科研課題申請書（完整版）

1、科研課題申請書課題項目：申請人：學(xué)號:單位：專業(yè)12 月申請時間：2014 年細(xì)胞粘附分子T-cadherin (T-cad)基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多種 腫瘤中因啟動子甲基化而失活，其表達(dá)顯著下降或缺失，推測其可能 為一新的腫瘤抑制基因。申請人首次證實 T-cad 基因在腦膠質(zhì)母細(xì) 胞瘤 C6 細(xì)胞中的腫瘤抑制基因功能，并揭示其分子機制。本研究 將在肝癌細(xì)胞株進(jìn)一步研究 T-cad 基因失活與肝癌細(xì)胞的增殖及侵 襲等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系， 并調(diào)查其分子機制； 在臨床切除的肝癌 標(biāo)本中研究 T-cad 基因失活與肝癌惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡 性生物學(xué)特征的關(guān)系，明確 T-cad 基因失活

2、與臨床肝癌預(yù)后的關(guān)系； 在肝癌細(xì)胞株和肝癌裸鼠模型上證實去甲基化藥物是否能重新誘導(dǎo) T-cad 分子表達(dá)并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)特征，探 索去甲基化藥物對肝癌的治療價值。 該研究對進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)病的 分子機制、 設(shè)計合理的治療藥物及判斷預(yù)后， 提高我國肝癌的治療水 平具有重要意義。關(guān)鍵詞：T-cadherin;腫瘤抑制基因；肝癌 （一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容1、項目的立項依據(jù) 原發(fā)性肝癌是高度惡性的腫瘤， 盡管采取積極手術(shù)治療， 但絕大多數(shù) 病人仍難免死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移， 其死亡率高居我國腫瘤死亡率的第 二位。研究已表明肝癌的發(fā)生乙肝、 丙肝感染及攝入黃曲霉素污染的 食物有密切關(guān)系

3、 , 其發(fā)生發(fā)展與多種癌基因過度表達(dá)，以及腫瘤抑制 基因失活密切相關(guān)。 但目前對其發(fā)生發(fā)展的精確分子機制尚不完全清 楚。因此, 進(jìn)一步探索研究新的基因功能改變與肝癌發(fā)生發(fā)展及其惡 性特征的關(guān)系， 對揭示其發(fā)生發(fā)展的精確分子機制、 設(shè)計合理的治療 藥物及判斷預(yù)后， 進(jìn)一步提高我國肝癌的治療水平具有重要意義。T-cadherin 分子屬細(xì)胞粘附分子 cadherin 超家族。 Cadherin 超家族分子為細(xì)胞表面糖蛋白， 其功能主要包括調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的細(xì)胞粘附、 細(xì) 胞極性及形態(tài)形成， 以及參與細(xì)胞間的識別和信號傳導(dǎo)機制 (1,2,3,4)。 經(jīng)典的 Cadherin 分子如 E-cadherin

4、和 N-cadherin 由細(xì)胞外鈣結(jié)合 區(qū)及跨膜區(qū)兩部分組成，而 T-cadherin 因缺失經(jīng)典 Cadherin 分子所 具有的跨膜區(qū)而經(jīng)糖基磷脂酰肌醇分子附著于細(xì)胞膜上(5),故而命名 truncated-cadherin (即 T-cadherin,又稱 CDH13 或 H-cadherin)。 近年來對經(jīng)典的 Cadherin 分子的深入研究發(fā)現(xiàn)， E-，N-cadherin 分 子缺失或突變與多種腫瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移 特征密切相關(guān)( 6, 7, 8,9,10)。將 E-cadherin 分子重新導(dǎo)入缺失 E-cadherin 分子表達(dá)的腫瘤細(xì)胞, 則腫瘤細(xì)胞

