抗生素在土壤中的殘留分析研究進(jìn)展

1、目錄前言11抗生素土壤污染概況12抗生素在環(huán)境中的殘留22.1抗生素在環(huán)境的來(lái)源及去路22.2抗生素在環(huán)境中的遷移22.3抗生素在土壤中的殘留32.4對(duì)人類健康的潛在危害43殘留抗生素的分析方法43.1樣品前處理43.1.1提取方法53.1.2凈化方法63.1.3濃縮方法63.2檢測(cè)方法63.2.1高效液相色譜法63.2.2高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法74結(jié)果分析85展望9參考文獻(xiàn)10抗生素在土壤中的殘留分析研究進(jìn)展XX（某某大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南XX，XXXXXX）摘要:抗生素的土壤污染和近年來(lái)已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外的極大關(guān)注。本文綜述了國(guó)內(nèi)外對(duì)抗生素在土壤環(huán)境中的殘留現(xiàn)狀，為抗生素檢測(cè)監(jiān)控提供參

2、考。國(guó)內(nèi)外研究表明不同提取和檢測(cè)方法對(duì)抗生素殘留分析的回收率不同，其中加速溶劑萃?。ˋSE)和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（High Performance Liquid Chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)應(yīng)用效果較好，并對(duì)土壤抗生素污染現(xiàn)狀進(jìn)行分析和展望。關(guān)鍵詞：抗生素；土壤殘留；檢測(cè)方法；研究分析Abstract:Soil contamination and recent years have attracted much attention. This paper summarizes the status of antibiotics in s

3、oil environment, and provides a reference for the detection and monitoring of antibiotics. Domestic and foreign studies show that different extraction and detection methods for the analysis of antibiotic residues in different ways, including accelerated solvent extraction and high performance liquid

4、 chromatography mass spectrometry.Keywords:Antibiotics; Soil residue; Detection method; Research and analysis前言抗生素是由細(xì)菌、真菌及其他生物（動(dòng)植物包括在內(nèi)）在生命活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的（也可由其他方法獲得的），能夠抑制他種生物功能或殺死他種生物的有機(jī)質(zhì)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展，抗生素量產(chǎn)得以實(shí)現(xiàn)。抗生素在醫(yī)療和禽畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)揮著積極不可替代的作用，但由于抗生素的選擇作用，誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，使得滅菌處理辦法漸漸失效，從而危及公眾身體健康，增加社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，由于抗生素的濫用，

5、使得它成為一種新型環(huán)境污染物，使用過(guò)后通過(guò)各種途經(jīng)進(jìn)入并殘留于土壤環(huán)境中，造成對(duì)土壤質(zhì)量、微生物及動(dòng)植物不可忽視的影響，形成一種潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目前，抗生素污染問(wèn)題已經(jīng)被許多發(fā)達(dá)國(guó)家（如歐盟和美國(guó)）列為重要的環(huán)境問(wèn)題，相關(guān)的基礎(chǔ)研究正在迅速開(kāi)展。大多數(shù)抗生素由于其具有水溶性較好、體內(nèi)代謝后大部分以原形排出以及在環(huán)境中不易發(fā)生生物降解等特點(diǎn)，容易在環(huán)境中儲(chǔ)存和蓄積1。,禽畜糞便用作生物有機(jī)肥料施用農(nóng)田，其中還含有的活性抗生素在土壤表層積累或隨徑流進(jìn)入地表水或滲入地下水，并隨之遷移污染更大范圍的土壤，對(duì)人體健康造成影響2。目前致病菌耐藥性的增加和擴(kuò)散已經(jīng)成為全球疾病治療所面臨的一個(gè)巨大問(wèn)題。自Pr

