系統(tǒng)生物學(xué)-轉(zhuǎn)錄組學(xué)與microRNA研究

1、microRNA Small molecular, Big world DNA RNA 蛋白質(zhì) 基因組學(xué) RNA組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量 人： 30,000 果蠅和線蟲：12,000-14,000 釀酒酵母： 6,200 假單孢菌： 5,500 人和鼠的蛋白質(zhì)編碼基因99%是共同的。 人個體間單倍體基因組的堿基差異300萬個，其中1萬 個（0.3%）出現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼基因中。 98%轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是非編碼蛋白RNA。 2倍 2倍 RNA的分類 細(xì)胞核和胞液 線粒體 功能 核蛋白體RNA rRNA mt rRNA 核蛋白體組成成分 信使RNA mRNA mt mRNA 蛋白質(zhì)合成模板 轉(zhuǎn)運(yùn)R

2、NA tRNA mt tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸 不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前體 小核RNA snRNA 參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn) 運(yùn) 小胞漿RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的 信號識別體的組成成分 新定義 The complete collection of transcribed elements of the genome. (Affymetrix, 2004) mRNA rRNA, tRNA snmRNAs (small non-messenger RNAs) microRNAs and siRNAs (small interferring RNAs)

3、 snoRNAs (small nucleolar RNAs) 核仁小分子RNA snRNAs (small nuclear RNAs) Other non-coding RNAs Long non-coding RNA (lncRNA) 有些小有些小RNA分子能直接調(diào)控某些基因的開關(guān)從而控制細(xì)胞的分子能直接調(diào)控某些基因的開關(guān)從而控制細(xì)胞的 生長發(fā)育并決定細(xì)胞分化的組織類型生長發(fā)育并決定細(xì)胞分化的組織類型 小小RNA分子本身又包含了若干類分子本身又包含了若干類RNA，根據(jù)小，根據(jù)小RNA 的生成的生成 、結(jié)構(gòu)和功能大約可分為以下三類：、結(jié)構(gòu)和功能大約可分為以下三類： miRNA （microR

4、NA) siRNA (small interfering RNA) 其他小其他小RNA MicroRNA 簡介 (1)長度為21nt左右核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分 子RNA；(2)存在65nt左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體；(3)基 因座位于蛋白質(zhì)基因間隔區(qū)；(4)其DNA序列在近 源物種間高度保守。 miRNA具有十分重要的調(diào)控功能，它們主要參 與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 。能夠通過與靶mRNA特 異性的堿基配對引起靶mRNA的降解（植物中較為 常見）或者抑制其翻譯（動物中較為常見），從 而影響了靶mRNA的表達(dá)。 microRNA(miRNA) 是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的是廣泛存在于真

5、核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的 RNA家族，它們是由家族，它們是由19-23個核苷酸組成的單鏈個核苷酸組成的單鏈RNA（3端端 可有可有12個堿基長度的變化）個堿基長度的變化） 表達(dá)具有組織特異性和階段特異性。即：在不同組織中表達(dá)表達(dá)具有組織特異性和階段特異性。即：在不同組織中表達(dá) 有不同類型的有不同類型的miRNA；在生物發(fā)育的不同階段里有不同的；在生物發(fā)育的不同階段里有不同的 miRNA表達(dá)表達(dá) 與靶與靶mRNA 3-UTR結(jié)合，序列特異性的在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控結(jié)合，序列特異性的在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 基因的翻譯表達(dá)基因的翻譯表達(dá) ，在生物發(fā)育、脂肪代謝、細(xì)胞的分化、增，在生物發(fā)育、脂肪代謝、

6、細(xì)胞的分化、增 殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用 miRNA具有高度保守性，即各種miRNA都能在其他種 系中找到同源體； miRNA獨(dú)有的特征：其5端第一個堿基對U有強(qiáng)烈的 傾向性，而對G卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏U， 一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺 乏C miRNA執(zhí)行一定的生物學(xué)功能： 對與其互補(bǔ)的mRNA表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用； 一些偏大的miRNA (27nt)可能參與了基因組的重組裝 參與生物的發(fā)育與多種生理、病理過程 19932000200120022003200420052006 2007 microRNA的研究歷史 Dr. Vi

