化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

1、 化學(xué)發(fā)光免疫分析 一、一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念 二、二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理 三、三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 四、臨床應(yīng)用四、臨床應(yīng)用 五、發(fā)展與展望五、發(fā)展與展望 一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光 的強(qiáng)度來確定物質(zhì)含量的分析方法。化學(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度來確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光 系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)

2、的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與 待測的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入待測的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或 定性檢測。定性檢測。 化學(xué)發(fā)光免疫測定是目前世界公認(rèn)先進(jìn)的標(biāo)記免疫測定技 術(shù)，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和特異性， 成為檢驗(yàn)方法中最為重要的技術(shù)之一?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析 技術(shù)作為疾病診斷的主要手段已被廣泛用于機(jī)體免疫功能 、傳染性疾病、內(nèi)分泌功能、腫瘤標(biāo)志物、性激素、甲狀 腺功能等方面的體外診斷實(shí)驗(yàn)中。 化學(xué)發(fā)光免疫分析

3、的優(yōu)勢 靈敏度高靈敏度高 靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可 達(dá) 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分 析能夠檢出放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無法檢出 的物質(zhì)，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。 寬的線性動力學(xué)范圍寬的線性動力學(xué)范圍 發(fā)光強(qiáng)度在 4 6 個量級之間與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯 色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）為 2.0 的范圍相比，優(yōu)勢明顯。雖 然 RIA 也有較寬的線性動力學(xué)范圍，但放射性限制了其應(yīng)用。 光信號持續(xù)時間長光信號持續(xù)時間長 輝光型的 CLIA 產(chǎn)生的光信號持續(xù)時間可達(dá)數(shù)小時甚至一天。簡

4、化了實(shí) 驗(yàn)操作及測量。 分析方法簡便快速分析方法簡便快速 絕大多數(shù)分析測定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。 結(jié)果穩(wěn)定、誤差小結(jié)果穩(wěn)定、誤差小 樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光 散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。 安全性好及使用期長安全性好及使用期長 免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)其危害性；試劑穩(wěn)定，保存期可達(dá)一 年。 二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué) 發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或 抗體上, 經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原2抗體復(fù)

5、合物。 然后進(jìn)行對標(biāo)記物進(jìn)行檢測, 來測定待檢物?；瘜W(xué)發(fā)光分 析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧 化, 形成一個激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到 穩(wěn)定的基態(tài)時, 同時發(fā)射出光子, 利用發(fā)光信號測量儀器 光量子產(chǎn)率。 2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結(jié)合形成抗原2抗體復(fù)合 物而建立起來的一種高選擇性的分析方法, 根據(jù)其檢測方法可 分為非標(biāo)記免疫分析和標(biāo)記免疫分析。非標(biāo)記免疫分析是利用 抗原與抗體結(jié)合形成抗原2抗體復(fù)合物后, 其理化性質(zhì)發(fā)生改變 ,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集等現(xiàn)象,利用這些現(xiàn)象來檢測待檢 物。標(biāo)記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎(chǔ)上

6、將 標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上, 然后進(jìn)行免疫反應(yīng)形成抗原2抗 體復(fù)合物, 再對標(biāo)記質(zhì)進(jìn)行檢測, 從而間接檢測待檢物的方法 。目前常用的標(biāo)記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶 、辣根過氧化物酶, 鑭系稀土元素等。 2.2 化學(xué)發(fā)光原理 化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是化學(xué)物質(zhì)在特定化學(xué)反 應(yīng)中產(chǎn)生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學(xué)反應(yīng)中 激發(fā)單態(tài)分子形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出 多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出 來。因此,任何一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個過程:激發(fā)和發(fā) 光過程。一些激發(fā)態(tài)分子能量也會通過系間串躍和系內(nèi)串 躍而消失

7、。因此,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率是: CL =CEEM (1) 式中,CL為化學(xué)發(fā)光效率,CE為生成激發(fā)態(tài)的效率, EM為激發(fā)態(tài)的發(fā)光效率。CE和EM分別定義為： CE = 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (2) EM = 發(fā)光的分子數(shù)/ 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù) (3) 從(1) 、(2) 、(3) 式得化學(xué)發(fā)光的效率CL等價于生 成熒光和磷光的量子效率。即: CL = 發(fā)光的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (4) 2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物。 它同時具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇 性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑標(biāo)記抗原

