生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虻谋磉_(dá)

1、v原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn) 1.原核生物的染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA,其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù) 進(jìn)行。 2.原核生物形成多順?lè)醋觤RNA,mRNA在合成過(guò)程中和多個(gè)核糖體結(jié)合， 翻譯成多條肽鏈。 3.一般不含有內(nèi)含子，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)。 4.原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起形成操縱子。 v原核生物中參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要元件 1.啟動(dòng)子 2.終止子 3.SD序列（shine-dalgarno） 4.還有一些其它的調(diào)控元件如增強(qiáng)子，衰減子，絕緣子，反義RNA等等也影響 著基因的轉(zhuǎn)譯。 v外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件 1.刪除內(nèi)含子和5非編碼區(qū)； 2.外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和

2、SD序列控制下； 3.維持正確的開放閱讀框（ORF） 4.mRNA穩(wěn)定且可以有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不易被降解 影響基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素： 1.啟動(dòng)子：建立表達(dá)載體的時(shí)候，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。 常見(jiàn)的原核強(qiáng)啟動(dòng)子： (1) Plac: 受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)； (2) Ptrp: 取自大腸桿菌色氨酸操縱子； (3) Ptac: Lac啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子； (4) PL和PR: 噬菌體早期左/右啟動(dòng)子，受噬菌體CI基因 負(fù)調(diào)控，溫度誘導(dǎo) (5) T7啟動(dòng)子。 2. 基因劑量 :帶目的基因載體的拷貝數(shù)。 3. 核糖體結(jié)合位點(diǎn) (1) SD順序與16srRNA3末端互

3、補(bǔ)程度； (2) AUGSD間的距離 4. 密碼子的選用 不同生物甚至同種生物的不同蛋白質(zhì)的基因?qū)?jiǎn)并密碼子的使用具有一定的選 擇性。 v 原核表達(dá)載體 1. 原核表達(dá)載體所需的主要元件 (1) 啟動(dòng)子；(2) SD順序; (3) 篩選標(biāo)記；(4) 其它調(diào)控基因 (5) 終止子 (6) 復(fù)制原點(diǎn) (7)MCS 2. 原核表達(dá)載體的類型 (1) 融合型表達(dá)載體表達(dá)出融合蛋白； (2) 非融合型表達(dá)載體表達(dá)出完整蛋白； (3) 分泌型表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)物可跨膜分泌到胞間隙。 v融合型表達(dá)載體 P SD Foreign DNA 融合型表達(dá)載體 融合基因 v非融合型表達(dá)載體 P SD Foreign DN

4、A v分泌型表達(dá)載體 P SD 融合型表達(dá)載體 融合基因 Foreign DNA IPP 關(guān)于載體 PET-21b PET載體在宿主菌BL21中的調(diào)控表達(dá) 常見(jiàn)的表達(dá)受體菌株 宿主菌株表達(dá)載體啟動(dòng)子 BL 21 T7 HMS174 T7 M5219 PL RB791 Plac, Ptac v外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物可能存在于細(xì)胞質(zhì)中、細(xì)胞周質(zhì)和細(xì) 胞外培 養(yǎng)基中，其表達(dá)形式包括形成不溶性蛋白和可溶性蛋白。 1. 包涵體。 具有正確的氨基酸順序，空間構(gòu)象錯(cuò)誤，一般無(wú)生物學(xué)活性。 2.融合蛋白。外源蛋白在菌體自身蛋白的引導(dǎo)下正確折疊，形成雜合構(gòu)象，具有 一定的

5、生物學(xué)活性。 3. 寡聚型外源蛋白 。外源基因連接在一起克隆在低拷貝的載體上。 4. 整合型外源蛋白。外源基因通過(guò)同源交換的方式整合在宿主菌染色體上， 5. 分泌型外源蛋白。 v表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 1. 特異性鑒定： (1) 熒光抗體法 (2) 免疫沉淀法 (3) westhern印跡法 (4) 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） (5) 固相放射性免疫測(cè)定法 (RIA) 2 生物學(xué)活性測(cè)定 基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性測(cè)定在某些情況下不需要對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 純化，但為了商業(yè)化或者是要得到較純的外源基因表達(dá)產(chǎn)物，則需要對(duì) 表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，可以大大提高酶的比活力。 細(xì)胞的破碎 離心 SDS-PAGE 如需要進(jìn)一步純化表達(dá)蛋白就要通過(guò)一些生化的方法如濃縮法，柱層析 法分別進(jìn)行初步分離和進(jìn)一步的分離純化 vGSTs的生物學(xué)活性測(cè)定 CHO-COOH + PHC 鐵氰化鉀發(fā)色的苯肼物 v 原核表達(dá)載體 1. 原核表達(dá)載體所需的主要元件 (1) 啟動(dòng)子；(2) SD順序; (3) 篩選標(biāo)記；(4) 其它調(diào)控基因 (