山藥預(yù)防骨質(zhì)疏松的IGF-1靶點(diǎn)研究

1、山藥預(yù)防骨質(zhì)疏松的IGF-1靶點(diǎn)研究摘要 目的 觀察山藥對MC3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨分化的影響及可能的作用機(jī)制。方法 采用不同濃度山藥提取液處理細(xì)胞，MTT法檢測MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性；磷酸苯二鈉法、偶氮偶聯(lián)法檢測細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性；雙熒光素酶檢測IGF-1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)?；钚?；Western印跡法檢測IGF-1蛋白表達(dá)。結(jié)果 山藥促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨分化，并增加了IGF-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，且具有劑量依賴性（P0.01，P0.05）。結(jié)論 山藥可以促進(jìn)IGF-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)及MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和分化，IGF-1可能是山藥促成骨的靶點(diǎn)之一

2、。關(guān)鍵詞 山藥；MC3T3-E1；成骨；IGF-1骨質(zhì)疏松癥，是一種全身性骨代謝疾病，以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨密度降低、骨脆性增加、易骨折為主要特征1，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示，目前全球有超過兩億人罹患此病2。隨著我國死亡率下降，人口老齡化日趨嚴(yán)重，我國目前約有1.3億老齡人口，骨質(zhì)疏松癥已成為嚴(yán)重影響老年人健康及生活質(zhì)量的疾病3。目前骨質(zhì)疏松的主要治療藥物有雌激素、雙膦酸鹽、降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和單克隆抗體等4。然而，這些藥物可能引起浸潤性乳腺癌、骨壞死、靜脈血栓、皮膚和泌尿道感染等副作用，且價(jià)格昂貴5。與此同時(shí)，中藥因其相對價(jià)格較低，副作用較小，近年來備受關(guān)注。山藥作為中藥

3、的一種，具有悠久的種植歷史，山藥有調(diào)節(jié)免疫、降血糖血脂、抗氧化、抗腫瘤等作用6，因其獨(dú)特的藥食同源性，為廣大人民所接受。此前曾有山藥治療骨質(zhì)疏松的報(bào)道，但其成骨機(jī)制尚不完全明確789。骨重塑是成骨與破骨之間嚴(yán)格的平衡，IGF-1作為骨基質(zhì)中含量非常豐富的細(xì)胞因子之一，在骨形成的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用10。有研究表明，山藥提取物具有類雌激素樣作用，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸11.而下丘腦-生長激素-IGF-1軸也受激素的調(diào)節(jié)12?；谝陨希覀兲骄縄GF-1是否是山藥成骨的靶點(diǎn)之一，為指導(dǎo)山藥臨床治療骨質(zhì)疏松提供了重要的理論意義及實(shí)用價(jià)值。1 材料與方法1.1 細(xì)胞和試劑小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC

4、3T3-E1、人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293T購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)；山藥乙醇提取液購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM、Opti-MEM購自美國Gibco公司；胎牛血清購自天津康源生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、MTT、DMSO、Trixon-100購自北京鼎國生物科技有限公司；堿性磷酸酶檢測試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；anti-IGF-1兔多克隆抗體、-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化氫酶標(biāo)記羊抗兔及羊抗鼠二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Taq DNA polymerase、DNA Marker、各種限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司；雙熒光素

5、酶報(bào)告基因試劑盒購自美國Promega公司；AxyPrep PCR清潔試劑盒購自美國Axygen公司；大提試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS和雙抗的-MEM培養(yǎng)基，HEK293T培養(yǎng)于10%FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件均為 37C，5% CO2，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合率時(shí)備用。1.3 細(xì)胞增殖檢測 胰酶消化對數(shù)生長期MC3T3-E1 細(xì)胞，以 1104個(gè)/cm2濃度、每孔100L 接種于 96 孔培養(yǎng)板中，24h后換液，空白對照組加入0M山藥乙醇提取物的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10-10M，10-9M，10-8M，10-7M，

