流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗方法及應(yīng)用

1、 科研型科研型 分選功能分選功能 488nm488nm激光激光 四色熒光四色熒光 (525(525、575575、610610 、675nm675nm） 流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于細(xì)胞計數(shù)自動化的流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于細(xì)胞計數(shù)自動化的 研究。其原理是被熒光染色的單細(xì)胞或顆粒，研究。其原理是被熒光染色的單細(xì)胞或顆粒， 經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì)經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì) 胞依次通過流動室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒胞依次通過流動室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒 光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號，這些熒光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號，這些熒 光信號可以反映細(xì)胞的生物特性。光信號可以

2、反映細(xì)胞的生物特性。 前向散射 激光 FCMFCM的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如 何形成單個細(xì)胞流）何形成單個細(xì)胞流） 樣本管樣本管 鞘液管鞘液管 近近3030年來流式細(xì)胞術(shù)在我國得到很年來流式細(xì)胞術(shù)在我國得到很 快的發(fā)展，應(yīng)用范圍不斷增大。目前，快的發(fā)展，應(yīng)用范圍不斷增大。目前， 流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)廣泛流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)廣泛 應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞 遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等臨床 醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。 速度快速度快 極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測上萬極短

3、時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測上萬 個個 細(xì)胞，甚至幾萬個細(xì)胞。細(xì)胞，甚至幾萬個細(xì)胞。 多參數(shù)分析多參數(shù)分析 可同時分析單個細(xì)胞的多種特性，獲得單個細(xì)可同時分析單個細(xì)胞的多種特性，獲得單個細(xì) 胞多種信息，也可以根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志的不同把胞多種信息，也可以根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志的不同把 細(xì)胞群分為各亞群。細(xì)胞群分為各亞群。 定性、定量分析細(xì)胞定性、定量分析細(xì)胞 通過熒光染色對單細(xì)胞的某些成分，如：通過熒光染色對單細(xì)胞的某些成分，如：DNADNA、 抗原或受體等進(jìn)行定性、定量分析?？乖蚴荏w等進(jìn)行定性、定量分析。 靈敏度高靈敏度高 熒光能檢測到單個微粒上標(biāo)有熒光分子少于熒光能檢測到單個微粒上標(biāo)有熒光

4、分子少于 60010S10、G2/M15G2/M15或或S20S20、G2/M5G2/M5 白細(xì)胞分化抗原（白細(xì)胞分化抗原（CDCD分子）的命名：分子）的命名： 19821982年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)合會，年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)合會， 將所有抗體根據(jù)白細(xì)胞分化抗原反應(yīng)性的類型劃將所有抗體根據(jù)白細(xì)胞分化抗原反應(yīng)性的類型劃 分為分為2525群，把每一群抗體稱為一個群，把每一群抗體稱為一個分化抗體群分化抗體群 (Cluster of Differentiation(Cluster of Differentiation，CD)CD)，進(jìn)行編號、，進(jìn)行編號、 命名，即為單克隆抗體的國際命

5、名法。由命名，即為單克隆抗體的國際命名法。由CDCD抗體抗體 群識別的分化抗原就稱為群識別的分化抗原就稱為CDCD分子分子。目前已有。目前已有339339個個 分化抗體群被鑒定并命名分化抗體群被鑒定并命名 流式細(xì)胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準(zhǔn)確分類流式細(xì)胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準(zhǔn)確分類 計數(shù)淋巴細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞計數(shù)淋巴細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞 免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。血液淋巴細(xì)胞是一免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。血液淋巴細(xì)胞是一 群特異性極強(qiáng)的細(xì)胞，根據(jù)淋巴細(xì)胞的功能及群特異性極強(qiáng)的細(xì)胞，根據(jù)淋巴細(xì)胞的功能及 膜表面標(biāo)志，主要分為膜表面標(biāo)志，主要分為T T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(CD3+)

6、(CD3+)、B B淋淋 巴細(xì)胞巴細(xì)胞(CD19+)(CD19+)、NKNK細(xì)胞細(xì)胞(CD16+56+/CD3-)(CD16+56+/CD3-)三個三個 亞群。亞群。 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞（CD3+） 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞（CD19+） NK細(xì)胞細(xì)胞（CD16+56）+ NKNK細(xì)胞細(xì)胞: : CD(16+56)CD(16+56)+ +/CD3/CD3- - B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞: : CD19CD19+ +/CD3/CD3- - NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+ （T-cell） CD19+/CD3+ （T-cell