6、uden等(2006)將抗生素抗性基因作為一種新型環(huán)境污染物提出之后,有關(guān)其在各種環(huán)境中的傳播、分布特征及遷移轉(zhuǎn)化機(jī)制等研究已引起廣泛關(guān)注。一系列監(jiān)測(cè)抗生素的技術(shù)被逐漸應(yīng)用于其污染的環(huán)境領(lǐng)域，促進(jìn)殘留在土壤中抗生素污染的治理與預(yù)防。1抗生素土壤污染概況研究表明，動(dòng)物和人類使用的抗生素后，只有很小一部分能被機(jī)體吸收，之后經(jīng)過(guò)經(jīng)基化、裂解、葡萄糖昔酸化等代謝反應(yīng)生成無(wú)活性的產(chǎn)物，絕大部分（以上）抗生素不能被機(jī)體吸收，最終以原藥形態(tài)直接排放于環(huán)境中3。人體或動(dòng)物正常的新陳代謝只是抗生素等藥物成分進(jìn)入自然環(huán)境的渠道之一。相比之下，藥物在生產(chǎn)過(guò)程中或未經(jīng)使用（過(guò)期和使用剩余藥物）即遭丟棄造成的污要嚴(yán)重得

7、多。我國(guó)每年生產(chǎn)抗生素原料約 21 萬(wàn) t，其中出口 3萬(wàn) t，剩下的 18 萬(wàn) t 用于國(guó)內(nèi)醫(yī)療及農(nóng)牧漁業(yè)使用，其中又有9.7萬(wàn)t用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，占年總產(chǎn)量的46.1%。大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收，高達(dá) 85%以上抗生素以原形或代謝物形式由病人和畜禽排泄物排入環(huán)境，經(jīng)不同途徑對(duì)土壤和水體造成污染4。 國(guó)際先驅(qū)導(dǎo)報(bào)在2015年7月報(bào)道：葡萄牙全國(guó)藥品協(xié)會(huì)發(fā)布的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)中顯示，其全國(guó)每年產(chǎn)生的藥物垃圾總量高達(dá)近千萬(wàn)噸，其中多數(shù)為消費(fèi)者過(guò)量購(gòu)買，醫(yī)生超劑量開(kāi)具藥方造成的浪費(fèi)，而每年回收的廢棄藥物不足總量的1/5；美國(guó)調(diào)查人員曾對(duì)美國(guó)政府20年來(lái)的相關(guān)記錄進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，包括一些大藥廠在內(nèi)的美國(guó)制

8、造業(yè)至少向水體排放了12.3萬(wàn)噸用于生產(chǎn)藥物或工業(yè)及生活用品的化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)而這些抗生素污染物隨水體流動(dòng)污染更大范圍的土壤。 回收不到位導(dǎo)致抗生素污染，但這只是直接原因，背后的深層原因則是抗生素的濫用。除了人類病患使用，畜牧業(yè)中也存在抗生素濫用問(wèn)題，并且這一領(lǐng)域更容易出現(xiàn)抗生素污染問(wèn)題。英國(guó)新科學(xué)家雜志就曾報(bào)道說(shuō)，每年歐盟國(guó)家消耗的抗生素總量中，約有一半用于治療或預(yù)防家畜疾病。參與這項(xiàng)研究的瑞士聯(lián)邦環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所的科學(xué)家指出，這些抗生素不僅會(huì)通過(guò)肉類食品進(jìn)入人類食物鏈，還會(huì)隨家畜的排泄物大量進(jìn)入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，被農(nóng)作物吸收。研究人員對(duì)瑞士一些農(nóng)田里的泥土進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中抗生素含量很高。由于