5、的增殖及侵犯能力顯著 受抑( 11)。近年已開始有 T-cadherin 分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、 結(jié)直腸癌、 卵巢癌及皮膚鱗癌中表達(dá)顯著下降、 缺失的報導(dǎo)( 12, 13, 14, 15,16,17,18),推測 T-cadherin 分子在這些腫瘤中可能扮演腫瘤 抑制基因角色 ,但尚無人對其在不同腫瘤中的基因功能及其分子機制 進(jìn)行研究。 2003 年,申請人(黃志勇) 最新研究表明, 將 T-cadherin 基因?qū)肴笔П磉_(dá) T-cadherin 分子的大鼠腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 C6 細(xì)胞 使其過度表達(dá) T-cadherin 分子, C6 細(xì)胞的增殖及侵襲能力顯著受抑, 首次證實 T-cad

6、herin 在大鼠腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的腫瘤抑制基因功 能,并進(jìn)一步揭示其抑制機制是 T-cadherin 分子通過誘導(dǎo) P21 CIP1/WAF1 表達(dá)致使腫瘤細(xì)胞于細(xì)胞周期 G2 期阻滯。該文發(fā)表于 Molecularand Cellular Biology 2003,23:566-578(19)。這一研究發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究T-cadherin分子在肝癌中的功能、分子機制及臨床意義奠 定了堅實的基礎(chǔ)。 腫瘤抑制基因啟動子甲基化導(dǎo)致基因失活在腫瘤的 發(fā)病機制中起著重要作用( 20, 21, 22, 23)。 T-cadherin 基因在乳 腺癌、結(jié)直腸癌及肺癌中并未發(fā)生缺失突變, 但由于其啟動子異

7、常甲 基化導(dǎo)致 T-cadherin 基因失活,進(jìn)而導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平顯著下降 或缺失(13,16,24)。T-cadherin基因位于染色體16q24,肝癌的發(fā)生 與染色體 16q24 的缺失、突變密切相關(guān) (25)。 Riou (2002)對位于 染色體 16q24 的 13 個常常在肝癌中缺失表達(dá)的 基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 研 究 發(fā) 現(xiàn) , T-cadherin mRNA 在 HepG2, PLC/PRF/C,TONG 和 HA22TNGH 四種肝癌細(xì)胞株中缺失表達(dá),但 T-cadherin 基因本身并未發(fā)生缺失突變( 12)。 Yu(2002) 進(jìn)一步研究顯示 T-cadherin 基因

8、啟動子在肝癌中高度甲基化,而 E-cadherin 基因啟動子在肝癌中不發(fā)生甲基化,表明在 Cadherin 細(xì) 胞粘附分子超家族中 T-cadherin 基因啟動子 甲基化在肝癌中具有高度特異性 ,且 T-cadherin 基因啟動子甲基化與 T-cadherin 基因失活密切相關(guān)( 26)。這些研究表明 T-cadherin 基因 啟動子甲基化是 T-cadherin 基因在肝癌中失活的主要機制。 Takeuchi 在對皮膚鱗癌細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn),與 2ug/ml 去甲基化藥 物 5-aza-2 -deoxycytidine 共孵 6 天能使皮膚鱗癌細(xì)胞株恢復(fù) T-cadherin 分子表

9、達(dá)( 17)。但目前對 T-cadherin 基因失活與肝癌惡性分化程度、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及復(fù) 發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系,以及應(yīng)用去甲基化藥物是否能誘導(dǎo)T-cadherin 分子在肝癌細(xì)胞株中重新表達(dá)， 并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性特征全世界尚無研究報 道。本研究將進(jìn)一步研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能，調(diào)查缺 失表達(dá) T-cadherin 的肝癌細(xì)胞株重新表達(dá) T-cadherin 是否能抑制肝 癌細(xì)胞的增殖、 侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征， 并在裸鼠肝癌模型上 加以證實。同時， 進(jìn)一步研究其基因功能的分子機制。在臨床切除的 肝癌標(biāo)本中研究 T-cadherin 基因失活與肝癌