7、） CD19+/CD3- 50ul+10ul50ul+10ul相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體 避光孵育避光孵育15min 15min 加加OptiLyes COptiLyes C溶血素溶血素250ul 250ul 室溫室溫10min 10min PBS PBS洗一次洗一次 上機(jī)分析上機(jī)分析 抗體抗體: : CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三標(biāo)抗體三標(biāo)抗體 CD19-PE/CD3-FITCCD19-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體二標(biāo)抗體 CD16+56-PE/CD3-FITCCD16+56-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體二標(biāo)抗體 IgG-

8、FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型對照同型對照 淋巴細(xì)胞亞群檢測臨床淋巴細(xì)胞亞群檢測臨床意義：意義： CD3CD3+ +、CD4CD4+ +、CD8CD8+ +總數(shù)降低總數(shù)降低：細(xì)胞免疫功能低下細(xì)胞免疫功能低下 CD4CD4+ +（CD4CD4+ +/CD8/CD8+ +）降低或）降低或CD8CD8+ +(CD8+/CD4(CD8+/CD4+ +) )升高：升高： AIDSAIDS、病毒感染、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）、再生、病毒感染、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）、再生 障礙性貧血等障礙性貧血等 CD4CD4+ +(CD4(CD4+ +/

9、CD8/CD8+ +) )升高或升高或CD8CD8+ +(CD8(CD8+ +/CD4/CD4+ +) )降低降低：自：自 身身 免疫性疾、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧免疫性疾、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧 血血 CD3CD3+ +CD4CD4+ +CD8CD8+ +T T細(xì)胞減少細(xì)胞減少：見于免疫球蛋白缺乏癥、：見于免疫球蛋白缺乏癥、 胸腺發(fā)育不良、嚴(yán)重免疫缺陷病。胸腺發(fā)育不良、嚴(yán)重免疫缺陷病。 NK CD(16+56) NK CD(16+56) + + 活性低下：活性低下：腫瘤、白血病、自腫瘤、白血病、自 身免疫病、免疫缺陷病等身免疫病、免疫缺陷病等 NK+ CD(16+56) N

10、K+ CD(16+56) + + 活性增高：活性增高：多發(fā)性骨髓瘤、骨瘤、骨 髓移植感染、感染性疾病（髓移植感染、感染性疾病（B B病毒、皰疹病毒、肺病毒、皰疹病毒、肺 TBTB）、習(xí)慣性流產(chǎn)等）、習(xí)慣性流產(chǎn)等 CD19CD19+ +B B細(xì)胞減少：細(xì)胞減少：體液免疫抑制體液免疫抑制 CD19CD19+ +B B細(xì)胞增高細(xì)胞增高：B B細(xì)胞惡性增殖性疾病（白血?。┘?xì)胞惡性增殖性疾?。ò籽。?FCMFCM作為白血病輔助診斷，免疫分型是急作為白血病輔助診斷，免疫分型是急 白血病診斷的關(guān)鍵技術(shù)。利用不同類型的白血白血病診斷的關(guān)鍵技術(shù)。利用不同類型的白血 病具有不同抗原表達(dá)的特異性進(jìn)行分型：髓系、病

11、具有不同抗原表達(dá)的特異性進(jìn)行分型：髓系、 B B淋巴系、淋巴系、T T淋巴系、非系列特異性等。標(biāo)記方淋巴系、非系列特異性等。標(biāo)記方 法：往往需要胞漿和胞膜同時標(biāo)記，一線抗體法：往往需要胞漿和胞膜同時標(biāo)記，一線抗體 包括：胞漿包括：胞漿（髓系（髓系-MPO-MPO，B B淋巴系淋巴系-CD79a, T-CD79a, T淋巴系淋巴系- - cyCD3cyCD3）, ,胞膜胞膜( (髓系髓系-CD13-CD13、CD117CD117，B B淋巴系淋巴系-CD19-CD19、 CD10, TCD10, T淋巴系淋巴系-CD3-CD3、CD2)CD2)等等 采用采用CD45CD45和側(cè)向散射和側(cè)向散射

