全封閉式集菌培養(yǎng)法與直接接種法的無菌試驗比較

1、全封閉式集菌培養(yǎng)法與直接接種法的無菌試驗比較 【摘要】 目的 比較全封閉式集菌培養(yǎng)法與直接接種法在生物制品無菌試驗中的優(yōu)缺點，以確定更優(yōu)良的方法做無菌試驗。方法 用全封閉式集菌培養(yǎng)法和直接接種法檢驗成品中染菌情況。結果 用全封閉式集菌培養(yǎng)法的成品復試率明顯低于用直接接種法。結論 生物制品無菌試驗用全封閉式集菌培養(yǎng)法優(yōu)于直接接種法，復試率明顯降低，檢測質量及可靠性增加，同時減少了轉種的麻煩，也減少再次污染的機會，解決了無菌試驗中一大問題。 【關鍵詞】無菌試驗；全封閉式集菌培養(yǎng)法；直接接種法compare the total enclosed cultivator with the direct

2、inoculation in biological products aseptic experimentabstract: objective compare good and bad points of the total enclosed cultivator with the direct inoculation in biological products aseptic experiment, and determined that a finer method performs the aseptic experiment. methods use the total enclo

3、sed cultivator and the direct inoculation to test the infection of the final products. results the rate of the final product retest of the total enclosed cultivator is lower than direct inoculation. conclusion the total enclosed cultivator is better than direct inoculation in biological products ase

4、ptic experiment, the rate of the retest clearly down, the quality and the dependability of the test advance, and at the meantime decrease the trouble of subcultivation and the chance of recontamination, so it solves a big problem of aseptic experiment.keywords: aseptic experiment total enclosed cult

5、ivator direct inoculation無菌檢查是藥品和生物制品保證質量的重要環(huán)節(jié)，中國藥典三部明確規(guī)定：“無菌試驗檢查法系用于確定無菌的生物制品、原料和輔料及要求無菌的其他品種是否無菌的一種方法”。注射劑生產要求最嚴，注射劑最基本的要求是無菌、無熱源、無不溶性物質。而無菌試驗用培養(yǎng)基的質量對檢出結果影響很大。1全封閉式集菌培養(yǎng)法是薄膜過濾法的一種，是利用微孔濾膜（濾膜的孔徑應0.45um）阻截細菌，以過濾樣品中的可溶性成分，從而使樣品中污染的雜菌得以檢出的一種實驗方法，具有簡便、快速、準確的特點。2過去，無菌試驗中全封閉式集菌培養(yǎng)法只用于血液制品，而生物制品一直采用直接接種法。然而

6、直接接種法，對有些無抗菌作用的藥品因培養(yǎng)管渾濁不易進行結果判斷3，更隨著產品質量意識的提高，加之全封閉式集菌培養(yǎng)法優(yōu)勢即：靈敏度高，操作封閉，不易造成人為操作的污染，吸取全量，不易漏判等，生物制品無菌試驗逐漸采用全封閉式集菌培養(yǎng)法。長期以來，一直困擾著生物制品無菌試驗的就是復試率較高，特別是氣溫較高時。雖然說某種制品復試率高與制品、分裝凍干等因素有關，但往往復試后制品又合格，重復性不是很好?；谶@點，我們用全封閉式集菌培養(yǎng)法與直接接種法對小瓶乙腦疫苗共13批50個瓶號，以及卡舒寧（安瓿）1批6個瓶號，安瓿乙腦5批12個瓶號（初試用直接接種法染菌的）進行無菌試驗，結果用全封閉式集菌培養(yǎng)法初試合格

