分子醫(yī)學(xué)實驗：PBMCs的分離和計數(shù)

1、PBMCsPBMCs的分離和計數(shù)的分離和計數(shù) 實驗?zāi)康暮鸵髮嶒災(zāi)康暮鸵?掌握掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分離的方法分離的方法 掌握掌握細(xì)胞計數(shù)的方法細(xì)胞計數(shù)的方法 實驗原理實驗原理 外周血中細(xì)胞種類外周血中細(xì)胞種類 細(xì)胞細(xì)胞密度密度 紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞 1.092-1.093 PBMC(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞) 1.074 淋巴細(xì)胞分離液：Ficoll-Hypague 1.077 密度梯度離心法：利用一種密度介于1.075-1.092之間而近 于等滲的溶液做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯 度分布，從而將各種細(xì)胞各種細(xì)胞加以分離。

2、 實驗方案實驗方案 抽取外周血 分離PBMCs 細(xì)胞計數(shù) 實驗材料實驗材料 1. 肝素抗凝血肝素抗凝血 2. Hanks液液 3. 淋巴細(xì)胞分離液淋巴細(xì)胞分離液 4. 水平離心機(jī) 5. 顯微鏡 6. 細(xì)胞計數(shù)板細(xì)胞計數(shù)板 實驗步驟實驗步驟 肝素抗凝靜脈血肝素抗凝靜脈血1-1-1.5 ml 加等體積的加等體積的Hanks液稀釋液稀釋 置于置于2ml淋巴細(xì)胞分離液上淋巴細(xì)胞分離液上 ( (交界液面：一定交界液面：一定不要打亂不要打亂) ) 稀釋后的稀釋后的 抗凝血抗凝血 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 分離液分離液 用用Hanks液洗、液洗、離心離心 (1500 1500 rpmrpm，5 5minmin) 重

3、復(fù)重復(fù)2次次 血漿 分層液 紅細(xì)胞 粒細(xì)胞 離心（離心（20002000rpmrpm，2 25min5min） PBMCs層 細(xì)胞計數(shù)板細(xì)胞計數(shù)板 細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù) 數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。 用100ulHanks液重懸細(xì)胞 取10ul細(xì)胞懸液+40ul Hanks液 +50ul臺盼蘭, 混勻 取10ul于細(xì)胞計數(shù)板上 進(jìn)行細(xì)胞計數(shù) 細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù) 實驗結(jié)果計算實驗結(jié)果計算 2 2 2 2個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù) 單個核細(xì)胞濃度單個核細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞數(shù)/ml)/ml) 10104 4稀釋倍數(shù) = 活細(xì)胞百分率活細(xì)胞百分率 = 活細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞總數(shù)細(xì)胞總數(shù) 100%100% 細(xì)胞活力檢測：細(xì)胞活力檢測：（臺盼蘭染色：死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞（臺盼蘭染色：死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞 不著色）不著色） 細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞數(shù)量： u 純度在純度在90%90%以上以上 u 淋巴細(xì)胞約占淋巴細(xì)胞約占90-95%90-95% u 細(xì)胞收獲率可達(dá)細(xì)胞收獲率可達(dá)80-90%80-90% u 活細(xì)胞百分率在活細(xì)胞百分率在95%95%以上以上 密度梯度離心法密度梯度離心法分離分離PBMCs： 注意事項注意事項 稀釋的肝素抗凝