12、(SSC(SSC）設(shè)門技術(shù)可將各）設(shè)門技術(shù)可將各 細(xì)胞群分開，熒光從強(qiáng)細(xì)胞群分開，熒光從強(qiáng) 大到弱：大到弱：淋巴細(xì)胞群淋巴細(xì)胞群 單核細(xì)胞單核細(xì)胞 成熟粒細(xì)胞成熟粒細(xì)胞 原原/ /幼細(xì)胞幼細(xì)胞( (白血病細(xì)白血病細(xì) 胞胞) )，而成，而成熟的紅細(xì)胞熟的紅細(xì)胞 和血小板和血小板不表達(dá)。不表達(dá)。 各系表達(dá)的抗原各系表達(dá)的抗原 造血干細(xì)胞：造血干細(xì)胞：CD34CD34、CD33CD33 髓系表達(dá)髓系表達(dá) ：CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33 巨核細(xì)胞巨核細(xì)胞 ：CD61CD61、CD41CD41 B B細(xì)胞系：細(xì)胞系：CD10 CD10 、CD19CD19、CD20CD20 T T

13、細(xì)胞系：細(xì)胞系：CD2CD2、CD3CD3、CD5CD5、CD7CD7 NKNK細(xì)胞細(xì)胞: CD16: CD16、CD56CD56、CD57CD57 細(xì)胞因子（細(xì)胞因子（CKCK）主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生， 也可由非免疫細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)也可由非免疫細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì) 胞等產(chǎn)生。一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種胞等產(chǎn)生。一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種CKCK，一種，一種 CKCK也可由多種細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞因子分為也可由多種細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞因子分為4 4類：類： 白細(xì)胞介素（白細(xì)胞介素（lLlL）；干擾素（）；干擾素（IFNIFN）；造血）；造血 生長因子；腫瘤壞死因子（生長因子；腫瘤壞死因子（TN

14、FTNF）。）。 血液中未活化的白細(xì)胞內(nèi)無或僅極小量細(xì)胞因子，血液中未活化的白細(xì)胞內(nèi)無或僅極小量細(xì)胞因子， 當(dāng)其被各種激活劑活化后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子合成增加當(dāng)其被各種激活劑活化后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子合成增加 并不斷分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用。因此，要測定細(xì)胞并不斷分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用。因此，要測定細(xì)胞 內(nèi)的細(xì)胞因子較為困難。通常應(yīng)用內(nèi)的細(xì)胞因子較為困難。通常應(yīng)用刺激劑刺激劑（如：佛波（如：佛波 脂）來刺激細(xì)胞因子分泌脂）來刺激細(xì)胞因子分泌 ，同時加入一定濃度的細(xì)，同時加入一定濃度的細(xì) 胞內(nèi)蛋白分泌胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑抑制劑（如：莫能霉素），使細(xì)胞因子（如：莫能霉素），使細(xì)胞因子 合成后累積在細(xì)胞內(nèi)，通過

15、細(xì)胞因子特異的單克隆抗合成后累積在細(xì)胞內(nèi)，通過細(xì)胞因子特異的單克隆抗 體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進(jìn)體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進(jìn) 行多色分析各種細(xì)胞內(nèi)合成的細(xì)胞因子。行多色分析各種細(xì)胞內(nèi)合成的細(xì)胞因子。 全血或單細(xì)胞全血或單細(xì)胞+ +刺激素刺激素( (佛波脂佛波脂) )和和阻斷劑阻斷劑 ( (莫能霉素莫能霉素) ) 3737培養(yǎng)培養(yǎng)4-6h 4-6h 加入細(xì)胞加入細(xì)胞 表面抗體表面抗體( (如如CD3CD3、CD4/CD8) CD4/CD8) 孵育孵育20-20- 30min PBS30min PBS洗洗1 1次次 加固定破膜劑加固定破膜劑 室溫室溫15min

16、 15min 加入加入IFN- rIFN- r和和IL-4IL-4抗體抗體 孵育孵育30min PBS30min PBS洗兩次洗兩次 FCMFCM。 結(jié)果分析：結(jié)果分析：運(yùn)用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（運(yùn)用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（FSFS）和側(cè)）和側(cè) 向散射（向散射（SSSS）圈出淋巴細(xì)胞，再用）圈出淋巴細(xì)胞，再用CD3+CD3+和和SSCSSC設(shè)門圈出設(shè)門圈出T T淋淋 巴細(xì)胞，再用巴細(xì)胞，再用CD8-/CD3+CD8-/CD3+設(shè)門選定設(shè)門選定T T淋巴細(xì)胞亞群，再分析淋巴細(xì)胞亞群，再分析 IL-4+IL-4+和和CD4+/CD4+/IFN-IFN-r r 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)

