1048.利用MTT法測(cè)定鹽酸氮芥注射液對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制效果

1、利用mtt法測(cè)定鹽酸氮芥注射液對(duì)hela細(xì)胞增殖的抑制效果 摘要：研究鹽酸氮芥注射液對(duì)hela細(xì)胞增殖的抑制效果。方法：應(yīng)用mtt法分析不同濃度的鹽酸氮芥注射液（chlormethinehydrochlorideinjection）對(duì)hela細(xì)胞增殖的抑制效果。結(jié)果：隨著氮芥注射液濃度的逐漸增加，od值逐漸減?。挥杉?xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式可以得出不同濃度的氮芥注射液對(duì)hala細(xì)胞的增殖抑制率分別為（15g/ml、30g/ml、60g/ml、120g/ml）的氮芥注射液對(duì)hala細(xì)胞的增殖抑制率分別為：-25.88% -57.76% -71.01% -83.64%。從結(jié)果可知，hala細(xì)胞增殖抑制

2、率隨著氮芥注射液濃度的增高而增大。關(guān)鍵詞：mtt法 鹽酸氮芥注射液 hela細(xì)胞抗癌藥物體外敏感性試驗(yàn)一直是臨床化療界矚目的問題?，F(xiàn)今已建立了多種腫瘤化療藥敏試驗(yàn)方法，但因成功率低和受試條件限制，都未能在臨床推廣應(yīng)用1。由mosman(1983) 建立的mtt顯色法是近年來用于驗(yàn)測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖影響的新指標(biāo)。mtt比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色（或藍(lán)色）結(jié)晶甲瓚（formazan）并沉積在細(xì)胞中；在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比。二甲基亞砜（dmso）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，因此用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在4

3、90nm或570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入mtt 不會(huì)有反應(yīng)。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。鹽酸氮芥注射液是一種脂肪氮芥，是最早應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物之一。它是一種強(qiáng)烷化劑,對(duì)腫瘤的殺傷能力較大,抗瘤譜廣,但選擇性較差,毒性也較大。本文應(yīng)用mtt法分析了不同濃度的鹽酸氮芥注射液對(duì)hela細(xì)胞增殖的抑制效果。1 材料與方法1.1 材料制備用基礎(chǔ)培養(yǎng)液分別配置濃度梯度分別為15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml、120ug/ml的

4、氮芥注射液備用。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 接種收集對(duì)數(shù)期hela細(xì)胞細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，使細(xì)胞濃度為23104/ml，每孔加入細(xì)胞懸液200l，使每孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)為4000- 6000個(gè)。1.2.2 培養(yǎng)與藥物處理培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2436h，吸出培養(yǎng)液加入不同濃度梯度15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml、120ug/ml的氮芥注射液各200 l，每個(gè)濃度接種4孔作為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，設(shè)置一個(gè)調(diào)零孔（培養(yǎng)基、mtt、二甲基亞砜），和一個(gè)對(duì)照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)液、mtt、二甲基亞砜），為后面的實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。1.2.3 呈色培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)到第3天，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞

5、生長(zhǎng)情況后，每孔加5 mg/ml的mtt溶液20 l，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)；快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液；然后每孔加dmso 150l，振蕩30min，使結(jié)晶物充分融解。1.2.4 比色選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。1.2.5 計(jì)算與分析按照公式計(jì)算各種藥物處理對(duì)細(xì)胞增殖率的影響。細(xì)胞增殖抑制率（未加藥物處理的對(duì)照組吸光值藥物處理組的吸光值）/未加藥物處理的對(duì)照組吸光值。若該值為正說明藥物對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，若值為零表明藥物對(duì)細(xì)胞增殖無影響；若值為負(fù)說明藥物對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析 表一：不同濃度的鹽酸氮芥注射液對(duì)hela

6、細(xì)胞的抑制率鹽酸氮芥注射液（ug/ml）空白組對(duì)照組153060120od值0.0630.4830.3580.2040.1400.079抑制率-25.88%-57.76%-71.01%-83.64%圖一 不同濃度鹽酸氮芥注射液對(duì)hela細(xì)胞的抑制作用從表一可以看到，鹽酸氮芥注射液在濃度15g/ml-120g/ml范圍內(nèi)，隨著濃度的遞增，其對(duì)hela細(xì)胞的抑制越來越明顯，抑制率不斷上升，抑制率和劑量呈正相關(guān)趨勢(shì)，目前本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，濃度最高的那組濃度（120g/ml）對(duì)hela細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)（抑制率為-83.64%）。3.討論與分析： 鹽酸氮芥是一種脂肪氮芥，是最早應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物之一，其

7、抗腫瘤作用強(qiáng)，但其毒性過大，它們?cè)跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷了大量的機(jī)體增殖旺盛的體細(xì)胞引起機(jī)體抵抗力下降，而且在水中容易分解，故限制了其在臨床上的應(yīng)用。2-3如何選擇適當(dāng)?shù)乃幬餄舛龋蔀橐粋€(gè)關(guān)鍵。 本次實(shí)驗(yàn)采用了不同的濃度藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抑制。結(jié)果顯示：抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)，濃度最高的那一組，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制也最明顯。說明了此藥能很好地限制了腫瘤細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)。測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況是采用mosman創(chuàng)立的mtt比色分析法4，這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)可通過測(cè)定線粒體能量代謝，以反映細(xì)胞的增殖情況，mtt測(cè)定是細(xì)胞內(nèi)的線粒體酶可將黃綠色的mtt降解形成藍(lán)紫色甲綈，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定甲綈的含量來測(cè)定細(xì)

8、胞的存活比例。 本次是實(shí)驗(yàn)雖然得出結(jié)論，抗腫瘤效果與劑量成正相關(guān)趨勢(shì)，但是如果進(jìn)一步提高藥物濃度，是不是就可以進(jìn)一步提高抑制效果？再者，本次實(shí)驗(yàn)也有很大的提升空間，雖然高劑量的藥物濃度殺傷了更多的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)它也殺傷了更多人體的正常細(xì)胞（如果是應(yīng)用于臨床上），副作用會(huì)更大。如果讓鹽酸氮芥注射液，同時(shí)對(duì)正常培養(yǎng)的體細(xì)胞進(jìn)行一個(gè)抑制，是不是可以得出一個(gè)濃度使得鹽酸氮芥注射液對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制教強(qiáng)，對(duì)體細(xì)胞抑制卻相對(duì)較小。或者得出鹽酸氮芥注射液對(duì)兩種細(xì)胞抑制的數(shù)據(jù)，為臨床應(yīng)用提供一個(gè)可以權(quán)衡利弊的參考依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1 陳婷梅，祝彼得 抗白血病及天然藥物的研究現(xiàn)狀，中西醫(yī)結(jié)合雜志，19952 劉鐵梅等 葡萄糖苯氮芥衍生物的合成及其抗腫瘤活性的研究 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué) 2007 3 任敏 鹽酸氮芥極其異構(gòu)體抗腫瘤研究 天津醫(yī)藥 2001 19 （12）4 campling bg, van cam