交換劑強(qiáng)弱 強(qiáng)弱不是指可交換分子與交換劑結(jié)合的牢固程度 取決于帶電功能基團(tuán)的 pKa （電離平衡常數(shù) ） 強(qiáng)型及弱型離子交換劑共性：當(dāng)層析pH遠(yuǎn)離pKa時(shí)，無論強(qiáng)型還是弱型離子交換 劑都能牢固吸附可交換分子；陽離子交換

9、劑應(yīng)用時(shí)有 pH 下限，低于此 pH 功能基團(tuán) 開始失去負(fù)電荷，強(qiáng)酸型 pH 下限低于弱酸型； 弱堿型交換劑應(yīng)用時(shí)有 pH 上限，高于此 pH 功能基團(tuán) 開始失去正電荷， 季銨基 （任何 pH 都不會(huì)失去正電荷 ） 型強(qiáng)堿性交換劑無 pH 上限。交換容量 ：指離子交換劑能結(jié)合溶液中可交換離子的能力，常 分為總交換容量和有效交換容量。1、總交換容量 ：指單位質(zhì)量或體積的離子交換劑中已解離或可 能解離的功能基團(tuán)的總量，其數(shù)值大小取決于離子交換劑的取 代程度即電荷密度；基礎(chǔ)參數(shù)：對某種特定交換劑，其數(shù)值恒可在固定相和移動(dòng)相之間發(fā)生可逆交換作用而使溶質(zhì)移動(dòng)速度2、實(shí)際 （有效 ）交換容量 ：指每克干介

10、質(zhì)或每毫升濕膠在一定的 實(shí)驗(yàn)條件下吸附某種分子的實(shí)際容量。 有效交換容量是變值，論及其數(shù)值時(shí)應(yīng)同時(shí)給出實(shí)驗(yàn)條件； 單位：g溶質(zhì)/g IE ; g溶質(zhì)/mL IE 靜態(tài)容量的測定：試管小樣法取若干支試管，分別加入相同體積的已用起始緩沖液 平衡好的離子交換劑；分別加入一系列不同濃度的 Pr溶液，混合振蕩確保充 分吸附；分析上清液中是否含 Pr 成分，據(jù)能使上清液中無 Pr 的最大 Pr 濃度可推算出每毫升離子交換劑能吸附的Pr 的上限，此即為靜態(tài)容量。動(dòng)態(tài)容量的測定 （層析條件下 ） 取一定體積離子交換劑裝柱，用起始緩沖液平衡；特定流速下加樣（樣品濃度1 5mg/mL），不停加樣至 檢測出有 Pr

11、 流出，讀數(shù)達(dá)到最大值一半停止加樣 （起 始緩沖液和樣品液的讀數(shù)分別為0、 100）；停止加樣，用起始緩沖液將不吸附的Pr洗出；改變緩沖液條件，使 Pr 從柱上解吸；收集洗脫液，測定出其總 Pr，用此總Pr除以離子交 換劑體積可算出該交換劑在此流速下動(dòng)態(tài)容量。離子交換層析的本質(zhì)： 起始條件下溶液中離子強(qiáng)度較低，上樣后，目的物與離子交 換劑的結(jié)合能力更強(qiáng)，能取代離子而吸附到交換柱上；洗脫時(shí)，提高溶液離子強(qiáng)度來增強(qiáng)離子的競爭性結(jié)合能力， 使目的物從交換劑上解析。溶質(zhì)的電荷性質(zhì)：蛋白質(zhì)在離子交換劑上發(fā)生吸附是因其表面 帶電荷蛋白質(zhì)分子帶電基團(tuán)的來源：特定的氨基酸或蛋白質(zhì) 修飾過程中引入；蛋白質(zhì)分子所

12、帶電荷種類和數(shù)量并非常數(shù)，與溶液pH 直接相關(guān)：pHpI 時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈的負(fù)電荷 比較樣品中目標(biāo)蛋白和主要雜蛋白的滴定曲線，有助于離子交 換層析起始條件選擇。對基本信息不明的蛋白質(zhì)，常先嘗試在略偏堿性條件 下采用陰離子交換劑進(jìn)行層析分離；Pr 樣品等電點(diǎn)信息對層析條件選擇很有價(jià)值，要選擇 分辨率較高的層析條件， 須獲得各組分分子電荷隨 pH 變化的情況 （Pr 滴定曲線 ）.Pr 等電點(diǎn)測定：等電聚焦電泳法Pr 滴定曲線：電泳法蛋白質(zhì)層析行為：不僅取決于所帶電荷種類和數(shù)量 還與蛋白質(zhì)分子中電荷分布密切相關(guān)處于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部電荷 （它們可能形成鹽鍵維持蛋 白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) ）對蛋白質(zhì)層析行為并不