6、10-6M的山藥乙醇提取物的培養(yǎng)基，每種濃度各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。再加入受試藥24 h，48 h，72 h 后，每孔分別加入 5 mg/m L MTT 20 L，5%CO2，37C孵箱孵育4小時(shí)，棄培養(yǎng)基，每孔加入 150 L DMSO，振蕩混勻至沉淀完全溶解后，于全波長酶標(biāo)儀上波長490nm 處檢測吸光度值（OD 值）。1.4 堿性磷酸酶活性檢測 胰酶消化對數(shù)生長期MC3T3-E1 細(xì)胞，以 1104個(gè)/cm2濃度、每孔100L 接種于 96 孔培養(yǎng)板中，24h后換液，空白對照組加入0M山藥乙醇提取物的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10-10M，10-9M，10-8M的山藥乙醇提取物的培養(yǎng)基，每種濃度

7、各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加入受試藥7天、14天后，棄培養(yǎng)液，每孔加入 0.2m L 的 0.2 % Triton X-100 裂解液，冰上裂解細(xì)胞 20min，各孔取 10 L 細(xì)胞裂解液，根據(jù) BCA 蛋白定量試劑盒的說明在 562 nm 處檢測各孔的吸光度值，測蛋白濃度；各孔取 30 L細(xì)胞裂解液，根據(jù) ALP 試劑盒的說明在 520 nm 處檢測各孔的吸光度值。經(jīng)公式：（測定孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度值-空白孔吸光度值）酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度待測樣本蛋白濃度，得出每孔堿性磷酸酶的含量。1.5熒光素酶報(bào)告基因活性檢測 通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找IGF-I啟動(dòng)子序列，應(yīng)用primer 5.0引物設(shè)

8、計(jì)軟件設(shè)計(jì)IGF-I啟動(dòng)子的引物，以人類基因組為模板進(jìn)行PCR，克隆人類IGF-I啟動(dòng)子序列（-1832bp+263bp）。將經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的IGF-1p片段與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入新鮮制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5中，篩選陽性質(zhì)粒進(jìn)行培養(yǎng)、提取、Kpn&Hind雙酶切鑒定及測序。將回收的IGF-Ip啟動(dòng)子片段與pGL-2載體連接,構(gòu)建pGL2-IGF-Ip重組質(zhì)粒。胰酶消化對數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞，以 1104個(gè)/cm2濃度、每孔 200 L 接種于 48 孔培養(yǎng)板中；37 ，5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16小時(shí)后，將熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒與內(nèi)參（Renilla

9、）熒光素酶質(zhì)粒pREP7-RLuc共轉(zhuǎn)染至HEK293T，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，各孔加入不同濃度山藥乙醇提取液，使得培養(yǎng)基山藥終濃度分別為 0M，10-10M，10-9M，10-8M。每種濃度3個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)24 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入65lPLB裂解液，冰上裂解15分鐘，分別加入兩種不同熒光素酶的底物并利用Turner Designs TD20/20光度計(jì)檢測其熒光素酶活性。1.6 Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測 胰酶消化對數(shù)生長期 MC3T3-E1 細(xì)胞，以 1104個(gè)/cm2濃度、每孔 2ml接種于 6孔培養(yǎng)板中；37 ，5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16小時(shí)后換液，空白對照組加入0M山藥乙醇提

10、取物的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為10-10M，10-9M，10-8M的山藥乙醇提取物的培養(yǎng)基，48小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，RIPA裂解液(400lRIPA+ 4lPMSF)裂解組織，蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉液封閉(4過夜),anti-IGF-1兔多克隆抗體（1:500）-actin鼠單克隆抗體(1 1000)室溫孵育2h,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1：1000)、山羊抗鼠IgG(1:500)室溫孵育2h,X線片曝光,顯影、定影后觀察結(jié)果。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)以 xs 表示，采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組間比較

