一株產(chǎn)漆酶菌株的篩選鑒定和發(fā)酵條件的研究

1、劉敏 ,張明(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ,合肥230036 )摘 要 :以愈創(chuàng)木酚為底物 ,采用平板篩選法篩選得到一株產(chǎn)漆酶菌株 w s122,形態(tài)學(xué)特性表明該菌屬于綠色木霉 。對(duì)產(chǎn)酶條件的初步研究結(jié)果表明 , w s122菌株的產(chǎn)酶高峰期出現(xiàn)在接種培養(yǎng)后的第 4 d。與蔗糖 、乳糖 、半乳糖 和可溶性淀粉相比 ,以葡萄糖為碳源時(shí) ,發(fā)酵上清液的漆酶活力明顯要高 ,最大值達(dá) 230u /l。以 nh4 c l為氮源 ,最 有利于 w s1 22漆酶的產(chǎn)生 ,漆酶活力最高可達(dá)到 234u /l。 0101mmo l /l 的愈創(chuàng)木酚和 ab ts對(duì) w s1 22 產(chǎn)漆酶有明 顯的誘導(dǎo)作用 ,

2、35m g /l 的 tween280可以明顯提高 w s1 22的產(chǎn)酶水平 。關(guān)鍵詞 :綠色木霉 ;愈創(chuàng)木酚 ;形態(tài)學(xué)特征 ;酶活力中圖分類號(hào) : q935文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 : a文章編號(hào) : 1008 - 9632 ( 2008 ) 03 - 0040 - 04漆酶是一種含銅的多酚氧化酶 , 最早發(fā)現(xiàn)于日本漆樹(shù)的傷流液 , 現(xiàn)廣泛存在于昆蟲(chóng) 、植物 、真菌和細(xì)菌因而對(duì)于有著較高漆酶活性的木霉的研究有著重要的意義 。本文報(bào)道了一株產(chǎn) 漆酶 綠 色 木霉 w s1 22 的 篩 選 、鑒定和產(chǎn)酶條件的研究 。1 材料與方法111 材料 分離材料取自安徽省境內(nèi)的各種土壤和各種樹(shù)木腐朽部分 。112 培

3、養(yǎng)基種子培 養(yǎng) 基 ( pda 培 養(yǎng) 基 ) : 葡 萄 糖 20 g, 馬 鈴 薯200 g,瓊脂 16 g。篩選 培 養(yǎng) 基 : pda 培 養(yǎng) 基 , 01015 % 愈 創(chuàng) 木 酚 ,50u /ml 鏈霉素 , 40u /ml 青霉素 ,水 1l , ph 值自然 。中 14 。漆酶能以 o 為受氫體催化酚類化合物 (不包2括酪氨酸 )的氧化 ,具有非底物特異性 , 因而能氧化各種酚類化合物 、殺蟲(chóng)劑 、多環(huán)芳烴和合成染料 59 等多 種環(huán)境污染物 ,特別是在小分子介體物質(zhì)的作用下 ,可以氧化更多種類的物質(zhì) , 因而漆酶可以廣泛地運(yùn)用于 造紙業(yè) ,印染業(yè) ,食品業(yè)和醫(yī)藥業(yè) 。由于漆酶

4、巨大的應(yīng)用價(jià)值 , 進(jìn)行漆酶產(chǎn)生菌的分 離篩選一直是漆酶研究的熱點(diǎn)之一 。從現(xiàn)有報(bào)道看 ,漆酶最主要來(lái)源于子囊菌和擔(dān)子菌亞門(mén)的高等真菌 ,特別是擔(dān)子菌中的白腐真菌 10 , 這些菌也是目前報(bào)道 最有效的芳香族類化合物的降解菌 。但白腐菌一般生 長(zhǎng)周期長(zhǎng) ,而且所產(chǎn)漆酶大多為誘導(dǎo)酶 11 , 這些特性使工業(yè)生產(chǎn)難以有效進(jìn)行 ,故篩選生長(zhǎng)周期短 、產(chǎn)酶時(shí)間早的菌株具有十分重要的意義 。通過(guò)大量的研究 ,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)獲得了許多產(chǎn)漆酶的細(xì)菌和霉菌 , 如具有 一定的降解木質(zhì)素能力的膨大擬青霉菌 12 , 有關(guān)枯草桿菌 13 和球菌 14 分泌漆酶也有少量報(bào)道 ,但是它們漆酶活性均比較 低 。而 廣泛 分