7、率明顯高于用直接接種法，復試率或者復試不合格率低于用直接接種法。 1對象和方法 1.1達到gmp要求的無菌操作室，20-25和30-35孵室各一間。 1.2儀器：hty-2000a集菌儀器、集菌器（濾膜0.45um孔徑，型號：dcn330） 1.3培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽（克氏瓶、血漿瓶、中管），改良馬丁（血漿瓶、中管），肝斜面（中管），由本所培養(yǎng)基室提供。必須在30-35 孵室孵放3-7天后無菌生長才能使用； 1.4試驗用品：無菌sml、loml注射器，無菌操作眼、剪刀、鑷子，無菌0. l%蛋白陳水或生理鹽水，塑料桶、鋁箱、鋁盒、中管架經消毒液浸泡或擦洗后八操作室，酒精爐75%酒精棉、500ppm

8、愛爾施消毒液； 1.5待檢品：小瓶乙腦疫苗50個瓶號，以及卡舒寧6個瓶號，安瓿乙腦12個復試瓶號，用500ppm愛爾施消毒液浸泡40分鐘后倒出消毒液入操作室紫外線照射至少兩個小時； 1.6全封閉式集菌培養(yǎng)法：在無菌狀態(tài)下，抽取樣品通過集菌器（3管），再用滅菌生理鹽水或蛋白胨水沖洗濾膜至少3次，每次200ml，再把硫乙醇酸鹽（血漿瓶）、改良馬?。ㄑ獫{瓶）培養(yǎng)基打入集菌器內，試驗完后，一管硫乙醇酸鹽放入30-35，其余兩管放入20-25孵室，14天后判定結果； 1.7直接接種法：含防腐劑的制品（如乙腦疫苗）先在克氏瓶里增菌培養(yǎng)（20-25孵室）3-4天后再轉種于3種培養(yǎng)基中，克氏瓶及疏鹽、肝斜面各

9、一半培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基放于20-25孵室，另一半硫鹽及肝斜面培養(yǎng)基放于30-35 孵室，至少再等10-11天后才能判定結果； 1.8不含防腐劑的制品（如卡舒寧）直接接種在硫鹽、肝斜面、改良馬丁培養(yǎng)基中，一半硫鹽及肝斜面培養(yǎng)基放于30-35孵室，剩余的全部放于20-25孵室，至少14天后才能判定結果。 2結果 2.1小瓶乙腦疫苗用兩種無菌試驗方法的初試比較對小瓶乙腦疫苗13批共50個瓶號用全封閉式集菌培養(yǎng)法和直接接種法進行初試，結果表明用全封閉式集菌培養(yǎng)法全部合格，初試合格率100%，復試率為o%。用直接接種法有46個瓶號合格，4個瓶號復試，初試合格率92%，復試率8%。見表l。表1 小瓶乙

10、腦疫苗13批50個瓶號初試情況批號（瓶號）全封閉式集菌培養(yǎng)法直接接種法xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格1#、2#合格；3#、4#復試*xxxx(1-4#)合格1#、2#合格；3#、4#復試*xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-2#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格xxxx(1-4#)合格合格復試率（初試合格率）0（100%）8%（92%）*表示這4個瓶號再用直接接種法復試后全部合格。2.2卡舒寧用兩

11、種無菌試驗方法的初試比較 對卡舒寧6個瓶號用全封閉式集菌培養(yǎng)法和直接接種法進行初試，結果表明用全封閉式集菌培養(yǎng)法初試合格率100%，復試率為0。用直接接種法初試合格率為0，復試率100%。見表2。表2卡舒寧6個瓶號初試情況瓶號全封閉式集菌培養(yǎng)法直接接種法1#合格復試*2#合格復試*3#合格復試*4#合格復試*5#合格復試*6#合格復試*復試率（初試合格率）0（100%）100%（0%）*用直接接種法復試， 1#、2#、3#、5#、6#合格，而4#復試不合格。其實這個不合格瓶號在48支培養(yǎng)基中僅有1支改良馬丁染菌而判為不合格。用直接接種法初試合格率為0，而復試合格率是83%。像這種情況，重復性極