9、瑞士已經(jīng)禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素，這一發(fā)現(xiàn)意味著其它國(guó)家的農(nóng)田抗生素污染可能更嚴(yán)重。尤其使人擔(dān)心的是不易溶于水也不易分解的硫胺類藥物，科學(xué)家估計(jì)瑞士農(nóng)田里的硫胺藥物含量可能高達(dá)1Kg/ha，他們認(rèn)為這足以促使大腸桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性,進(jìn)而留下潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，危及人類社會(huì)和諧發(fā)展。因此分析抗生素在土壤環(huán)境中的分布、遷移、轉(zhuǎn)化研究十分必要，借助分子結(jié)構(gòu)參數(shù)與模型工具，對(duì)其土壤環(huán)境行為規(guī)律進(jìn)行分析和研究，有助于土壤質(zhì)量與農(nóng)產(chǎn)品安全的提升4。2抗生素在環(huán)境中的殘留 抗生素的濫用使得越來(lái)越多的抗生素未經(jīng)合理處理即釋放到環(huán)境中，最后，經(jīng)一系列的轉(zhuǎn)歸機(jī)制殘留到土壤中，造成對(duì)土壤微生物群落的改變，引發(fā)嚴(yán)重的

10、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，抗生素在土壤中的殘留分析日益受到人們關(guān)注。2.1抗生素在環(huán)境的來(lái)源及去路 由抗生素的使用途徑便可知，環(huán)境中抗生素污染來(lái)源主要是醫(yī)用藥物和農(nóng)用獸藥的使用。醫(yī)用抗生素來(lái)源主要?dú)w為下列5類：隨病人尿液、糞便排出的處方抗生素；抗生素生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的固體廢棄物如菌濱，其主要成分為抗生素產(chǎn)生菌的菌絲體、殘留培養(yǎng)基及少量抗生素及其降解物等。在藥瓶和醫(yī)療器械上殘留的抗生素；醫(yī)藥企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中損失的抗生素；醫(yī)院、家庭丟棄的過(guò)期抗生素；目前獸藥抗生素的使用和消耗遠(yuǎn)超出醫(yī)用抗生素。獸藥抗生素主要用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中作為動(dòng)物飼料添加劑，來(lái)刺激動(dòng)物生長(zhǎng)，促進(jìn)產(chǎn)量。獸藥抗生素來(lái)源主要為：動(dòng)物

11、養(yǎng)殖中，經(jīng)動(dòng)物糞便、尿液排出的抗生素；水產(chǎn)養(yǎng)殖中，直接施用的獸藥；獸藥生產(chǎn)過(guò)程中損失、廢棄的獸藥7。2.2抗生素在環(huán)境中的遷移 含有抗生素的類便污水經(jīng)城市污水處理廠處理后殘留的污泥，用作農(nóng)間施肥是抗生素進(jìn)入土壤環(huán)境的主要途徑，經(jīng)雨水淋洗、地表徑流，進(jìn)入河流、湖泊造成地表水污染，同時(shí)土壤中的抗生素通過(guò)滲濾作用造成地下水污染。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的使用是水環(huán)境中抗生素來(lái)源的一個(gè)重要途徑。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，作為飼料添加劑被直接投加到水中的藥物，只有極少部分能被魚(yú)類食用，大部分是直接進(jìn)入水體或吸附在水底游泥中，據(jù)估計(jì)有70%旳藥物沒(méi)有被魚(yú)類食用，而是進(jìn)入環(huán)境5。此外水體或沉積物的侵蝕可能會(huì)削弱抗生素在環(huán)境中的

12、遷移6。藥物生產(chǎn)過(guò)程損失的抗生素會(huì)隨著廢水進(jìn)入城市污水處理廠，而廢棄的藥物被丟棄，當(dāng)作垃圾填埋，最終進(jìn)入到土壤和地下水中?？股氐霓D(zhuǎn)歸機(jī)理如表1所示：表1 抗生素進(jìn)入土壤環(huán)境的主要途徑2.3抗生素在土壤中的殘留 丹麥的Sengelov8在長(zhǎng)期施用豬糞的農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)了大量的抗性菌株，且豬糞使用量越大，抗性菌株的抗性越強(qiáng)，菌株抗性的增強(qiáng)側(cè)面反映出當(dāng)?shù)剞r(nóng)田土壤中的抗生素含量上升。Ho等9分析馬來(lái)西亞土壤樣品，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力霉素和氟甲喹最高濃度分別達(dá) 78 516.1g/kg 和 1 331.4 g/kg。Ji等10在上海多個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)中取樣，發(fā)現(xiàn)氯霉素、磺胺和四環(huán)素的濃度范圍分別為 3.27 17.85、5.8

