試驗總結細胞培養(yǎng)方法

1、、培養(yǎng)細胞常用配置 培養(yǎng)基 的配置：基礎培 養(yǎng)基 500ml+胎牛血清 50ml+雙抗 5ml 凍存液的配置： 10 % DMSO + 90% 依次比例酌量配置。超凈工作臺常規(guī)配置 移液器 1 套（、l20、l200、l1ml），酒精燈 1 盞，液器 1 臺，斜架 1 臺，酒 精噴壺 1 個，酒精棉球缸 1 個，污缸 1 個， 常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（ 50 2），定量移液管（ 5ml、10ml），槍頭（ 1ml、200、l 10）l，培養(yǎng)皿， 6/24/48/96 孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗， DMSO，胰酶， 75%酒精 實驗前準備： 所需的各項高壓后的耗材及污

2、物缸放于超凈工作臺內， 用酒精噴壺 噴灑實驗臺面，并關閉工作臺打開紫外燈照射 30min后開始實驗操作。 培養(yǎng)基及 胰酶恢復常溫后使用，可 37水浴 5-10min二、細胞復蘇步驟：1. 紫外消毒 30min 后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液（ DMEM），恒溫水浴箱 37預熱 20min，備用。超凈臺內準備一支 15ml 離心管備用。3. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將 瓶口對準在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入 37水浴中，快速搖晃，直至凍

3、存液 融化至黃豆粒大小后迅速取出。5. 將細胞懸液移入 15ml 離心管，緩慢加入 4ml 培養(yǎng)液，離心（1000r/min ，5min）。6. 取出 2個培養(yǎng)皿并做好標記（復蘇日期等），提前加入 5-10ml 培養(yǎng)液；離心 結束后用 1ml 培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞后分別加入培養(yǎng)皿內。7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面， 取出實 驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)注意事項：1. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液 氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識

4、，在這里不作詳述，但二甲基亞砜 （DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 用較大，因此，必須在 1-2min 內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造 成細胞的損傷，二甲基亞砜（ DMSO）最好選擇進口產(chǎn)品。3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量 培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4. 離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后 分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉 的不夠活細胞沉底的少， 細

5、胞就全被扔掉了， 轉過了活細胞會受壓過大， 死亡。 此外在操作過程中容易污染， 所以不推薦。 另一種說法為細胞懸液中含有二甲基 亞砜（ DMSO），DMSO 對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒 凈，且一定倒干凈。5. 凍存細胞解凍時 1ml 細胞液要加 10ml15m 培養(yǎng)液6. 復蘇細胞分裝的問題：復蘇 1管細胞一般可分裝到 2-3 只培養(yǎng)皿中，分裝過多， 細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。7. 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是 DMSO 的 濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少， 那么 DMSO的濃度就會比較大， 就會影響細胞 生長，從以前的資料來看， DMS

6、O 的濃度在小于 %的時候對一般細胞沒有什么影 響，還有一個說法是 1。所以如果你的凍存液的濃度是 10DMSO 的話那么 加 10ml 以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度8. 原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環(huán)境中的水都會形成 冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、 PH改變、 蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢 的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在 130以下的低溫 中能減少冰晶的形成。 細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的 5 0，細胞仍能生長，活力受損不大。 目前常用的保護劑為二甲亞砜

7、（ DMS）O 和 甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。三、培養(yǎng)液的更換1. 紫外消毒 30min 后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液（ DMEM），恒溫水浴箱 37預熱 20min，備用。3. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再 將瓶口對準在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4. 將培養(yǎng)皿蓋內口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸5拿出 1支高壓后的 5ml 定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上， 再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身 2-3 次，懸空進

8、入培養(yǎng)基瓶內吸取 5-10ml 培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿內，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒 2-3 次后蓋上。6. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面， 取出實 驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。7. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)每天定時觀察細胞生長情況，一般 72-96h 后，細胞生長密度大于 90%，即可進 行細胞的傳代。四、細胞傳代1. 紫外消毒 30min 后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱 37預熱 20min，備用。3. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈， 再將瓶口對準在酒精

9、燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分 別放于酒精燈的兩側。4. 將培養(yǎng)皿蓋內口朝上放在架子上， 將培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。 取 1ml 移液器快速移動在酒精燈上消毒 1-2 次，然后再裝上槍頭吸取 1-2ml 胰酶液，懸 空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內。5. 將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越 1-3min（消化時間 根據(jù)細胞不同時間不同） ，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙， 并 有 1-2 個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。 （若看到 成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度； 若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落， 或鏡 下細胞多有菱角