12、其不好，以后用全封閉式集菌培養(yǎng)法可以避免類似情況。2.3安瓿乙腦用兩種無菌試驗方法的復試比較對于含防腐劑制品染菌情況的，用全封閉式集菌培養(yǎng)法是否存在抑菌，我們對5批安瓿乙腦共12個瓶號（初試用直接接種法染菌的）進行復試。結果表明，用全封閉式集菌培養(yǎng)法有6個瓶號復試不合格，復試不合格率50%，直接接種法有9個瓶號復試不合格，復試不合格率為75%。還可知有5個瓶號用這兩種方法都出現染菌現象，見表3。表3安瓿乙腦5批12個6個瓶號的復試情況批號全封閉式集菌培養(yǎng)法直接接種法xxxx(2#，4#，11#)11#復試不合格，2#，4#復試合格2#，4#，11#復試不合格xxxx(7#，8#)7#復試不合格

13、，8#復試合格7#，8#復試不合格xxxx1#，6#，7#)1#復試不合格，6#，7#復試合格6#復試不合格，1#，7#復試合格xxxx(2#，3#，5#)2#、5#復試不合格，3#復試合格2#、5#復試不合格，3#復試合格xxxx(2#)2#復試不合格2#復試不合格復試不合格率50%75%表3結果說明有菌的用全封閉式集菌培養(yǎng)法一樣會出現染菌現象，不存在抑菌情況，而且復試不臺格率低于用直接接種法。 3討論 歷來，怎樣降低無菌試驗復試率一直是無菌試驗檢定最關心的焦點，雖然染菌與其它環(huán)節(jié)有關系，但用全封閉式集菌培養(yǎng)法降低復試率無疑是一種優(yōu)選的方法。因為直接接種法操作環(huán)節(jié)較多，易造成操作過程中再污染

14、，比如：注射器滅菌處理未徹底：培養(yǎng)基接種中管支數太多（初試24支，復試48支）暴露在外的培養(yǎng)基塞子只要有一支未控制好就會有菌掉入培養(yǎng)基中出現染菌：準備工作繁瑣，若有一支染菌培養(yǎng)基未發(fā)現被選用；平時觀察較困難，培養(yǎng)基搬來搬去，塞子易松易掉而掉人外界菌，還有由克氏瓶轉接中的過程等。而全封閉式集菌培養(yǎng)法在很大程度上克服了這些，把外界影響和操作者的主觀因素減少到最低，又增加了取樣量，較直接接種法更為客觀、公正、科學，能夠全面反映樣品的染菌情況。該法是藥學領域中用作無菌培養(yǎng)的成熟技術，常用來作注射劑的無菌檢查4，并被收入2010 年版中國藥典5。其優(yōu)點是可對樣品全量過濾集菌，整個過程在封閉狀態(tài)下進行，操

15、作不易污染，重復性好。 全封閉式集菌培養(yǎng)法只用2種培養(yǎng)基，沒有肝斜面。硫乙醇酸鹽可檢測需氧兼厭氧菌，改良馬丁檢測真菌，而肝斜面也可檢測需氧兼厭氧菌，所以只用兩種培養(yǎng)基不用肝斜面是可行的。 綜上所述，用全封閉式集菌培養(yǎng)法優(yōu)于直接接種法，只要用來實驗的樣品是可溶解過濾的，同時又不影響樣品中微生物的生存狀態(tài)時，就可以用該法檢驗。同時，該法的用途非常廣泛，幾乎可以運用到每一種劑型的藥品檢驗中去。歐洲、美國、英國、日本的藥典均有收載。我國藥檢工作者近幾年也開展了大量的有關工作，做了許多實驗研究，對于這種方法用了更深刻的認識和更廣泛的運用，這對于在藥品檢驗技術上的提高和我國與國際接軌，藥品質量控制以及藥品監(jiān)督執(zhí)法等工作都有重要而深遠的意義。2參考文獻1 謝文,趙宏大,紀紹梅.關于我國藥品無菌試驗用培養(yǎng)基質量的現狀分析及改進建議.中國藥事,2