化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

1、 化學(xué)發(fā)光免疫分析 一、一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念 二、二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理 三、三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 四、臨床應(yīng)用四、臨床應(yīng)用 五、發(fā)展與展望五、發(fā)展與展望 一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光 的強(qiáng)度來(lái)確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度來(lái)確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光 系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)

2、的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與 待測(cè)的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過(guò)分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入待測(cè)的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過(guò)分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或 定性檢測(cè)。定性檢測(cè)。 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定是目前世界公認(rèn)先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技 術(shù)，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和特異性， 成為檢驗(yàn)方法中最為重要的技術(shù)之一。化學(xué)發(fā)光免疫分析 技術(shù)作為疾病診斷的主要手段已被廣泛用于機(jī)體免疫功能 、傳染性疾病、內(nèi)分泌功能、腫瘤標(biāo)志物、性激素、甲狀 腺功能等方面的體外診斷實(shí)驗(yàn)中。 化學(xué)發(fā)光免疫分析

3、的優(yōu)勢(shì) 靈敏度高靈敏度高 靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可 達(dá) 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）。化學(xué)發(fā)光免疫分 析能夠檢出放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無(wú)法檢出 的物質(zhì)，對(duì)疾病的早期診斷具有十分重要的意義。 寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍 發(fā)光強(qiáng)度在 4 6 個(gè)量級(jí)之間與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯 色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）為 2.0 的范圍相比，優(yōu)勢(shì)明顯。雖 然 RIA 也有較寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍，但放射性限制了其應(yīng)用。 光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng) 輝光型的 CLIA 產(chǎn)生的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一天。簡(jiǎn)

4、化了實(shí) 驗(yàn)操作及測(cè)量。 分析方法簡(jiǎn)便快速分析方法簡(jiǎn)便快速 絕大多數(shù)分析測(cè)定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。 結(jié)果穩(wěn)定、誤差小結(jié)果穩(wěn)定、誤差小 樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光 散射、光波選擇器等）給分析帶來(lái)的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。 安全性好及使用期長(zhǎng)安全性好及使用期長(zhǎng) 免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)其危害性；試劑穩(wěn)定，保存期可達(dá)一 年。 二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué) 發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或 抗體上, 經(jīng)過(guò)特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原2抗體復(fù)

5、合物。 然后進(jìn)行對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè), 來(lái)測(cè)定待檢物?；瘜W(xué)發(fā)光分 析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧 化, 形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到 穩(wěn)定的基態(tài)時(shí), 同時(shí)發(fā)射出光子, 利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器 光量子產(chǎn)率。 2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結(jié)合形成抗原2抗體復(fù)合 物而建立起來(lái)的一種高選擇性的分析方法, 根據(jù)其檢測(cè)方法可 分為非標(biāo)記免疫分析和標(biāo)記免疫分析。非標(biāo)記免疫分析是利用 抗原與抗體結(jié)合形成抗原2抗體復(fù)合物后, 其理化性質(zhì)發(fā)生改變 ,出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集等現(xiàn)象,利用這些現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)待檢 物。標(biāo)記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎(chǔ)上

6、將 標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上, 然后進(jìn)行免疫反應(yīng)形成抗原2抗 體復(fù)合物, 再對(duì)標(biāo)記質(zhì)進(jìn)行檢測(cè), 從而間接檢測(cè)待檢物的方法 。目前常用的標(biāo)記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶 、辣根過(guò)氧化物酶, 鑭系稀土元素等。 2.2 化學(xué)發(fā)光原理 化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是化學(xué)物質(zhì)在特定化學(xué)反 應(yīng)中產(chǎn)生的光輻射。通過(guò)高能中間體的分解在化學(xué)反應(yīng)中 激發(fā)單態(tài)分子形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出 多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出 來(lái)。因此,任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個(gè)過(guò)程:激發(fā)和發(fā) 光過(guò)程。一些激發(fā)態(tài)分子能量也會(huì)通過(guò)系間串躍和系內(nèi)串 躍而消失

7、。因此,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率是: CL =CEEM (1) 式中,CL為化學(xué)發(fā)光效率,CE為生成激發(fā)態(tài)的效率, EM為激發(fā)態(tài)的發(fā)光效率。CE和EM分別定義為： CE = 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (2) EM = 發(fā)光的分子數(shù)/ 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù) (3) 從(1) 、(2) 、(3) 式得化學(xué)發(fā)光的效率CL等價(jià)于生 成熒光和磷光的量子效率。即: CL = 發(fā)光的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (4) 2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物。 它同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇 性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑標(biāo)記抗原

8、 或抗體, 標(biāo)記后的抗原和抗體與待測(cè)物經(jīng)過(guò)一系列的免疫 反應(yīng)和理化步驟,最后以測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度形式測(cè)定待測(cè)物的含 量。 三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為三大類, 即化直接化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化 學(xué)發(fā)光免疫分析法。 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體用吖啶酯直接標(biāo)記抗體( (抗原抗原) )，與待測(cè)標(biāo)本中相，與待測(cè)標(biāo)本中相 應(yīng)的抗原應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗 體體- -待測(cè)抗原待測(cè)抗原- -吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加 入氧化劑（入氧化劑（H H2 2O O2