10、則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。6. 吸取 1ml 培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿內，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗 培養(yǎng)瓶壁 5-8 次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內再輕輕吹打 2-3 次，使細胞盡 可能處于單個懸浮狀態(tài)。7. 取 1 或 2 個新的培養(yǎng)皿，然后將細胞培養(yǎng)基均勻的分到 2 或 3 個培養(yǎng)瓶內（注 意原來傳代時使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進行 1 傳 2 或 1 傳 3 的培養(yǎng)。8. 拿出 1 支高壓后的 5ml 定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上， 再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身 2-3 次，懸空進入培養(yǎng)基皿內吸取 5-10ml 培養(yǎng)基懸空移入每個培養(yǎng)皿內，

11、將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒 2-3 次蓋上， 在皿蓋上做好實驗標記。9. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊， 熄滅酒精燈， 整理實驗臺面， 取出實 驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。10. 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。注意整個培養(yǎng)箱底托盤內一定要放高壓后的 水，且定期更換確保無菌。每天定時觀察細胞生長情況，一般 72-96h 后，細胞生長密度大于 90%，即可進 行細胞的傳代或保株。五、細胞株的保存 原理：細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法， 主要采用加適量保護劑的緩慢 冷凍法凍存細胞。 細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍， 細胞內外的水分會 很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞

12、脫水使局部電解質濃度增高， pH 值改變，部分蛋白質由于上述原因而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，溶 酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶， 使細胞內結構成分造成破壞， 線粒體腫 脹，功能丟失， 并造成能量代謝障礙。 胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細 胞膜通透性的改變， 使細胞內容物丟失。 如果細胞內冰晶形成較多， 隨冷凍溫度 的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核 DNA空間構型發(fā)生不可逆的損傷， 而致細胞死 亡。因此， 細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分， 減少細胞內冰晶的 形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿 透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通

13、透性，且對細胞無明顯毒性。慢 速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外， 減少胞內形成冰結晶的機會， 從而 減少冰晶對細胞的損傷。實驗步驟： 選擇處于對數(shù)生長期的細胞， 在凍存前一天最好換液。 將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培 養(yǎng)液去掉，用 % 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管 吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞， 使其成為均勻分散的細胞懸液。 懸浮生產(chǎn)細 胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心 （1000r/min ，10 分鐘） 。加 入凍存管中，再加入 1ml 配置好的凍存液后放入梯度降溫盒， 放入-80 冰箱中。1. 紫外消毒 30min 后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工

14、作狀態(tài)，用酒精消毒操作 者的雙手。2. 培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜 DMS，O 胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復常溫， 恒溫水浴箱 37預熱 20min，備用。3. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈， 再將瓶口對準在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分 別放于酒精燈的兩側。4. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒 2-3 次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋 2-3次， 蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸， 在酒精燈消毒 2-3 次瓶 口，豎直放好。取 1ml 移液器快速移動在酒精燈上消毒 1-2次，然后再裝上槍頭 吸取胰酶液，懸空移入

15、培養(yǎng)瓶內。5. 將培養(yǎng)皿蓋內口朝上放在架子上， 將培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。 取 1ml 移液器快速移動在酒精燈上消毒 1-2 次，然后再裝上槍頭吸取 1-2ml胰酶液，懸 空沿皿壁加入培養(yǎng)皿內。6. 將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越 1-3min（消化時間 根據(jù)細胞不同時間不同） ，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙， 并 有 1-2 個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。 （若看到 成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度； 若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落， 或鏡 下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化）。用移液器將胰酶吸凈。6. 吸取 1ml 培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，

16、并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培 養(yǎng)瓶壁 5-8 次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內再輕輕吹打 2-3 次，使細胞盡可 能處于單個懸浮狀態(tài)。7. 將懸浮細胞吸入 15ml 離心管內，加入 4ml 培養(yǎng)基離心 1000r/min ，5min8. 預先配制凍存液： 10 % DMSO + 90%。按需要配置一定數(shù)量備用9. 棄去培養(yǎng)基，用凍存液進行重懸混勻后， 將 1ml 含有細胞的凍存液移入凍存管 內，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。10. 將培養(yǎng)基， 胰酶瓶口和瓶蓋消毒 2-3 次后擰緊，熄滅酒精燈， 整理實驗臺面， 取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8. 將凍存管先放于 4冰箱 30mi