17、胞（淋巴細(xì)胞（CD3+） CD3+CD8- （CD4+） IFN-r IL-4 檢測檢測 Fluo-3/AmFluo-3/Am是高特異性是高特異性CaCa2+ 2+熒光指示劑，能與 熒光指示劑，能與CaCa2+ 2+特 特 異結(jié)合。異結(jié)合。Fluo-3Fluo-3它本身是親水性，不易透過膜的，依賴其它本身是親水性，不易透過膜的，依賴其 脂溶性脂溶性AMAM（乙酰氧甲基）乙酰氧甲基），酯化后就容易跨過質(zhì)膜進(jìn)入胞漿，酯化后就容易跨過質(zhì)膜進(jìn)入胞漿， 在胞內(nèi)酯酶的作用下，脫去在胞內(nèi)酯酶的作用下，脫去AMAM重新生成親水性形式，一方重新生成親水性形式，一方 面不能再進(jìn)入細(xì)胞器，另一方面易于在胞內(nèi)擴(kuò)散，與

18、游離面不能再進(jìn)入細(xì)胞器，另一方面易于在胞內(nèi)擴(kuò)散，與游離 鈣離子結(jié)合，通過檢測其熒光強(qiáng)度可反映出細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合，通過檢測其熒光強(qiáng)度可反映出細(xì)胞內(nèi)游離 CaCa2+ 2+濃度的變化。 濃度的變化。 單細(xì)胞懸液單細(xì)胞懸液+flour-3/AM 37+flour-3/AM 37C C避光孵育避光孵育40min 40min PBS PBS洗洗1 1次次 上機(jī)檢測上機(jī)檢測 線粒體膜電位（線粒體膜電位（MMPMMP）是線粒體功能的重）是線粒體功能的重 要參數(shù)，是評價線粒體功能的敏感指標(biāo)，它要參數(shù)，是評價線粒體功能的敏感指標(biāo)，它 的大小直接反映線粒體功能及數(shù)量，的大小直接反映線粒體功能及數(shù)量，MMPMM

19、P下降，下降， 其氧化磷酸化功能障礙，使其氧化磷酸化功能障礙，使ATPATP產(chǎn)生減少，導(dǎo)產(chǎn)生減少，導(dǎo) 致細(xì)胞凋亡和壞死。致細(xì)胞凋亡和壞死。 Rhodamine123Rhodamine123（羅丹明（羅丹明123123）、）、DiOC6DiOC6、JC-1JC-1等多等多 種種親脂性的陽離子親脂性的陽離子熒光素都能被流式細(xì)胞分析用于熒光素都能被流式細(xì)胞分析用于 作為檢測作為檢測 MMPMMP的探針。這些親脂性熒光染料，對膜的探針。這些親脂性熒光染料，對膜 具有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電具有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電 位，位，線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)帶線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)帶負(fù)電荷負(fù)

20、電荷，當(dāng)它們與活細(xì)胞一當(dāng)它們與活細(xì)胞一 起培養(yǎng)時，這些陽離子熒光素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就能特異起培養(yǎng)時，這些陽離子熒光素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就能特異 地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。 當(dāng)當(dāng)MMPMMP降低后，線粒體內(nèi)的熒光素會發(fā)生外降低后，線粒體內(nèi)的熒光素會發(fā)生外 漏，在細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。檢測其熒光強(qiáng)漏，在細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。檢測其熒光強(qiáng) 度能反映線粒體數(shù)量和度能反映線粒體數(shù)量和MMPMMP的降低或喪失。的降低或喪失。 操作：操作：單細(xì)胞懸液（單細(xì)胞懸液（1 1* *10 10 6 6 ）+1umol/L+1umol/L的的 Rh123 Rh123 3

21、7 37 C,30minC,30min PBS PBS洗兩次洗兩次 上機(jī)檢測上機(jī)檢測 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理 條件下，遵循自身的程序結(jié)束其生命的過條件下，遵循自身的程序結(jié)束其生命的過 程。細(xì)胞凋亡為一種可調(diào)控的、主動的細(xì)程。細(xì)胞凋亡為一種可調(diào)控的、主動的細(xì) 胞死亡過程，有很多的促進(jìn)或抑制凋亡的胞死亡過程，有很多的促進(jìn)或抑制凋亡的 調(diào)控途徑存在，因而就可以人為地誘導(dǎo)或調(diào)控途徑存在，因而就可以人為地誘導(dǎo)或 抑制某些細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到防病、治抑制某些細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到防病、治 病的目的。病的目的。 半胱氨酸蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶（CaspaseCaspa