5、 布 在自 然 界 的木 霉 屬真 菌 ,是一類可分泌多種降解木質(zhì)素 、纖維素的菌種 , 常具有多種酶系如纖維素酶 15 、幾丁質(zhì)酶 16 和漆酶 17 等 ,因而木霉在今后農(nóng)業(yè)纖維素這一再生資源的利用 上將發(fā)揮重要的作用 , 有研究表明木霉雖然具有較高的纖維素酶活性 , 但其分泌產(chǎn)生漆酶的能力不強(qiáng) 17 ,發(fā)酵培養(yǎng)基 (改良 ) 18 : 葡萄糖 20 g, nh c l 215 g,4m gso 7h o 015 g, feso 7h o 10m g, m nso 424244h2 o 1m g, znso4 7h2 o 1m g, cuso4 5h2 o 2m g,n a2 h po4

6、h2 o 100m g, kh2 po4 110 g, cac l2 10m g, vb150m g, h2 o 至 1l , ph 值自然 。113 產(chǎn)漆酶菌株的篩選在無(wú)菌環(huán)境下將樣品研碎 , 十倍稀釋成不同濃度 的樣液 。吸取各梯度樣品懸液 011ml , 均勻涂布于含愈創(chuàng)木酚的篩選平板上 ,每濃度設(shè) 3 個(gè)處理 ,置于 28 恒溫培養(yǎng) ,每隔 24 h 對(duì)初篩平板上新出現(xiàn)的有明顯氧 化變色圈的菌落進(jìn)行分離純化 。將分離菌株分別接種到篩選平板上和 pda 平板上 , 28 恒溫培養(yǎng) , 選出篩 選平板上出現(xiàn)明顯氧化變色圈的菌株 ,并通過(guò) pda 平收稿日期 : 2007 - 04 - 28

7、作者簡(jiǎn)介 :劉 敏 ( 1981 - ) ,女 ,碩士研究生 , 主要從事微生物生理學(xué)研究 ;通訊作者 :張 明 , e2m a il: zhangm ing ahau1edu1cn?；痦?xiàng)目 : 安徽省高?！笆?”優(yōu)秀人才計(jì)劃 (【教秘人 】2004 - 100 )板淘汰自身產(chǎn)色素的菌株 , 然后通過(guò)比較變色圈的大小和菌絲的生長(zhǎng)速度 ,選出產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)的菌株 。114 分離菌株的初步鑒定將分離菌株在 28 恒溫培養(yǎng) 4 d, 觀察菌落形態(tài) 。 采用插片法 28 培養(yǎng) 4 d, 鏡檢 , 觀察菌絲和孢子形態(tài)特征 。115 粗酶液的制備與酶活測(cè)定粗酶液的制備 : 將發(fā)酵液于 8000 r /m

8、 in, 4 , 離心10m in,上清液即為粗酶液 。酶 活 力 測(cè) 定 19 : 在 4ml ph 值 410 的 50mmo l /l n aa c2ha c緩沖液中 (含 1mmo l /l 愈創(chuàng)木酚為底物 ) 加入 1ml 適當(dāng)稀釋的酶液 , 混合均勻后 , 置于 25 反應(yīng)10m in,于 465 nm 處測(cè)定光吸收值的增量 。酶活力單位 定義為 :每分鐘氧化 110mo l底物所需的酶量為一個(gè) 酶活單位 。116 培養(yǎng)基成分對(duì) w s1 22 產(chǎn)漆酶活力的影響11611 碳源對(duì) w s1 22 產(chǎn)漆酶活力的影響 在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以 20 g /l 葡萄糖 、蔗糖 、乳糖 、

9、半乳糖 、可溶性淀粉為唯一碳源 ,接種量為 5 % ,培養(yǎng) 6 d,定時(shí)測(cè)定漆酶活力 。11612 氮源對(duì) w s1 22 產(chǎn)漆酶活力的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以 0115 g /l n ano3 、nh4 c l、酒石酸銨 、天冬氨酸 、蛋白胨作為培養(yǎng)基內(nèi)唯一的氮源 ,接種量為 5 % ,培養(yǎng) 6 d,定時(shí)測(cè)定漆酶活力 。11613 誘導(dǎo)劑對(duì) w s1 22 產(chǎn)漆酶活力的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入 0101mmo l /l 愈創(chuàng)木酚 、單寧酸 、ab ts、a zu re2b 作 為 誘 導(dǎo) 劑 , 再 按 5 % 接 種 量 接種 ,發(fā)酵培養(yǎng) 6 d,定時(shí)測(cè)定漆酶活力 。11614 表面活性