13、產(chǎn)生影響， 而取決于蛋 白質(zhì)的表面電荷。 層析相關(guān)區(qū)域：蛋白質(zhì)表面的電荷分布大多不均勻，某些表面 區(qū)域內(nèi)電荷可能較密集，此區(qū)域往往就是離子交換時(shí)與交換劑 發(fā)生接觸的區(qū)域，稱為層析相關(guān)區(qū)域，此區(qū)域的電性質(zhì)決定了 蛋白質(zhì)能與何種離子交換劑結(jié)合。Z 值是指蛋白質(zhì)分子上與離子交換劑發(fā)生相互作用的帶電位點(diǎn) 的數(shù)目。進(jìn)行離子交換層析時(shí)：Z 值越大，蛋白質(zhì)與交換劑的結(jié)合越牢固Z 值越小，蛋白質(zhì)與交換劑的結(jié)合越松弛Z 值是多種因子綜合作用的平均值：Z 值與蛋白質(zhì)凈電荷間無直接關(guān)系，分子量大的蛋白 質(zhì)與離子交換劑間的接觸位點(diǎn)未必多于分子量小的蛋 白質(zhì)；蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化將造成電荷分布情況的改變而引起Z 值變化；層

14、析時(shí)加樣量增加， Z 值會(huì)下降。 影響目的物與離子交換劑結(jié)合的因素：溶液pH,它決定了目的物的帶電狀態(tài)蛋白質(zhì)的層析相關(guān)區(qū)域，即電荷在蛋白質(zhì)表面的分布情況溶液中離子的種類和離子強(qiáng)度pH 的影響：目的物的 pH 穩(wěn)定范圍：超出此范圍會(huì)造成目的物活 性喪失、回收率下降唐南效應(yīng)離子交換劑表面 pH 與溶液 pH 不一致 陽離子交換劑表面 pH 比周圍緩沖液低 1 個(gè) pH 單位 陰離子交換劑表面 pH 比周圍緩沖液高 1 個(gè) pH 單位 離子種類的影響：不同離子從離子交換劑上將目的物置換下來的能力不 同；離子類型還對分辨率和不同目的物的洗脫順序產(chǎn)生影 響離子強(qiáng)度的影響： 低離子強(qiáng)度下,目的物通過荷電基

15、團(tuán)結(jié)合至離子交換 劑上帶相反電荷的功能基團(tuán)上； 競爭離子濃度即溶液離子強(qiáng)度逐漸升高時(shí),目的物逐 漸被置換下來, 絕大多數(shù)目的物在 1mol/L 的鹽濃度下 能被洗脫。離子交換動(dòng)力學(xué)的五步驟 ：（ 1）膜擴(kuò)散：蛋白質(zhì)通過擴(kuò)散穿過水膜到達(dá)凝膠表面的過程, 其速度取決水膜兩側(cè)蛋白質(zhì)的濃度差（ 2）粒子擴(kuò)散： 蛋白質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔并到達(dá)發(fā)生交換 的位置的過程（3）蛋白質(zhì)取代離子交換劑上的反離子而發(fā)生離子交換；（4） 被置換下來的反離子擴(kuò)散到達(dá)凝膠顆粒表面,即粒子擴(kuò)散, 方向與步驟 2 相反；（ 5）反離子通過擴(kuò)散穿過水膜到達(dá)溶液中,也即膜擴(kuò)散,方向 與步驟 1 相反。目的物的解離曲線已知 pI

16、時(shí),一般首先考慮蛋白質(zhì)的帶電情況：對 pI=5 的酸性蛋白DEAE纖維素柱色譜，可選 pH5.59.0CM纖維素柱色譜則限于 3.54.5對 pI=8 的堿性蛋白CM纖維素柱色譜，可選 pH3.57.5DEAE纖維素柱色譜則限于 8.59.5具體還需考慮（1）目的物的穩(wěn)定性（ 2）唐南效應(yīng) （Donnan）如陰IE pH表面pH溶液 約1個(gè)pH單位 陽IE pH表面V pH溶液約1個(gè)pH單位 目的物分子大小 其它考慮：吸附選擇、流速、經(jīng)濟(jì)性、文獻(xiàn)影響吸附平衡常數(shù)或分布系數(shù)a的因素：pH 影響電性與電量I上升，a下降，減弱吸附 溶質(zhì)的電荷分布、 IE 的電荷分布及位阻效應(yīng) 與溶質(zhì)的濃度成反比（2