11、用單因素方差分析，P0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 山藥對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 相較對照組，各濃度組山藥在加藥24,48和72小時(shí)時(shí)，均可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，且低濃度時(shí)具有劑量依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到10-8M時(shí)，促細(xì)胞增殖效果最明顯，隨著濃度升高，促增值作用有所下降，見圖一。后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選取10-10M，10-9M，10-8M三組濃度進(jìn)行檢測。2.2 山藥對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響 堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果顯示，在山藥干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞7天、14天時(shí)，與對照組相比，各濃度組均有成骨分化，且呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖二。2.3山藥對IGF-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的

12、影響 PCR擴(kuò)增得到IGF-1啟動(dòng)子目的片段，見圖三A。 IGF-1p片段與pGEM-T Easy載體連接，進(jìn)行Kpn單酶切及Kpn&Hind 雙酶切，結(jié)果顯示連接成功，見圖三B?；厥盏腎GF-Ip片段與pGL-2載體連接,構(gòu)建pGL2-IGF-Ip重組質(zhì)粒，Kpn單酶切及Kpn&Hind 雙酶切，結(jié)果顯示構(gòu)建成功，見圖三C。對構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示構(gòu)建正確，見圖五。熒光素酶報(bào)告基因活性檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，各濃度組山藥均促進(jìn)了IGF-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，并且具有劑量依賴性，見圖四。2.4 山藥對MC3T3-E1細(xì)胞中IGF-1表達(dá)的影響 與對照組比較，各濃度山藥組IGF-1蛋白表達(dá)

13、量均上調(diào)，且具有劑量依賴性，見圖五。3 討論隨著人類壽命的延長，人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥及其引起的骨折越來越普遍，已成為嚴(yán)重的社會(huì)公共健康問題13。大量臨床研究顯示，常用的治療骨質(zhì)疏松西藥存在巨大風(fēng)險(xiǎn)及副作用，新的治療藥物及靶點(diǎn)亟待開發(fā)14。在我國，成骨中藥有著悠久的研究歷史,但多數(shù)中醫(yī)中藥都圍繞著“腎主骨生髓”、“在體為骨”、“肝腎同源”等理論，對于成骨靶點(diǎn)研究較少15。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 山藥提取液可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨分化。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在給藥24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)，各濃度組山藥均顯著增加了成骨細(xì)胞增殖活性，24-48小時(shí)期間對成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用比4

14、8-72小時(shí)顯著。低濃度組山藥呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)山藥濃度達(dá)到10-8M時(shí)增殖作用達(dá)到峰值，此后隨著濃度增加，促增殖作用減弱。由此我們選取劑量依賴濃度組10-10M、10-9M、10-8M進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們應(yīng)用磷酸苯二鈉法檢測堿性磷酸酶活性，結(jié)果表明各濃度組山藥在作用MC3T3-E1細(xì)胞7天和14天后，均出現(xiàn)了明顯的成骨分化，且具有劑量依賴性。 IGF-1是促進(jìn)骨改建，治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵因子之一，以IGF-1為靶點(diǎn)治療骨質(zhì)疏松具有重要意義。本研究選取IGF-1作為研究對象，來探討山藥成骨的可能靶點(diǎn)之一。我們構(gòu)建IGF-1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測，結(jié)果顯示，

15、與對照組相比各濃度組山藥均可增加IGF-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，且具有劑量依賴性。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山藥對IGF-1蛋白表達(dá)具有促進(jìn)作用，與雙熒光素酶檢測結(jié)果一致。綜上所述，山藥對MC3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨分化具有促進(jìn)作用，且增加了細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的成骨因子IGF-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。為山藥治療骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究提供了科學(xué)依據(jù)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。1陳玉鳳, 郭獻(xiàn)山, 王林棟, 等.糖尿病合并非創(chuàng)傷性骨折的發(fā)生部位和危險(xiǎn)因素J.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版) , 2015, 50 (1) :138-141.2、沈夏英，沈序英，鄺海東，等 社區(qū)骨質(zhì)疏松防治健康教育模式探討 當(dāng)代醫(yī)學(xué)

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