13、5 33.37 和4.54 24.66 mg/kg?？股貙儆诳呻x子化極性有機(jī)化合物，由于其在水中溶解度大，既可以離子形態(tài)存在又可以分子形態(tài)存在，從而導(dǎo)致它們?cè)谕寥?沉積物上的吸附機(jī)理比較復(fù)雜，可通過(guò)氫鍵、范德華力等分子間作用力與土壤中有機(jī)質(zhì)或無(wú)機(jī)膠體表面吸附位點(diǎn)作用，或通過(guò)陽(yáng)離子交換、靜電、鍵橋、配位或絡(luò)合等多種作用被吸持在土壤中11。Boxall等（2002）提出土壤類型會(huì)影響抗生素在土壤中的吸附，黏壤質(zhì)土壤與砂土相比，有更豐富的黏粒、有機(jī)質(zhì)和氧化鐵，因此比砂質(zhì)土壤對(duì)抗生素有更強(qiáng)的吸附能力。Prado 等12在研究泰樂(lè)菌素在活性污泥上的生物降解和生物吸附時(shí)發(fā)現(xiàn)，泰樂(lè)菌素的朗繆爾最大吸附量為

14、7.7 mg/g。泰樂(lè)菌素在土壤中的吸附順序是：細(xì)有機(jī)黏土細(xì)無(wú)機(jī)黏土粗有機(jī)黏土粗無(wú)機(jī)黏土，表明質(zhì)地與有機(jī)物含量決定土壤對(duì)泰樂(lè)菌素的吸附能力。 Hu等13對(duì)中國(guó)北方有機(jī)蔬菜基地的典型獸用抗生素在土壤、蔬菜和地下水中的存在和來(lái)源分析發(fā)現(xiàn)，抗生素主要通過(guò)水轉(zhuǎn)運(yùn)以及蔬菜的被動(dòng)吸附，所有樣品中抗生素的含量在冬季明顯高于夏季，表明高溫促進(jìn)抗生素在土壤中的遷移與轉(zhuǎn)化，抗生素在土壤中殘留時(shí)間取決其降解速率?？股卦谕寥乐械慕到馀c它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)、所處的溫度，以及其他一些因素如濕度、降雨以及土壤的性質(zhì)等有關(guān)，自然條件下的影響因素較多，往往比試驗(yàn)條件下降解快。亞表層土壤抗生素殘留量和檢出率均高于表層土壤?？股卦谕?/p>

15、壤中的降解速率常數(shù)與有機(jī)質(zhì)、氧化鐵、陽(yáng)離子交換總量和黏粒含量成反比。Cruz等（2003）得出土壤有機(jī)質(zhì)、氧化鐵、陽(yáng)離子交換總量、黏粒含量越高，抗生素在土壤中的降解速率越小，在土壤中就越穩(wěn)定。泰樂(lè)菌素在土壤中降解也很快，半衰期在48天，也有報(bào)告顯示半衰期高達(dá)67天14。Ingerslev等（2001）土壤濕度也是影響抗生素在土壤中降解的重要因素，通過(guò)改變土壤孔隙度、氧化還原電位、抗生素溶解性以及抗生素和土壤的吸附作用等對(duì)抗生素降解產(chǎn)生影響。袁蕾等在北京和山東兩地對(duì)阿維菌素在油菜和土壤中殘留及降解行為的研究表明，阿維菌素在油菜和土壤中的半衰期分別為 1.71.8 天和 3.5 3.9 天15?？?/p>