17、）梯度洗脫：洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度或 pH 連續(xù)變化，能獲得 較高的分辨率峰寬通常小于階段洗脫拖尾現(xiàn)象明顯改善或完全消除 不會(huì)造成同一組分被分離稱幾個(gè)峰C 梯度洗脫的策略a 梯度形狀的選擇線性梯度：目的物首次分離， NaCl 0 0.5mol /L 凸形梯度：梯度末尾部分分辨率不好時(shí)使用 凹形梯度：梯度起始部分分辨率不好時(shí)使用混合梯度 組分吸附能力相近需改善分辨力的位點(diǎn)提供足夠分辨率 分辨力不作要求的位點(diǎn)采用陡峭的梯度縮短時(shí)間b 梯度的高度和斜率較低斜率：吸附能力相近組分間分辨率T,峰寬加大，分離時(shí)間T較大斜率：快速分離，尖峰，不同組分的分離度差異 減小c 流速 ：適當(dāng)降低流速可提高層析的分辨率

18、 分離低分子量物質(zhì)分子：擴(kuò)散速度快，迅速平衡，流 速僅受到介質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度、系統(tǒng)壓力的限制 分離生物大分子物質(zhì)分子：擴(kuò)散速度慢，達(dá)到吸附和 解吸平衡需一定時(shí)間，加樣和洗脫過程中流速限制d 常用洗脫策略組分不多，相差較大，用階段洗脫 組分多，相差較大，用簡單梯度洗脫組分復(fù)雜，線形洗脫 -凸形/凹形洗脫 初次分離，先連續(xù)梯度洗脫 （確定樣品特性和洗脫條件 ） - 再階段洗脫色譜 （層析）聚焦 Chromatofocusing ：據(jù)生物分子 pI 的不同，在 動(dòng)相中動(dòng)速不同進(jìn)行分離（適于水溶性的兩性分子）。 特點(diǎn)：.自動(dòng)形成pH梯度，不需特殊實(shí)驗(yàn)裝置；.蛋白質(zhì)聚焦自身 pI 范圍，有濃縮效應(yīng)，峰寬達(dá) 0

19、.04-0.05pH 單位，分辨 率很高 。PB（ polybuffer ）-多組分緩沖液：分子量不同的多羧基多氨基化合物（兩性電解質(zhì)性緩沖劑），特點(diǎn)：不高，但緩沖力強(qiáng)； .緩沖能力是均勻的。PBE（polybuffer exchange） 多緩沖交換劑：以交聯(lián)瓊脂糖 Sepharose CL-6B 為基質(zhì)， 并在糖上通過醚鍵偶合上配基而成如 低聚乙烯亞胺。要求：確保很寬的 pH 范圍有均衡的緩沖容量。 色譜（層析）聚焦的應(yīng)用：蛋白質(zhì)類（包括酶）的分離；蛋白質(zhì) 類（包括酶）等電點(diǎn)測定。親和色譜（層析）AC :利用生物分子和其配體之間的特異性生物親和力可逆結(jié)合的特性而建立的色譜分離方法。親和層析

20、的必要條件：合適的配體（配基、 ligand） ；合適的載 體（ Matrix） ；合適的吸附和洗脫條件配體的選擇：1.考慮親和勢（要求KI在10-410-8mol/L之間）；2.與L的偶聯(lián)不破壞L與S的結(jié)合；3.需了解L-S的作用機(jī) 制作為配體的條件：親和力大；具有解離平衡；與載體偶聯(lián)不失活親和層析載體的條件：1.親水； 2.惰性； 3.具有活化基團(tuán)； 4.大網(wǎng)孔； 5.機(jī)械性能好連接臂（Spacer arm）：在載體和配基間引入適當(dāng)長度的手臂”減少載體的空間阻礙，增加配基的活動(dòng)度。非專一性洗脫： 改變緩沖液的離子強(qiáng)度 ；改變緩沖液的 pH 值 ； 改變緩沖液的極性 ；使用洗滌劑 ；使用促溶