10、惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及 復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系，進(jìn)一步揭示 T-cadherin 基因失活與 臨床肝癌預(yù)后的關(guān)系。 在肝癌細(xì)胞株及裸鼠肝癌模型上證實是否去甲 基化藥物能重新誘導(dǎo) T-cadherin 分子表達(dá)， 并抑制肝癌細(xì)胞的增殖、 侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征， 觀察其潛在的治療作用和可能的毒副 作用。由于國內(nèi)外尚無類似研究報道， 申請人具有研究 T-cadherin 基 因與 C6 細(xì)胞惡性生物學(xué)特征的關(guān)系及其分子機制的豐富經(jīng)驗，預(yù) 期該研究成果能達(dá)國際先進(jìn)水平。主要參考文獻(xiàn)：1. Angst BD, Marcozzi C and Magee AI. The cadherin super

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18、d expression in human breast cancer. Nat. Med 1996,2:776-78215. Zhong,Y., Delgado, Y., Gomez, J., et al. Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clin. Cancer Res22、項目的 研究內(nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問題一、研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能1. 將 T-cadherin 基因

19、 導(dǎo)入缺失表達(dá) T-cadherin 的肝癌細(xì)胞株 HepG2，使其表達(dá) T-cadherin分子，研究表達(dá) T-cadherin分子的肝 癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征的變化，證實是否 T-cadherin 重新表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞的增殖、 侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物 學(xué)特征。2. 將缺失表達(dá) T-cadherin的HepG2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后表達(dá) T-cadherin的HepG2 細(xì)胞于皮下接種裸鼠， 在裸鼠肝癌模型上進(jìn)一步證實 T-cadherin 基因的腫瘤抑制基因功能。3研究 T-cadherin 基因在肝癌中腫瘤抑制功能的分子機制。證實是 否 T-cadherin 在肝癌細(xì)胞株存在與在

20、 C6 細(xì)胞中一致的分子機制, 即 T-cadherin 分子通過誘導(dǎo) P21CIP1/WAF1 表達(dá)致使肝癌細(xì)胞于 細(xì)胞周期 G2 期阻滯。二、在臨床切除的肝癌標(biāo)本中研究T-cadherin 基因失活與肝癌惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系,在人肝癌中揭示 T-cadherin 基因失活與肝癌的惡性生物學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。1. 研究 50 例臨床手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本及癌周肝組織中 T-cadherin 的表達(dá),揭示 T-cadherin 基因表達(dá)水平（失活）與肝癌惡性分化程度、 肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（包括合并門靜脈癌栓和衛(wèi)星灶形成）的關(guān)系。2. 結(jié)合臨床病案記錄,選擇在臨床分期、病理類型及治療

21、方法上具有 可比性的肝癌病例, 分別選取肝癌切除術(shù)后半年內(nèi)復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移以 及 2 年 內(nèi)未復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移的肝癌病例的石蠟標(biāo)本各 20 例,研究 T-cadherin 基因的表達(dá), 揭示 T-cadherin 基因表達(dá)水平 （失活） 與肝 癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。三、在肝癌細(xì)胞株和裸鼠肝癌種植模型上證實去甲基化藥物5-aza-2-deoxycytidine 是否能重新誘導(dǎo) T-cadherin 表達(dá),并抑制肝癌細(xì)胞的 增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征, 觀察其對肝癌的治療價值和可 能的毒副作用。33、擬采取的研究方案及可行性分析一、研究T-cadherin （T-cad）在肝癌中的基因功能的技術(shù)路