10、劑對(duì) w s1 22 產(chǎn)漆酶活力的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中加入表面活性劑 tween280 , 并設(shè)置1m g /l、3 m g /l、5 m g /l 3 個(gè)濃度處理 。發(fā)酵培養(yǎng) 6 d,定時(shí)測(cè)定漆酶活力 。2 結(jié)果與分析211 產(chǎn)漆酶菌株的篩選對(duì)土壤和植物樣本進(jìn)行初篩 ,得到 42 株菌落周?chē)?有明顯褐色氧化帶的菌株 ,分離純化后 ,將各純化的菌 株分別點(diǎn)種于篩選平板和 pda 平板上 , 30 條件下培 養(yǎng) 7 d后發(fā)現(xiàn) ,有 4 株菌在篩選平板和 pda 平板上均產(chǎn)生相同的紅褐色氧化帶 ,疑為菌絲產(chǎn)生色素所致 ; 其它各株菌僅在愈創(chuàng)木酚篩選平板 上有 明 顯 的褐 色 氧化 帶 ,說(shuō)明這些菌

11、株能分泌胞外漆酶 。在這 38 株菌中 ,其中一株菌 (編號(hào) w s1 22 )在平板培養(yǎng) 48 h后即產(chǎn)生了明顯的褐色氧化帶 ,隨著時(shí)間的增加 ,其氧化帶的顏色 逐漸加深 ,呈明顯的陽(yáng)性反應(yīng) , 且菌絲生長(zhǎng)速度很快 ,48 h后菌落直徑達(dá) 31mm。與其它各菌株比較 , w s1 22產(chǎn)酶時(shí)間最早 , 持續(xù)時(shí)間長(zhǎng) , 生長(zhǎng)快 , 氧化變色圈的范 圍最大 ,故將 w s1 22 選為進(jìn)一步研究的材料 。212 菌株 w s1 22 的初步鑒定w s1 22 菌株在接種后 48 h 內(nèi)菌絲生長(zhǎng)緩慢 , 菌落 較小 ,緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng) ,僅有少量淺綠色孢子生成 , 72 h 后迅速生長(zhǎng) , 絮 狀

12、氣生 菌 絲 大量 出 現(xiàn) , 孢 子 量迅 速 增加 ,顏色逐漸加深 , 直至變成淡黃色 。經(jīng)鏡檢 , 菌絲有 隔 ,疏松不成束 。分生孢子梗為菌絲生出的側(cè)枝 ,有隔膜 ,與菌絲區(qū)別明顯 , 對(duì)生分枝 , 又可繼續(xù)形成二級(jí)和 多級(jí)分枝 ,分枝角度呈銳角或直角 。分生孢子產(chǎn)生在分生孢 子 梗 頂 端 , 不 串 生 , 圓 形 , 成 綠 色 。根 據(jù) 魏 景 20 超的方法 ,結(jié)合菌落特征和鏡檢結(jié)果 , 初步鑒定菌株 w s1 22 為綠色木霉 ( t richoderm a viride pe rs1ex f r1) 。213 生物量與產(chǎn)酶的關(guān)系w s1 22 菌株種瓶培養(yǎng) 3 d后接種于

13、 80ml 發(fā)酵培養(yǎng) 基 ( 250ml 三角瓶 ) , 于 30 、160 r /m in 搖床發(fā)酵培養(yǎng)6 d,每天 定 時(shí) 測(cè) 量 生 物 量 和 漆 酶 活 力 , 結(jié) 果 如 圖 1所示 。圖 1 生物量與產(chǎn)酶的關(guān)系f ig 1 tim e cou rse of m yce ical grow th and lacca se p roduc tion of stra in of w s1 22從圖 1 可以看出 , w s1 22 菌株在接種后的幾天內(nèi)生長(zhǎng)迅速 ,生物量在第 5 d 達(dá)到高峰 , 隨著菌絲的迅速 生長(zhǎng) ,漆酶活力也隨之迅速上升 , 并在第 4 d 達(dá)到最大值 220u

14、/l ,之后酶活迅速下降 。由此 可 見(jiàn) , w s1 22 的產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期 ,此時(shí)菌絲生長(zhǎng)旺盛 ,分 泌胞外漆酶的能力最強(qiáng) 。214 發(fā)酵條件對(duì) w s1 22 產(chǎn)漆酶的影響21411 不同碳源對(duì) w s1 22 產(chǎn)酶水平的影響 分別以葡萄糖 、蔗糖 、乳糖 、半乳糖 、可溶性淀粉作為唯一的碳源 ,對(duì) w s1 22 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng) ,并測(cè)定漆酶活 力 ,結(jié)果如圖 2 所示 。由圖 2 可以看出 ,以葡萄糖為唯一碳源時(shí) ,發(fā)酵液的漆酶活力要明顯高于其它碳源 ,最 大值達(dá) 230u /l。此 外 , 以 乳 糖 為 碳 源 時(shí) , w s1 22 在 第酶的合成表達(dá) 。d souz