21、鹽（ chaotropic salt）；使用蛋白質(zhì)變性劑專一洗脫 （親和洗脫 ）：（1）使用配體；（2）使用能與配體結(jié)合的 分子；（ 3）采用酶促反應(yīng)的多元專一性洗脫 洗脫方式總結(jié)：.pH變化（破壞靜電引力）；變化（減 弱靜電引力、范德華力）；.親和洗脫；.表面活性劑（減少 疏水作用、范德華力）；.解離試劑（主要破壞氫鍵，如尿素、 鹽酸胍等）;（六）.降低溫度t（較高t吸附、較低t洗脫、減少疏水 力）;.電泳解吸（在柱兩端連上電極進(jìn)行電泳）。共價(jià)色譜 ：利用形成和破壞共價(jià)鍵能力的差異分離。其共價(jià)鍵 常為二硫鍵一S-S，主要用于分離分子中含巰基的Pr、多肽。疏水色譜：將疏水的 L 連到 Gel

22、上。作用力 蛋白質(zhì)的疏水區(qū) 與疏水性配基間形成疏水鍵。 可高鹽上柱， 低鹽洗脫或高溫上， 低溫洗。金屬螯合色譜 ： His Cys Trp 能與某些金屬離子形成復(fù)合物，若 將金屬離子固定，可將含這些外露AA的Pr吸附。蛋白質(zhì)分子表面的組氨酸咪唑基、半胱氨酸巰基和色氨酸吲哚環(huán)能與銅、 鋅、鎳離子間形成穩(wěn)定的螯合物。洗脫方式：采用增加 I 或降 低 pH 或加入 EDTA 。 有機(jī)染料親和色譜：有機(jī)染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具類 似于 NAD+ 的結(jié)構(gòu)。一些需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對這些 染料具一定親和力。 親和層析應(yīng)用：抗體和抗原的純化；酶的純化；糖蛋白和脂蛋 白的純化；細(xì)胞的純化 反相層析

23、 RPC ：基于溶質(zhì)分子與固定相中鍵合在基質(zhì)上的疏水 性配基間的疏水相互作用疏溶劑理論假設(shè) ：反相層析介質(zhì)表面均勻密集覆蓋著非極性配基；溶質(zhì)分子 因受到極性流動(dòng)相的斥力而以其疏水部分結(jié)合至固定相的 非極性配基上；除此之外，溶質(zhì)與固定相間不存在其他任 何相互作用親硅醇基效應(yīng) 硅膠類介質(zhì)中存在，一定條件下，硅膠表面殘余的硅醇基 能與溶質(zhì)發(fā)生相互作用而對溶質(zhì)的保留行為起決定作用， 此效應(yīng)常導(dǎo)致溶質(zhì)保留值重復(fù)性較差、洗脫峰脫尾等不良 層析行為；若硅膠表面均勻覆蓋非極性配基，對殘余硅醇 基屏蔽，可基本排除此效應(yīng)的影響；新型反相層析介質(zhì)聚 苯乙烯等高分子聚合材料可根本消除親硅醇基效應(yīng)的影 響。有機(jī)溶劑又稱

24、修飾劑（ modifier ）： 作用：降低流動(dòng)相極性 要求：能與水互溶；較低的紫外截止波長；較低的黏度 離子對試劑( ion pairing agent )： 作用：通過離子作用與溶質(zhì)分子結(jié)合引起溶質(zhì)疏水性質(zhì)改變而 調(diào)節(jié)溶質(zhì)保留行為本身是酸或堿，同時(shí)起維持流動(dòng)相 pH 作用 使用濃度范圍 0.01%0.1% 或 10100 mmol/L 高濃度有機(jī)溶劑中有足夠的溶解度對波長 220 nm 的紫外線沒有明顯吸收，帶芳香環(huán)離子對 試劑須用熒光、視差折光等檢測法 流動(dòng)相選擇須注意問題：反相層析大多在低 pH 下運(yùn)行，加酸調(diào)節(jié)； 流動(dòng)相中添加離子對試劑可改變?nèi)苜|(zhì)的保留值和選擇性， 獲得較好的分離效果