16、生素降解過(guò)程包括水解、光降解和生物降解。低濃度的抗生素易吸附于有機(jī)質(zhì)含量高、靜電作用強(qiáng)的黏壤質(zhì)土壤；大多數(shù)抗生素降解過(guò)程主要受水分和 pH 的影響，以生物降解為主，也較易發(fā)生水解，在中性條件下水解較慢4。 2.4對(duì)人類健康的潛在危害 土壤中殘留的抗生素會(huì)污染轉(zhuǎn)移至水體，形成一個(gè)持久性抗生素釋放源，抗生素及其衍生物能通過(guò)飲用水對(duì)人體健康造成威脅，雖然只是痕量殘留，但是長(zhǎng)期飲用隨著在人體中的富集作用，會(huì)逐漸降低機(jī)體免疫力。同時(shí)，殘留的抗生素通過(guò)食物鏈?zhǔn)澄锞W(wǎng)傳遞，在高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物體內(nèi)富集的濃度比環(huán)境中濃度擴(kuò)大多倍，造成對(duì)高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物的危害; 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)常使用磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和某些氨基糖苷

17、類抗生素，殘留于水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)品的抗生素經(jīng)攝入進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)有致敏，產(chǎn)生抗體的作用; 更甚者可致癌、致畸、致突變或干擾人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)16。3殘留抗生素的分析方法 抗生素作為一種新型環(huán)境污染物，已引起國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。進(jìn)行土壤環(huán)境中抗生素殘留的危險(xiǎn)評(píng)估要解決的首要問(wèn)題是建立和完善土壤抗生素的高精度多組分的檢測(cè)分析方法。目前，土壤中抗生素的分析方法主要包括樣品前處理和檢測(cè)兩部分。3.1樣品前處理 土壤樣品中抗生素含量較低，而且土壤樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾測(cè)定物質(zhì)多，待測(cè)抗生素不易從土壤中分離、提純。樣品前處理的目的就是把抗生素從土壤中分離提純，除去樣品溶液中對(duì)分析儀器、對(duì)目標(biāo)物質(zhì)分析造成損壞和干擾的雜質(zhì)

18、。同時(shí)，對(duì)樣品基質(zhì)中的微量抗生素進(jìn)行富集并將目標(biāo)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的形式并溶于可進(jìn)行分析的介質(zhì)中。樣品前處理的過(guò)程通常包括提取、凈化和濃縮三步。在設(shè)計(jì)樣品前處理方法時(shí)，必須考慮待測(cè)組分的理化性質(zhì)、其存在狀態(tài)、樣品基質(zhì)的化學(xué)組成、含有的可能的干擾物類型、所用處理方法對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響以及最終形成的測(cè)定方法。 土壤樣品的前處理過(guò)程包括加速溶劑萃取、旋蒸濃縮、固相萃取、氮吹濃縮、復(fù)溶和過(guò)濾。加速溶劑萃取的作用將抗生素從土壤基質(zhì)中分離出來(lái)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的作用為去除溶劑中的乙睛，避免乙睛影響HLB小柱對(duì)抗生素的富集。固相萃取的主要作用有兩個(gè)，其一為去除萃取劑中強(qiáng)陰離子等雜質(zhì)，避免雜質(zhì)干擾分析，損害儀器;其二為

19、對(duì)抗生素進(jìn)行富集。洗脫是用吸引力更強(qiáng)的甲醇溶液使附在HLB小柱上的抗生素進(jìn)入甲醇中。氮吹濃縮的作用為去除洗脫HLB小柱甲醇溶液，使抗生素濃度達(dá)到檢測(cè)器的響應(yīng)范圍，也為下一步轉(zhuǎn)變基質(zhì)做準(zhǔn)備。復(fù)溶的作用為改變待測(cè)組分基質(zhì)，由純甲醇轉(zhuǎn)為更適用于質(zhì)譜分析的甲醇一水溶(v:v=1:1)?；前奉?、喳諾酮類、四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酷類抗生素是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用較廣的抗生素，在環(huán)境中往往同時(shí)存在，因此本研究以上述四類抗生素為目標(biāo)抗生素。己有的關(guān)于環(huán)境中抗生素的分析檢測(cè)方法的報(bào)道很多11-13，但多側(cè)重于某一類抗生素的檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)多類抗生素的方法尚需改進(jìn)和提高。此外，土壤中抗生素濃度較低，已有的HPLC-UV及HP