8、 或抗體, 標(biāo)記后的抗原和抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫 反應(yīng)和理化步驟,最后以測定發(fā)光強(qiáng)度形式測定待測物的含 量。 三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為三大類, 即化直接化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化 學(xué)發(fā)光免疫分析法。 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體用吖啶酯直接標(biāo)記抗體( (抗原抗原) )，與待測標(biāo)本中相，與待測標(biāo)本中相 應(yīng)的抗原應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗 體體- -待測抗原待測抗原- -吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加 入氧化劑（入氧化劑（H H2 2O O2

9、2）和）和NaOHNaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在使成堿性環(huán)境，吖啶酯在 不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生 的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。 3.1 3.1 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析直接化學(xué)發(fā)光免疫分析 發(fā)光發(fā)光 Y Y Y 磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原 + 抗體抗體 + 帶帶吖吖啶酯啶酯 標(biāo)記物抗標(biāo)記物抗 體體 Y Y Y YY YY Y Y

10、 YY 沖洗后沖洗后 （1 1） 加入加入H H2 2O O2 2 （pH10） 直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理 磁磁微粒微粒模式圖模式圖 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 特點(diǎn)特點(diǎn) 抗原和抗體結(jié)抗原和抗體結(jié)合與未合與未結(jié)合結(jié)合 部分部分的的易易分離分離 磁微粒磁微粒技術(shù)技術(shù) 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenc

11、e enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶 如辣根過氧化物酶（如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶或堿性磷酸酶(ALP)(ALP)來標(biāo)記抗原或抗來標(biāo)記抗原或抗 體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成 固相包被抗體固相包被抗體- -待測抗原待測抗原- -酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入 底物底物( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接 收，光

12、電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈兪?，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它?傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測定物的濃度。傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測定物的濃度。 3.23.2、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)）標(biāo) 記抗體記抗體(或抗原或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo) 本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包 被抗體被抗體-待測抗原待測抗原-酶（酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合）標(biāo)記抗體復(fù)合 物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、物，這時加入魯

13、米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)和化學(xué)發(fā) 光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析 辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體(或抗原或抗原)， 在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生 免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶酶 標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，發(fā)光劑， 堿性磷酸酶使堿性磷酸酶使AMPPD脫去

14、磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析 堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 分配樣品分配樣品, 磁顆粒磁顆粒 和試劑和試劑 孵育孵育 使反應(yīng)物使反應(yīng)物 結(jié)合結(jié)合 在磁場中在磁場中 清洗去除清洗去除 未結(jié)合物質(zhì)未結(jié)合物質(zhì) 加入加入 底物底物 產(chǎn)生產(chǎn)生 信號信號 孵育孵育, 促使信號促使信號 的產(chǎn)生的產(chǎn)生 信號信號 檢測檢測 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析 （electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記是以電化學(xué)發(fā)

15、光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記 抗體抗體( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，為電子供體， 在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。 3.3 3.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析 在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體 包被抗體包被抗體( (抗原抗原) )，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體( (抗原抗原) )，在，在 反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 ( (抗體

16、抗體) )發(fā)生免疫發(fā)生免疫 反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體- -待測抗原待測抗原- -三聯(lián)吡啶三聯(lián)吡啶 釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室，釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室， 同時引人同時引人TPATPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時， 被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記 抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPATPA在電極表面進(jìn)在電極

17、表面進(jìn) 行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測抗原行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測抗原 的濃度成正比。的濃度成正比。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖 標(biāo)記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖標(biāo)記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖 四四、臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用 1.1.甲狀腺激素甲狀腺激素 2.2.生殖激素生殖激素 3.3.腎上腺腎上腺/ /垂體激素垂體激素 4.4.貧血因子貧血因子 5.5.腫瘤標(biāo)記物腫瘤標(biāo)記物 6.6.感染性疾病感染性疾病 7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系統(tǒng)心血管系統(tǒng) 9.9.病毒標(biāo)記物病毒標(biāo)記物 10.10.骨代謝骨代謝 11.11.過敏性疾病過敏性疾病 12.12.治療藥物監(jiān)測治療藥物監(jiān)測 五、發(fā)展與展望 化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度 快、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物 檢測中得到了廣泛運(yùn)用。實(shí)際檢測常常需要對大量、復(fù)雜 、低豐度的樣品進(jìn)行測定，因而化學(xué)發(fā)光免疫分析法逐漸 向快速、高通量、高靈敏檢測的方向發(fā)展。近幾年化學(xué)發(fā) 光免疫分析法的研究方向主要涉及到降低溫育時間，多組 分檢測，以及信號放大技術(shù)等。這些例子都證明了化學(xué)發(fā) 光免疫