25、：帶正電荷溶質(zhì)應(yīng)選帶負(fù)電荷的離子對試劑：三氟乙酸 帶負(fù)電荷溶質(zhì)應(yīng)選帶正電荷的離子對試劑：季銨鹽 洗脫應(yīng)注意的問題：流動(dòng)相中有機(jī)溶劑種類、 pH 值、離子對試劑種類等都 會(huì)對選擇性和分辨率產(chǎn)生影響分離低分子量物質(zhì)時(shí)，升高柱溫是常用的改善分辨率的方 法：降低流動(dòng)相黏度、增加傳質(zhì)速度、減少區(qū)帶變寬 降低流速一定程度上可提高柱效，同時(shí)也增加溶質(zhì)的縱向 擴(kuò)散，過低流速反而造成分辨率下降、分離時(shí)間延長 。 影響泳動(dòng)速度 V 的因素： 樣品有效遷移率 m? m 是表征物質(zhì)電泳行為的特征值? 與粒子大小、帶電量 Q、環(huán)境pH、粘度有關(guān) 電壓(電場強(qiáng)度)? 因V x E，為縮短時(shí)間，可提高E? 但高壓電泳需解決

26、散熱問題 緩沖液(介質(zhì)液體)1、pH:主要影響介質(zhì)帶電荷情況(解離度)2、 I (離子強(qiáng)度)應(yīng)適當(dāng)0.010.3mol/L 支持物1 、吸附作用:造成樣品滯留、脫尾2、電滲:凝膠流汗或變干3、分子篩效應(yīng)聚丙烯酰胺 Gel 合成原料:丙烯酰胺 Acr ，雙丙烯酰胺 Bis1 、化學(xué)聚合法? 催化劑:過硫酸銨( AP )? 加速劑: N,N,N,N- 四甲基乙二胺( TEMED ) 影響聚合的因素 O2 會(huì)淬滅自由基，需脫氣； 加速劑叔胺處在自由堿基狀態(tài)，需高 pH;溫度T, T J, 慢；T T ,快 避免不純物的影響 有機(jī)玻璃、鐵氰化鉀等會(huì)造成無法聚合Gel 要求? 合適的網(wǎng)孔? 一定的機(jī)械強(qiáng)

27、度? 良好的透明度? 一定的粘著度 濃縮效應(yīng):電泳時(shí)， Cl- 很快遷移，后面形成低電導(dǎo)區(qū)，使 Gly、 Pr 的離子加速，當(dāng)穩(wěn)定建立后，在快離子和慢離子之間形成一 個(gè)迅速移動(dòng)的界面， Pr 就聚集在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮 成一個(gè)個(gè)狹小的中間層。Nature PAGE 是否能測定蛋白質(zhì)分子量？ 天然 PAGE 測定蛋白分子量需排除電荷影響，需測量蛋白質(zhì)分 子在不同濃度凝膠中相對遷移率b 先用不同濃度凝膠同時(shí)測量未知和已知分子量蛋白質(zhì) 的相對遷移率；b 對不同蛋白質(zhì)分子，以其相對遷移率的對數(shù)對凝膠濃 度作圖，直線斜率為阻滯系數(shù)；b 用已知分子量蛋白阻滯系數(shù)對其分子量作圖得直線， 據(jù)未知蛋白質(zhì)

28、阻滯系數(shù)從此直線上可查得其分子量。 雙向電泳: 采用兩種不同原理的電泳程序 (第一向?yàn)榈入娋劢梗?第二相為 SDS 電泳)，可使分辨率提高幾個(gè)數(shù)量級，并可同時(shí) 得到等電點(diǎn)和分子量等信息；是當(dāng)前蛋白質(zhì)組分析的關(guān)鍵開門 技術(shù)。 免疫電泳:基于抗原的電泳遷移及抗原與抗體的專一性免疫沉 淀反應(yīng)； 抗原起始時(shí)帶強(qiáng)負(fù)電， 在凝膠中電泳遷移后與抗體發(fā) 生免疫反應(yīng)；最初抗原過量，產(chǎn)生可溶性免疫混合物而繼續(xù)向 陽極遷移，直至抗原與抗體的濃度達(dá)到當(dāng)量點(diǎn)，形成不溶性免 疫沉淀，沉淀點(diǎn)的高度或面積與抗原量成正比 蛋白質(zhì)印跡: 把從電泳或?qū)游龇蛛x的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上， 并用專一性免疫技術(shù)探測固定膜上蛋白質(zhì)的方法，能更有效分 析電泳結(jié)果。毛細(xì)管電泳(CE):以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通 道，依據(jù)樣品各組分間遷移率和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離 的新型的高效液相分離技術(shù)；可將有生物化學(xué)意義的復(fù)雜化合 物在不改變其性質(zhì)的前提下進(jìn)行分離；應(yīng)用：蛋白質(zhì)分離、糖 分