9、2）和）和NaOHNaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在使成堿性環(huán)境，吖啶酯在 不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生 的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。 3.1 3.1 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析直接化學(xué)發(fā)光免疫分析 發(fā)光發(fā)光 Y Y Y 磁微粒磁微粒被測(cè)抗原被測(cè)抗原 + 抗體抗體 + 帶帶吖吖啶酯啶酯 標(biāo)記物抗標(biāo)記物抗 體體 Y Y Y YY YY Y Y

10、 YY 沖洗后沖洗后 （1 1） 加入加入H H2 2O O2 2 （pH10） 直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理 磁磁微粒微粒模式圖模式圖 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 特點(diǎn)特點(diǎn) 抗原和抗體結(jié)抗原和抗體結(jié)合與未合與未結(jié)合結(jié)合 部分部分的的易易分離分離 磁微粒磁微粒技術(shù)技術(shù) 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenc

11、e enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶 如辣根過(guò)氧化物酶（如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶或堿性磷酸酶(ALP)(ALP)來(lái)標(biāo)記抗原或抗來(lái)標(biāo)記抗原或抗 體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成 固相包被抗體固相包被抗體- -待測(cè)抗原待測(cè)抗原- -酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入 底物底物( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接 收，光

12、電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們 傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。 3.23.2、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 該分析系統(tǒng)采用辣根過(guò)氧化物酶（該分析系統(tǒng)采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)）標(biāo) 記抗體記抗體(或抗原或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo) 本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包 被抗體被抗體-待測(cè)抗原待測(cè)抗原-酶（酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合）標(biāo)記抗體復(fù)合 物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、物，這時(shí)加入魯

13、米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)和化學(xué)發(fā) 光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體(或抗原或抗原)， 在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生 免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原待測(cè)抗原-酶酶 標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，發(fā)光劑， 堿性磷酸酶使堿性磷酸酶使AMPPD脫去

14、磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析 堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 分配樣品分配樣品, 磁顆粒磁顆粒 和試劑和試劑 孵育孵育 使反應(yīng)物使反應(yīng)物 結(jié)合結(jié)合 在磁場(chǎng)中在磁場(chǎng)中 清洗去除清洗去除 未結(jié)合物質(zhì)未結(jié)合物質(zhì) 加入加入 底物底物 產(chǎn)生產(chǎn)生 信號(hào)信號(hào) 孵育孵育, 促使信號(hào)促使信號(hào) 的產(chǎn)生的產(chǎn)生 信號(hào)信號(hào) 檢測(cè)檢測(cè) 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析 （electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記是以電化學(xué)發(fā)

15、光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記 抗體抗體( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，為電子供體， 在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。 3.3 3.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析 在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體 包被抗體包被抗體( (抗原抗原) )，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體( (抗原抗原) )，在，在 反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗原反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 ( (抗體

16、抗體) )發(fā)生免疫發(fā)生免疫 反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體- -待測(cè)抗原待測(cè)抗原- -三聯(lián)吡啶三聯(lián)吡啶 釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室， 同時(shí)引人同時(shí)引人TPATPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)， 被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記 抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng) 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPATPA在電極表面進(jìn)在電極

17、表面進(jìn) 行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原 的濃度成正比。的濃度成正比。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖 標(biāo)記磁顆粒在電場(chǎng)中發(fā)光工作示意圖標(biāo)記磁顆粒在電場(chǎng)中發(fā)光工作示意圖 四四、臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用 1.1.甲狀腺激素甲狀腺激素 2.2.生殖激素生殖激素 3.3.腎上腺腎上腺/ /垂體激素垂體激素 4.4.貧血因子貧血因子 5.5.腫瘤標(biāo)記物腫瘤標(biāo)記物 6.6.感染性疾病感染性疾病 7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系統(tǒng)心血管系統(tǒng) 9.9.病毒標(biāo)記物病毒標(biāo)記物 10.10.骨代謝骨代謝 11.11.過(guò)敏性疾病過(guò)敏性疾病 12.12.治療藥物監(jiān)測(cè)治療藥物監(jiān)測(cè) 五、發(fā)展與展望 化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度 快、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在環(huán)境、臨床、食品、藥物 檢測(cè)中得到了廣泛運(yùn)用。實(shí)際檢測(cè)常常需要對(duì)大量、復(fù)雜 、低豐度的樣品進(jìn)行測(cè)定，因而化學(xué)發(fā)光免疫分析法逐漸 向快速、高通量、高靈敏檢測(cè)的方向發(fā)展。近幾年化學(xué)發(fā) 光免疫分析法的研究方向主要涉及到降低溫育時(shí)間，多組 分檢測(cè)，以及信號(hào)放大技術(shù)等。這些例子都證明了化學(xué)發(fā) 光免疫