22、線1. 構(gòu)建 T-cad 表達(dá)載體 pcDNA3.T-cad以脂質(zhì)體 lipofectin 為載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系 HepG2 細(xì)胞J以 G418 篩選表達(dá) T-cad 分子的陽性克隆JWestern blot 鑒定轉(zhuǎn)染后 T-cad 蛋白表達(dá)J比較表達(dá) T-cad 的陽性克隆與不表達(dá) T-cad 的肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特 征 :細(xì)胞增殖計數(shù) 3H 標(biāo)胸腺嘧啶攝取率測定克隆增殖試驗細(xì)胞粘試 驗細(xì)胞聚集試驗2. 在裸鼠肝癌模型上觀察 T-cad陽性克隆與不表達(dá)T-cad的肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特征a裸鼠皮下分別接種107T-cadherin （+ ）或（-）的肝癌細(xì)胞（各20只）b.觀察：腫瘤生長速度腫瘤轉(zhuǎn)

23、移發(fā)生的時間、累及積器官及頻率裸鼠的生存期3. 研究 T-cadherin 基因在肝癌中腫瘤抑制功能的分子機制a. 流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)T-cadheri n陽性和陰性的肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期變化b. Western blot 檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白 p53,p21,p27,cyclin D 的表達(dá) 變化c.研究是否T-cadherin分子在肝癌中同樣存在誘導(dǎo) P21 CIP1/WAF1表達(dá)致使肝癌細(xì)胞于細(xì)胞周期 G2 期阻滯的分子機制。二、研究 T-cadherin 基因失活與臨床肝癌惡性分化程度、轉(zhuǎn)移及復(fù) 發(fā)等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系的技術(shù)路線1. 收集臨床手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本及癌周肝組織各 50 例a

24、. 檢測T-cadherin表達(dá)： 定量 PCR；免疫組織化學(xué)； Western blotb. 比較肝癌與癌周肝組織中 T-cadherin的表達(dá)水平，研究T-cadherin 缺失表達(dá)（基因失活）與人肝癌發(fā)生的關(guān)系。c. 比較不同病例肝癌中 T-cadherin 的表達(dá)水平， 研究 T-cadherin 表 達(dá)水平與腫2. 瘤病理分級、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（包括合并門靜脈癌栓和衛(wèi)星灶形成）的 關(guān)系。2. 結(jié)合臨床病案記錄，選擇臨床分期相同、病理類型一致、單個腫瘤 大小在 25cm 之間、無肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移、行根治性切除后采用同樣的治 療方案的肝癌病例， 分別選取肝癌切除術(shù)后半年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移以及 2 年內(nèi)未復(fù)發(fā)

25、或轉(zhuǎn)移的肝癌石蠟標(biāo)本各 20 例a. 檢測 T-cadherin 表達(dá)： 免疫組織化學(xué)b. 回顧研究 T-cadherin 表達(dá)水平與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系三、研究去甲基化藥物誘導(dǎo)T-cadherin 表達(dá)及其治療學(xué)意義的技術(shù)路線。 1.研究表明 T-cadherin 在肝癌細(xì)胞株 HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和 HA22TNGH 中 缺 失。 采用 Herman 已 報 導(dǎo) 的 檢 測 T-cadherin 啟動子甲基化和 非甲基序列的引物， 進(jìn)一步證實 T-cadherin 在上述肝癌細(xì)胞株中的啟動子甲基化現(xiàn)象。 擴增甲基化序 列引物，上 游 5-TCGCGGGGTTCGT

26、TTTCGC-3 ，下游 5 -GACGTTTTCATTCATACGCG-3 ，擴增非甲化序列引3. 物 ， 上 游 5-TTGTGGGGTTGTTTTGT- 3， 下 游 5 -AACTTTTCATTCATACACACA-3 。 采用 Western blot 進(jìn)一步 證實 T-cadherin 在上述存在的啟動子甲基化肝癌細(xì)胞株中蛋白水 平表達(dá)缺失。 2. 選 擇 T-cadherin 啟 動 子 高 度 甲 基 化 的 細(xì)胞株與去 甲基化藥物5-aza-2deoxycytid in e（2ug/ml） 作用 6 天后，采用 Western blot 檢測 T-cadherin 蛋白水平表達(dá) ; 采用細(xì)胞增殖計數(shù)、 3H 標(biāo)胸腺嘧啶攝取率測定、克隆