22、se）以無活性的酶）以無活性的酶 原形式存在細(xì)胞內(nèi)，需被水解加工后才能成為有原形式存在細(xì)胞內(nèi)，需被水解加工后才能成為有 活性的片段。活化的活性的片段?；罨腃aspaseCaspase進(jìn)一步激活其他的進(jìn)一步激活其他的 CaspaseCaspase前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，是直前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，是直 接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，目前已發(fā)現(xiàn)接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，目前已發(fā)現(xiàn) 1515個個CaspaseCaspase家族成員，分別命名為家族成員，分別命名為Caspase1-Caspase1- 1515。在。在CaspaseCaspase家族成員中，家族成員中，Caspas

23、e-3Caspase-3是最重是最重 要的指示蛋白酶。要的指示蛋白酶。 操作：操作： 單細(xì)胞懸液（單細(xì)胞懸液（1 1* *10 10 6 6） 固定和破膜劑固定和破膜劑 冰浴冰浴20min Perm/Wash Buffer20min Perm/Wash Buffer洗兩次洗兩次 20ul20ul單抗單抗 室溫孵育室溫孵育30min 30min Perm/Wash BufferPerm/Wash Buffer洗洗1 1次次 加加0.5ml 0.5ml Perm/Wash Buffer Perm/Wash Buffer 上機(jī)檢測上機(jī)檢測。 細(xì)胞凋亡過程中有多種基因蛋白參與調(diào)細(xì)胞凋亡過程中有多種基因

24、蛋白參與調(diào) 控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導(dǎo)凋亡基因控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導(dǎo)凋亡基因 和抗凋亡基因。主要有和抗凋亡基因。主要有bcl-2bcl-2家族、家族、P53P53、 cedced基因家族等?；蚣易宓取?抗凋亡基因抗凋亡基因:bcl-2:bcl-2、bcl-XLbcl-XL、BadBad 等 促凋亡基因促凋亡基因:bax:bax、bakbak、bcl-XSbcl-XS等等 染色標(biāo)記同CaspaseCaspase FasFas又稱又稱APO-1APO-1，即，即CD95CD95分子，是細(xì)胞膜上的跨分子，是細(xì)胞膜上的跨 膜蛋白，表達(dá)在各種組織細(xì)胞，是典型的細(xì)胞死亡膜蛋白，表達(dá)在各種組織

25、細(xì)胞，是典型的細(xì)胞死亡 受體。受體。Fas/FasLFas/FasL是凋亡誘導(dǎo)家族的重要成員之一，是凋亡誘導(dǎo)家族的重要成員之一， 是調(diào)節(jié)組織發(fā)育和體內(nèi)平衡的重要分子是調(diào)節(jié)組織發(fā)育和體內(nèi)平衡的重要分子,Fas/FasL,Fas/FasL 結(jié)合結(jié)合, ,可向細(xì)胞傳遞死亡信號可向細(xì)胞傳遞死亡信號, ,引起細(xì)胞凋亡。引起細(xì)胞凋亡。 檢測：同表面標(biāo)記檢測：同表面標(biāo)記 被認(rèn)為比較成熟的方法：被認(rèn)為比較成熟的方法： PIPI單染色法單染色法 Annexin VAnnexin VPIPI雙染法。雙染法。 TUNELTUNEL法法 碘化丙啶（碘化丙啶（PIPI）單染法）單染法（DNADNA周期分析）周期分析）：

26、 由于凋亡細(xì)胞由于凋亡細(xì)胞DNADNA被降解，小分子被降解，小分子DNADNA可可 通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外，另外凋亡小體也通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外，另外凋亡小體也 可帶走部分可帶走部分DNADNA，造成凋亡細(xì)胞，造成凋亡細(xì)胞DNADNA含量減少，含量減少， 與熒光染料結(jié)合減少，熒光強(qiáng)度減弱，在與熒光染料結(jié)合減少，熒光強(qiáng)度減弱，在DNADNA 直方圖上顯示在直方圖上顯示在G0/G1G0/G1峰前出現(xiàn)一個峰前出現(xiàn)一個DNADNA含量含量 減少的減少的亞二倍體峰亞二倍體峰，稱凋亡細(xì)胞峰。，稱凋亡細(xì)胞峰。 Annexin VAnnexin VPIPI雙染法：雙染法： 在凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變中，胞膜的改變