17、n 后拿出放置 -20冰箱過夜，次日再放于 -80 的冰箱內 3-4 天，最后存放于 -196 的液氮灌內長期保存?；蛑苯臃湃胩荻冉禍?盒內，放入 -80 冰箱內過夜后最后存放于液氮罐內。（梯度降溫盒內為甲醇， 使用 5 次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復常溫）六、細胞轉染RNA干擾( RNA interference, RNAi ):是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-stranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。基因沉默，主要有轉錄前水平 的基因沉默 (TGS)和轉錄后水平的基因沉默 (PTGS)兩類:TGS 是指由于

18、DNA修 飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常錄 ;PTGS是啟動了細胞質內靶 mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時 導致 TGS和 PTGS。由于使用 RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，(長度超過三 十的 dsRNA會引起干擾素毒性) 所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳 染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。病毒基因、人工轉入基因、等外源隨機整合到基因組內，并利用宿主細胞進 行轉錄時，常產(chǎn)生一些 dsRNA。對這些 dsRNA迅即產(chǎn)生反應。作用機制1) 其胞質中的 Dicer 將 dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段 RN(A大 約 2123 bp )，即

19、siRNA。2) siRNA在細胞內 RNA的作用下成正義鏈和，繼之由反義 siRNA 再與體內一些 酶(包括內切酶、 、解旋酶等)結合形成 RNA誘導的沉默復合物 (RNA-induced silencing complex ，RISC)。3) RISC與外源性基因表達的 mRNA的同源區(qū)進行特異性結合， RISC具有的功能， 在切割 mRN，A 切割位點即是與 siRNA中互補結合的兩端。被切割后的斷裂 mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些 mRNA的降解反應。4) siRNA不僅能引導 RISC切割同源單鏈 mRN，A 而且可作為引物與靶 RNA結合 并在(RNA-dependen

20、t RNA polymerase ， RdRP)作用下合成更多新的 dsRNA， 新合成的 dsRNA再由 Dicer 切割產(chǎn)生大量的次級 siRNA，從而使 RNAi 的作用 進一步放大，最終將靶 mRNA完全降解。5) RNAi發(fā)生于除以外的所有真核生物細胞內。 需要說明的是， 由于 dsRNA抑制 基因表達具有潛在高效性， 任何導致正常 dsRNA形成的情況都會引起不需要 的相應。 所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止 dsRNA形成的機 制。iiiiiuiiiiaiiiiiiiiicompuyrorxary mHMATnuW、，：4XJ、LXdsRNAmRMA Cleavage

21、mRNA脂質體轉染原理：1. 脂質體是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層， 又稱為人工生物膜。 最初， 人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融 合及內吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體 ?2. 陽離子脂質體表面帶正電荷， 能與核酸的磷酸根通過靜電作用將 DNA 分子包 裹人內，形成 DNA 一脂復合體 ，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通 過膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將 DNA 傳遞進 入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小部分 DNA 能從包涵體內釋放， 并進入細胞質中 ，再進一步進入核內轉錄、表達DNA轉染步驟1. 轉染前一天接種

22、細胞于 6 孔板， 150每孔， 2ml 無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二 天轉染時細胞達到 90-95%每孔。2. 轉染前半小時換 Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基。3. A液： DNA 5ug 加入 245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。4. B液：脂質體使用前輕輕混勻，脂質體 10ul 加入 245ul Opti-MEM 無血清培 養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止 5min。5. B液加入 A 液，用槍輕輕混勻，室溫靜止 20min。6. 將混合液均勻分散慢慢滴加到 6孔板細胞中， 邊滴加變前后左右十字交叉搖 晃。7. 孵箱 37培養(yǎng) 48h（轉染時間待定）。8. 第二天看細胞狀態(tài)來決定是否

23、換液。9. 同時設立細胞對照組，空白轉染組。siRNA轉染步驟1）轉染前一天接種細胞于 6 孔板（ 40x104），2ml 無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二 天轉染時細胞達到 50-60%每孔。2）轉染前半小時換 Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基。3）A液： siRNA 5ul（共100pmol）加入 245ul Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混 勻。（ siRNA按照說明書稀釋）4）B液：脂質體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質體10ul 加入245ul Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止 5min。5）B液加入 A 液，用槍輕輕混勻，室溫靜止 20min。6）將混合液均勻分散慢慢滴加到 6孔板細胞中， 邊滴加變前后左右十字交叉搖 晃。7）孵箱 37培養(yǎng) 48h（轉染時間待定）。8）第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。9）同時設立細胞對照組，空白轉染組。使用 RNAiMAX和AGS cell用于 siRNA在6孔板上進行轉染實驗1) 提前配制 GA