15、a d t等 21 報(bào)道愈創(chuàng)木酚及染料亮綠能使一株海洋真菌 n iocc # 2 a 的漆酶產(chǎn)量提高30 倍 。在本研究中 ,這些物質(zhì)對(duì) w s1 22 產(chǎn)酶水平的影 響如圖 4 所示 ,它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)的初期均能促進(jìn) w s1 22 漆酶的產(chǎn)生 , 接種 1 d 后 , 各處理發(fā)酵液的漆酶活力 已經(jīng)達(dá)到 45u /l 左右 , 而對(duì)照的漆酶 活力 明 顯 要低 。但是 ,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng) ,單寧酸和甲苯胺蘭對(duì)產(chǎn)酶 的促進(jìn)作用下 降 , 因而 它 們 并不 能 促 進(jìn)該 菌 株 產(chǎn)酶 。而愈創(chuàng)木 酚 和 ab ts 均 能 很 大 程 度 提 高 該 菌 產(chǎn) 酶 能 力 ,在產(chǎn)酶高峰期時(shí) ,發(fā)

16、酵液的酶活力分別達(dá)到 314u / l 和 281u /l , 0101mmo l /l 愈創(chuàng)木酚與 ab ts能分別使 w s1 22 菌株的漆酶活力提高 43 %和 28 % 。由此可見(jiàn) , 愈創(chuàng) 木 酚 和 ab ts 對(duì) w s1 22 產(chǎn) 酶 具 有 良 好 的 促 進(jìn) 作用 。21414 表面活性劑對(duì) w s1 22 產(chǎn)酶水平的影響碳源 。圖 2 不同碳源對(duì) w s1 22 漆酶活力的影響f ig 2 effec t of ca rbon sou rce s on enzym e ac tivity of stra in w s1 2221412 不同氮源對(duì) w s1 22 產(chǎn)酶水

17、平的影響 不同氮源對(duì) w s1 22 菌株產(chǎn)酶水平影響結(jié)果如圖 3所示 。 5 種 氮 源中 nh4 c l 最 有 利 于 w s1 22 漆 酶 的 分 泌 ,酶活最高可達(dá)到 234u /l , 以下依次為 n ano3 蛋白胨 天冬氨酸 酒石酸銨 。綜合 w s1 22 產(chǎn)酶水平分 析 , nh4 c l最適合作為 w s1 22 發(fā)酵產(chǎn)酶的氮源 。圖 5 tween280 對(duì) w s1 22 漆酶活力的影響f ig 5 effec t of tween280 on w s1 22 lacca se sec retion由圖 5 可見(jiàn) , tween280 可以明顯提高 w s1 22

18、的產(chǎn) 酶水平 ,但是 1m g /l 的 tween280 對(duì)該菌株產(chǎn)酶基本上 沒(méi)有明顯效果 ,當(dāng)其濃度達(dá)到 3m g /l 能在很大程度上 提高了菌株的產(chǎn)酶水平 。在第 4 d, 發(fā)酵液漆酶活力最 高達(dá)到 307u /l ,要明顯高于對(duì)照 。表面活性劑對(duì)多環(huán) 芳烴具有增溶作用 , 該作用主要通過(guò)形成表面活性劑 膠束進(jìn)行 。愈創(chuàng)木酚是簡(jiǎn)單的芳環(huán)結(jié)構(gòu)物質(zhì) , tween280 能夠明顯增加其在發(fā)酵液中的溶解性與吸收性 , 使 該誘導(dǎo)劑能夠發(fā)揮較大的作用 ;再者 , tween280 也增加了發(fā)酵液的溶氧量 ,從而有利于菌絲的生長(zhǎng) ; tween280對(duì)酶活力的大幅度提高 , 還可能由于其提高了細(xì)

19、胞膜 的滲透性 ,使胞內(nèi)的漆酶容易透過(guò)細(xì)胞膜分泌出來(lái) ,而且膜透性的提高也促進(jìn)了化學(xué)底物進(jìn)出細(xì)胞 , 從而加 強(qiáng)了菌株對(duì)芳環(huán)類化合物的生物氧化能力 。因而 , 雖然誘導(dǎo)劑愈創(chuàng)木酚與 ab ts 能有效地提高綠色木霉菌株 w s1 22 產(chǎn)酶水平 , 但該菌株能在無(wú)誘圖 3 不同氮源對(duì) w s1 22 漆酶合成的影響f ig 3 effec t of n itrogen sou rce s on lacca se p roduc tion of strain w s1 2221413 誘導(dǎo)劑對(duì) w s1 22 產(chǎn)酶水平的影響圖 4 不同誘導(dǎo)劑對(duì) w s1 22 漆酶合成的影響f ig 4 eff

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