7、ctor Ambros 2002年年 入選入選science年度十年度十 大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之首 miRNA and Cancer The first demonstration of a link between miRNA genes and cancer. The first paper to show that the deregulation of a single miRNA gene can lead to cancer. An elegant study that shows a pathogenetic link between miRNAs and target on

8、cogenes. miRNA controls some plant phenotype 據(jù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明據(jù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明miRNA的生成需要的生成需要兩個步驟兩個步驟： 1)由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA)經(jīng)經(jīng)Drosha酶酶作用生成作用生成70nt左右左右 的的miRNA前體前體(pre-miRNA)，該過程發(fā)生在細(xì)胞核，該過程發(fā)生在細(xì)胞核 2)將將pre-miRNA經(jīng)經(jīng)Dicer酶酶作用加工為成熟作用加工為成熟miRNA，該過程發(fā)生在細(xì)，該過程發(fā)生在細(xì) 胞質(zhì)中。胞質(zhì)中。 microRNA的加工成熟的加工成熟 通過生物信息的手段分析了microRNA 在

9、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子- microRNA相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用 據(jù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明據(jù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明miRNA的生成需要的生成需要兩個步驟兩個步驟： 1)由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA)經(jīng)經(jīng)Drosha酶酶作用生成作用生成70nt左右左右 的的miRNA前體前體(pre-miRNA)，該過程發(fā)生在細(xì)胞核，該過程發(fā)生在細(xì)胞核 2)將將pre-miRNA經(jīng)經(jīng)Dicer酶酶作用加工為成熟作用加工為成熟miRNA，該過程發(fā)生在細(xì)，該過程發(fā)生在細(xì) 胞質(zhì)中。胞質(zhì)中。 microRNA的加工成熟的加工成熟 首先由基因組轉(zhuǎn)錄形成長鏈?zhǔn)紫扔苫蚪M轉(zhuǎn)錄形成長鏈RNA分子分子pr

10、i-miRNA 約約60%的的microRNA為獨(dú)立轉(zhuǎn)錄表達(dá)；約為獨(dú)立轉(zhuǎn)錄表達(dá)；約15%miRNA為成簇為成簇 存在而共同轉(zhuǎn)錄；其余還有約存在而共同轉(zhuǎn)錄；其余還有約25%的的miRNA定位于功能基定位于功能基 因內(nèi)含子，隨基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因內(nèi)含子，隨基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 Pri-miRNA經(jīng)雙鏈經(jīng)雙鏈RNA核酸酶核酸酶Drosha酶作用，加工形成酶作用，加工形成70- 100nt長度的長度的pre-miRNA Pre-miRNA在在Exportin5介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)運(yùn)出胞核至胞質(zhì)中進(jìn)行介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)運(yùn)出胞核至胞質(zhì)中進(jìn)行 下一步加工下一步加工 Pre-miRNA在胞質(zhì)中經(jīng)雙鏈在胞質(zhì)中經(jīng)雙鏈RNA核酸酶核酸酶D

11、icer酶作用加工形成酶作用加工形成 單鏈成熟單鏈成熟miRNA分子分子 miRNA發(fā)揮作用過程發(fā)揮作用過程 19-23nt的成熟的成熟miRNA形成后與其他蛋白共同組成形成后與其他蛋白共同組成RNA介介 導(dǎo)的沉默復(fù)合體（導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）參與）參與RNA干擾途徑干擾途徑 miRNA形成形成RISC復(fù)合體后可與特定的靶復(fù)合體后可與特定的靶mRNA結(jié)合，這種結(jié)合，這種 結(jié)合不要求嚴(yán)格的互補(bǔ)配對。結(jié)合后導(dǎo)致靶結(jié)合不要求嚴(yán)格的互補(bǔ)配對。結(jié)合后導(dǎo)致靶mRNA翻譯的抑制翻譯的抑制 翻譯抑制 5end of the small RNA,28, known as the “seed region”