27、是最在凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變中，胞膜的改變是最 早的。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨早的。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨 酸（酸（PSPS）從細(xì)胞膜內(nèi)層翻轉(zhuǎn)，暴露在凋亡細(xì)胞表）從細(xì)胞膜內(nèi)層翻轉(zhuǎn)，暴露在凋亡細(xì)胞表 面，構(gòu)成早期凋亡的重要生化特征，面，構(gòu)成早期凋亡的重要生化特征，PSPS被特異的被特異的 Annexin V-FITCAnnexin V-FITC探針?biāo)鶚?biāo)記，而探針?biāo)鶚?biāo)記，而PIPI對細(xì)活細(xì)胞和對細(xì)活細(xì)胞和 早期凋亡細(xì)胞是拒染的，故早期凋亡細(xì)胞是拒染的，故Annexin V-FITC/PIAnnexin V-FITC/PI雙雙 染法能區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。染法能

28、區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。 機(jī)械損傷細(xì)胞：機(jī)械損傷細(xì)胞： Annexin V -/PI+Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、壞死細(xì)晚期凋亡、壞死細(xì) 胞：胞：Annexin V Annexin V +/PI+/PI+ 早期凋亡細(xì)胞：早期凋亡細(xì)胞： Annexin V +/PI-Annexin V +/PI- 活細(xì)胞：活細(xì)胞： Annexin V -/PI-Annexin V -/PI- TUNELTUNEL法：法： 細(xì)胞凋亡時，雙鏈細(xì)胞凋亡時，雙鏈DNADNA會出現(xiàn)斷裂點(diǎn)，即產(chǎn)會出現(xiàn)斷裂點(diǎn)，即產(chǎn) 生一系列生一系列3 3 端。在脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶端。在脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)(

29、TdT) 催化的反應(yīng)下，能將熒光素催化的反應(yīng)下，能將熒光素-脫氧尿苷三磷酸脫氧尿苷三磷酸 (dUTP) (dUTP) 標(biāo)記到斷裂的標(biāo)記到斷裂的DNADNA末端，從而使凋亡的末端，從而使凋亡的 細(xì)胞具有熒光。細(xì)胞具有熒光。 HLA-B27HLA-B27 淋巴細(xì)胞亞群淋巴細(xì)胞亞群（CD3CD3、CD4CD4、CD8CD8、CD16+56CD16+56、CD19CD19） 白血病免疫分型（白血病免疫分型（CD2CD2、CD3CD3、CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33、CD34CD34、CD117CD117、 CD79aCD79a、cCD3cCD3、MPOMPO等）等） 陣發(fā)性血紅蛋

30、白尿（陣發(fā)性血紅蛋白尿（CD55CD55、CD59CD59） 血小板活化指標(biāo)（血小板活化指標(biāo)（CD62PCD62P、CD63CD63） 細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析 FCMFCM的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如 何形成單個細(xì)胞流）何形成單個細(xì)胞流） 樣本管樣本管 鞘液管鞘液管 速度快速度快 極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測上萬極短時間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測上萬 個個 細(xì)胞，甚至幾萬個細(xì)胞。細(xì)胞，甚至幾萬個細(xì)胞。 多參數(shù)分析多參數(shù)分析 可同時分析單個細(xì)胞的多種特性，獲得單個細(xì)可同時分析單個細(xì)胞的多種特性，獲得單個細(xì) 胞多種信息，也可以根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志的不同把胞多種信息，也可以根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)

31、志的不同把 細(xì)胞群分為各亞群。細(xì)胞群分為各亞群。 五、熒光標(biāo)記五、熒光標(biāo)記 主要包括主要包括間接間接免疫熒光染色和免疫熒光染色和直接直接免免 疫熒光染色兩種方法。疫熒光染色兩種方法。 間接標(biāo)記間接標(biāo)記是采用特異的是采用特異的無熒光標(biāo)記無熒光標(biāo)記的一的一 抗與待測標(biāo)本反應(yīng)后，洗去未結(jié)合抗體再加抗與待測標(biāo)本反應(yīng)后，洗去未結(jié)合抗體再加 入熒光標(biāo)記的二抗，形成有熒光的抗原入熒光標(biāo)記的二抗，形成有熒光的抗原-抗抗 體體-抗體復(fù)合物。其操作復(fù)雜、費(fèi)時，目前抗體復(fù)合物。其操作復(fù)雜、費(fèi)時，目前 很少用。在科研中需要一些新的抗體沒有直很少用。在科研中需要一些新的抗體沒有直 接抗體，只能采用此方法。接抗體，只能采用此方法。 直接標(biāo)記直接標(biāo)記是在標(biāo)記時加入是在標(biāo)記時加