12、do not have a complex secondary structure and are located in accessible regions of the RNA microRNA識別靶位點(diǎn)識別靶位點(diǎn) microRNA作用機(jī)制作用機(jī)制 21-nt dsRNAs targeting selected promoter regions of human genes caused long-lasting and sequence- specific induction of targeted genes miRNA與與siRNA的聯(lián)系：的聯(lián)系： 均為均為Dicer的產(chǎn)物的產(chǎn)物 長

13、度均為長度均為22nt左右，左右，5端是磷酸基，端是磷酸基，3端是羥基端是羥基 均需均需Argonaute家族蛋白的存在家族蛋白的存在 同為同為RISC的組分的組分 二者進(jìn)化關(guān)系上可能的兩種推論：二者進(jìn)化關(guān)系上可能的兩種推論： siRNA是miRNA的補(bǔ)充 miRNA在進(jìn)化過程中替代了siRNA 沉默機(jī)制有重疊 miRNA的加工成熟過程與的加工成熟過程與RNAi技術(shù)中常用的技術(shù)中常用的siRNA有許多有許多 相似之處相似之處均經(jīng)過均經(jīng)過Dicer酶酶對對雙鏈雙鏈RNA的識別加工而形成的識別加工而形成單單 鏈鏈RNA分子分子。 miRNAsiRNA 產(chǎn)生產(chǎn)生 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)RNA的固有組分之一（的

14、固有組分之一（ 正常）正常） RNAi的活性形式，病毒感染和人工插的活性形式，病毒感染和人工插 入入dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生（異常）之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生（異常） 來源來源內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)基因或病毒轉(zhuǎn)基因或病毒RNA（外源）（外源） 直接來源直接來源發(fā)夾狀發(fā)夾狀pre-miRNA長長dsRNA 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)單鏈單鏈 雙鏈，雙鏈，3端有端有2個非配對堿基，通常為個非配對堿基，通常為 UU 互補(bǔ)性互補(bǔ)性不完全互補(bǔ)，存在錯配現(xiàn)象不完全互補(bǔ)，存在錯配現(xiàn)象完全互補(bǔ)完全互補(bǔ) 對靶對靶RNA特異性特異性 相對較低，一個突變不影響相對較低，一個突變不影響 miRNA的效應(yīng)的效應(yīng) 較高，一個突變即引起較高，一個突變即

15、引起RNAi沉默效應(yīng)沉默效應(yīng) 的改變的改變 途徑途徑miRNA途徑途徑RNAi途徑途徑 對對RNA的影響的影響 在在RNA代謝的各個層面進(jìn)行調(diào)代謝的各個層面進(jìn)行調(diào) 控控 降解靶降解靶mRNA 功能功能 調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，在蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，在蛋白 質(zhì)合成水平發(fā)揮作用，與質(zhì)合成水平發(fā)揮作用，與 mRNA的穩(wěn)定性無關(guān)的穩(wěn)定性無關(guān) 抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染，在轉(zhuǎn)錄抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染，在轉(zhuǎn)錄 后水平發(fā)揮作用后水平發(fā)揮作用,影響影響mRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性 miRNA與siRNA的區(qū)別 microRNA研究的興起與發(fā)展 miRNAmiRNA發(fā)展中發(fā)展中 遇到的問題：遇到的問題： 在各種生物

16、中在各種生物中 目前靶基因檢測目前靶基因檢測 工作成為工作成為miRNAmiRNA 功能研究的瓶頸功能研究的瓶頸 miRNA的獲取 miRNAmiRNA 分子的序列分子的序列短小短小 1）在基因組中存在較多的互補(bǔ)序列 2）在不同生物體內(nèi)與靶基因結(jié)合的方式也不盡相同 3）通常與多種蛋白相互作用 這使得建立一個有效而且普遍適用的研究 方法異常困難。 #到目前為止,miRBase上公布的miRNA總數(shù)將近3 000 種。 #現(xiàn)在已知靶基因的miRNA多是通過基因克隆和生物信 息學(xué)篩選的方法發(fā)現(xiàn)的。 miRNA的獲取系統(tǒng)生物學(xué)篩選 隨著生物全基因組測序的完成,利用計算機(jī)對基因組序列進(jìn)行搜索可以大大提高

17、 miRNA的鑒定效率。所以,人們根據(jù)目前根據(jù)目前已知的已知的miRNAmiRNA基因序列總結(jié)它們的特征和規(guī)基因序列總結(jié)它們的特征和規(guī) 律律, ,編寫編寫了一些了一些計算機(jī)程序計算機(jī)程序, ,通過對生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通過對生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索搜索, ,可以找到那些可能可以找到那些可能 為為miRNAmiRNA的基因序列的基因序列, ,然后通過然后通過Northern blottingNorthern blotting來篩選真正的來篩選真正的miRNAmiRNA 基因基因。 生物信息學(xué)方法是依據(jù)在不同的物種中，其成熟的成熟的miRNAmiRNA 具有較大的序具有較大的序 列同源性以及前體的

18、莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性列同源性以及前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性這一特征在基因組數(shù)據(jù)庫中搜索 新的miRNA 基因。該方法根據(jù)比較基因組學(xué)原理并結(jié)合生物信息軟件在已測序基因 組中進(jìn)行搜索比對，根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行RNARNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，將符合條件的候?qū)⒎蠗l件的候 選選miRNAmiRNA與已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)鑒定的與已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)鑒定的miRNAmiRNA分子進(jìn)行比較分析分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種最終確定該物種miRNAmiRNA的的 分布及數(shù)量分布及數(shù)量。近年來隨著miRNA預(yù)測方法的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量呈幾何 級數(shù)增長。這些預(yù)測方法從

19、簡單的序列比對搜索發(fā)展到現(xiàn)在的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，程序 設(shè)計越來越智能化，復(fù)雜化。 miRNA的獲取系統(tǒng)生物學(xué)篩選 系統(tǒng)生物學(xué)手段可以說是一種更高通量的方系統(tǒng)生物學(xué)手段可以說是一種更高通量的方 法。通常有以下幾種方法法。通常有以下幾種方法: : miRscan是一種基于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序, 通過掃描兩種系之間是否存在同源的莖環(huán)結(jié) 構(gòu), 應(yīng)用于檢測脊椎動物和線蟲脊椎動物和線蟲的候選基因。 miRNA的獲取生物信息學(xué)篩選 Mirseeker是一種檢查RNA序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序,應(yīng)用于篩選 昆蟲昆蟲的候選基因。 它是根據(jù)3個標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測的:一是具有長度為70100 nt莖環(huán)結(jié)構(gòu) 的Pre-miRNA;二是

20、不同種系生物中Pre-miRNA的保守性;三是miRNA 的核苷酸差異性。 ERP IN是一種類似于BLAST的校對程序,用于搜尋動物動物基因組中 與miRNA 序列類似的序列。 MiPred可以通過random forest預(yù)測模型和miRNA特征的結(jié)合,區(qū) 分miRNA 的真正前體和假冒前體。 miRBase序列數(shù)據(jù)庫 miRBase序列數(shù)據(jù)庫是一個提供包括miRNA序列數(shù)據(jù)、 注釋、預(yù)測基因靶標(biāo)等信息的全方位數(shù)據(jù)庫，是存儲miRNA 信息最主要的公共數(shù)據(jù)庫之一。miRBase提供便捷的網(wǎng)上查 詢服務(wù)，允許用戶使用關(guān)鍵詞或序列在線搜索已知的miRNA 和靶標(biāo)信息，詳情請（http:/www

21、./）。 2012年8月1日正式發(fā)布。相比于以往版本的數(shù)據(jù)庫 （Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫），19.0版數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了巨 大的數(shù)據(jù)更新：miRNA發(fā)夾前體序列已升至21264條，新增 3171條；成熟miRNA升至25141條，新增3625條；已發(fā)布的 miRNA序列共涵蓋193個物種，相比于18.0版新增25個物種。 新版數(shù)據(jù)庫對miRNA序列注釋和命名進(jìn)行了系統(tǒng)的修正， miR*命名已經(jīng)終止使用，取而代之的是-5p和-3p的命名法。 miRNA的確認(rèn) 判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷標(biāo)準(zhǔn): : 能夠通過與特定大小的總RNA樣品雜交得到22個堿基對 ( 22nt)的產(chǎn)物(即需要

22、Northern雜交或引物延伸反應(yīng)驗(yàn)證 表達(dá)) 。 所得的序列是從特定大小的( 22nt)的小分子RNA庫中克 隆到的, 并且必需與克隆的來源物種的基因組序列完全匹配。 經(jīng)過前體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,有發(fā)夾狀的二級結(jié)構(gòu),并且成熟 的miRNA序列在發(fā)夾的一條臂上。 成熟的miRNA序列與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)在不同物種間有保守 性。 在Dicer突變的系統(tǒng)中,前體的積累增多。 要確認(rèn)基因克隆獲得的或生物信息學(xué)分析預(yù)測的 基因是否為真正的miRNA,就應(yīng)該采用上面5個原則來檢驗(yàn)。 miRNA的靶基因 miRNAmiRNA的靶基因預(yù)測的靶基因預(yù)測 miRNAmiRNA的靶基因檢測的靶基因檢測 miRNAmiRN

23、A的生物學(xué)功能的生物學(xué)功能 miRNA的靶基因預(yù)測 以前,研究miRNA的靶基因依賴于正向遺傳學(xué)方法,包括突變體的產(chǎn) 物、變形篩選、定位克隆和miRNA及其靶基因的確認(rèn),如lin24和let27 及它們的靶基因的發(fā)現(xiàn)。在果蠅中,miRNA bantam及其靶基因hid的發(fā) 現(xiàn)就是正向遺傳學(xué)研究miRNA的經(jīng)典過程。 反向遺傳學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)的方法比正向反向遺傳學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)的方法比正向遺傳學(xué)遺傳學(xué)更優(yōu)越。更優(yōu)越。它主要 是由軟件來預(yù)測miRNA的靶基因并為分子實(shí)驗(yàn)提供指標(biāo)，其基本原理 是基于miRNA與其靶基因的自然配對。已知miRNA及其靶基因之間的對 比和相關(guān)性, lin24、let27

24、和bantam基因的確認(rèn)等都為計算機(jī)程序發(fā) 展提供了更多的信息。 計算機(jī)程序預(yù)測方法在植物種屬中運(yùn)用的很成功,而在動物中則 不是很成功,這可能是因?yàn)橹参镏械膍iRNA 與其靶基因幾乎完全配對 結(jié)合。而在動物中,miRNA與靶基因mRNA通常以不精確的堿基互補(bǔ)配對 結(jié)合。 miRNA的靶基因預(yù)測 miRNA的研究意義之重大是毋庸置疑的。然而，與新的miRNA 的頻頻發(fā)現(xiàn)相比，miRNA的功能研究相對緩慢。 到目前為止，在發(fā)現(xiàn)的在發(fā)現(xiàn)的44494449多個多個miRNAmiRNA中，確定功能的中，確定功能的miRNAmiRNA 僅有幾十個僅有幾十個。 導(dǎo)致miRNA功能研究進(jìn)展緩慢的非常重要的原因

25、是miRNAmiRNA的作的作 用靶標(biāo)難以確定用靶標(biāo)難以確定。 通過實(shí)驗(yàn)方法確定miRNA的作用靶標(biāo)非常耗時，目前尚無高 通量的靶標(biāo)鑒定方法。 因此，通過理論方法預(yù)測miRNA的作用靶標(biāo)成為當(dāng)前識 別miRNA作用靶標(biāo)的較為理想的途徑。以下重點(diǎn)介紹幾種經(jīng)典預(yù) 測軟件的算法分析： miRNA幾種常見的預(yù)測方法 下面概括介紹幾種常見的預(yù)測下面概括介紹幾種常見的預(yù)測方法：方法： () () miRandamiRanda. . miRanda 是最早的一個利用生物信息學(xué)對miRNA 靶基因進(jìn)行預(yù)測的軟 件, 由Enright等人于2003 年設(shè)計開發(fā). 其對3UTR 的篩選依據(jù)主 要是從序列匹配、mi

26、RNA 與mRNA 雙鏈的熱穩(wěn)定性以及靶位點(diǎn)的保守 性三個方面進(jìn)行分析. miRanda 軟件首先選取了黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中已 知的73 條miRNA 作為探針, 采用類似于Smith-Waterman 的算法對 9805 個3UTR 進(jìn)行堿基互補(bǔ)分析. 首先, 互補(bǔ)參數(shù)被設(shè)定為: GC, AU 為+5, GU 為+2, 其他配 對方式為3, 同時起始空位(gap-opening)罰分為8, 延伸空位(gap- extension)罰分為2; *序列序列比對比對就是通過一定的算法對兩個或多個序列進(jìn)行比較,找出序列間最大的相似性匹配。*Smith 最后,

27、miRNA 與靶mRNA 的互補(bǔ)還要遵循以 下4 個規(guī)則: miRNA 第24 位堿基和靶基因精確匹配; 第312 位堿基和靶基因錯配不得多于5 個; 9L-5(L 為miRNA 總長)位堿基最少一個錯配; 最后5 個堿基錯配不得多于2 個. miRanda 在熱穩(wěn)定性方面, miRanda 采用Vienna 軟件 包計算miRNA 與3UTR 作用的自由能(G). 在物種間保守性方面, 要求靶位點(diǎn)在多物種 3UTR 比對中相同位置處堿基相同. 綜合以上3 條原則, miRanda 選取每選取每 條條miRNAmiRNA相對的相對的3UTR 3UTR 中排名前中排名前10 10 位的基因位的基

28、因, 作為miRNAmiRNA的候選靶基因的候選靶基因, 對于多個miRNA 對應(yīng) 于同一靶位點(diǎn)的情況, miRanda 則使用貪心算法 (Greedy Algorithm)選取其中得分最高且自由能 最低的那一對. TargetScan () () TargetScanTargetScan 和和TargetScanSTargetScanS. . TargetScan 是Lewis 等人在2003 年開發(fā)的一款用于預(yù)測哺乳動物miRNA 靶基因的軟件, 該軟件將RNA 間相互作用的熱力學(xué)模型與序列比對分析 相結(jié)合, 預(yù)測不同物種間保守的miRNA 結(jié)合位點(diǎn). 與miRanda 不同, 在Targ

29、etScan 的算法中, 要求miRNA5端第第28 28 位堿位堿 基與基與mRNA mRNA 的的3UTR 3UTR 完全互補(bǔ)完全互補(bǔ), , 這這7 7 個核苷酸被稱作個核苷酸被稱作“miRNAmiRNA 種子區(qū)種子區(qū)/ /關(guān)關(guān) 鍵區(qū)鍵區(qū)”（seed regionseed region）. 種子區(qū)向兩側(cè)延伸直到出現(xiàn)堿基錯配為止, 這 期間允許GU配對, 同時利用RNAFold 計算結(jié)合位點(diǎn)的自由能. TargetScan 中引入了信號噪聲比信號噪聲比來評估預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確度, 所謂信號噪 聲比即用已知(信號組)和隨機(jī)生成的miRNA(噪聲組)分別對mRNA 的 3UTR 進(jìn)行預(yù)測, 所得靶基

30、因數(shù)目的比值. 當(dāng)僅針對人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的3UTR 對miRNA 靶 位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測時, 信號噪聲比為21 針對人、小鼠、大鼠(Rattus norvegicus)的3UTR 進(jìn)行預(yù)測時信號噪 聲比為3.21 研究范圍擴(kuò)大到人、小鼠、大鼠和河豚(Takifugu rubripes)時, 信號噪 聲比為4.61. 隨著物種數(shù)目的增多, 預(yù)測得到的靶基因減少, 但準(zhǔn)確性得到 了相應(yīng)的提高. TargetScanS 后來, Lewis 等人又對TargetScan 進(jìn)行了優(yōu)化,即 TargetScanS. TargetScanS 在人、小鼠、大鼠的基礎(chǔ)上增加了狗(Canis familiaris)和雞(Gallus gallus)的基因組數(shù)據(jù), 同時在算法上做了改動, 將種子區(qū)由先前的將種子區(qū)由先前的7 7 個核苷酸調(diào)整個核苷酸調(diào)整 為為55端第端第27 27 位堿基