20、LC-FLD等方法檢測(cè)限較高且用時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足精確測(cè)量實(shí)際樣品中抗生素殘留的要求。高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS )可以同時(shí)是測(cè)定樣品中多個(gè)組分且靈敏度高，穩(wěn)定性好，成為本研究首選的檢測(cè)方法。3.1.1提取方法傳統(tǒng)提取方法主要有機(jī)械搖動(dòng)法、組織搗碎法、索氏提取法等，但上述方法普遍存在有機(jī)溶劑使用量大、操作步驟多、檢測(cè)誤差大等問(wèn)題，應(yīng)用己較少。目前常用的土壤抗生素提取方法為超聲輔助提?。⊿onication Assisted Extraction, SAE).加速溶劑萃取技（Accaelerated Solvent Extraction,ASE)，作為一種新型的樣品處理技術(shù)在國(guó)外已開(kāi)始

21、應(yīng)用于土壤抗生素的提取。 超聲輔助萃?。⊿AE)：超聲輔助萃取在提取樣品中主要作用為通過(guò)空化作用使分子運(yùn)動(dòng)加速，將超聲波的能量傳遞到各個(gè)樣品中，加快待測(cè)組分脫附和溶解的速度。超聲輔助萃取具有操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)提取多各樣品的優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于藥物殘留、天然藥物成分提取和醫(yī)療化工等分析領(lǐng)域。 加速溶劑萃?。ˋSE)：加速溶劑萃取是在較高溫度和壓力下，用有機(jī)溶劑萃取固體或半固體的自動(dòng)化方法。通過(guò)提高溫度能極大的減弱范德華引力、氫鍵、目標(biāo)物分子和樣品基質(zhì)活性位置的偶極吸引所引起的相互作用，同時(shí)降低溶劑粘度，加速溶劑向基體中擴(kuò)散，加速目標(biāo)物從基體進(jìn)入到溶劑中。通過(guò)加壓使溶劑在高溫下保持液態(tài)并使萃取劑

22、快速填滿萃取池。ASE（Accelerate Solvent Extrac- tion）技術(shù)是在高溫、高壓工作下提取目標(biāo)物，通過(guò)提高目標(biāo)物在溶劑中的溶解度，增加溶劑對(duì)基質(zhì)的穿透力，來(lái)提高萃取效率，因而其廣泛應(yīng)用于土壤、底泥中有機(jī)污染物的萃取17-20。與傳統(tǒng)提取方法相比，加速溶劑萃取具有有機(jī)溶劑使用量少、速度快、提取效率高、操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，已被美國(guó)環(huán)保局選定推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法（標(biāo)準(zhǔn)方法編號(hào)為3545）。雖然ASE是近年才發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，但由于其優(yōu)點(diǎn)突出，已受到分析化學(xué)界的極大關(guān)注，并在環(huán)境、食品和藥物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前，在環(huán)境分析中，已廣泛用于土壤、沉積物、污泥、動(dòng)植物組織、

23、蔬菜和水果等樣品中的農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等的萃取。經(jīng)過(guò)分別用ASE方法和SAE方法處理加標(biāo)200g/kg的空白仁樣，用優(yōu)化后的HPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)，回收率結(jié)果見(jiàn)圖1。采用ASE方法處理加標(biāo)樣品，目標(biāo)抗生素回收率均在60%85%，而SAE方法的回收率在50%80%?？梢?jiàn)。ASE方法的提取效果要好于SAE法。圖1 ASE與SAE提取加標(biāo)200g/kg土樣的回收率比較213.1.2凈化方法在提取過(guò)程中，許多與待測(cè)組分溶解性相似的雜質(zhì)會(huì)被一起分離并轉(zhuǎn)移到萃取劑中。凈化過(guò)程就是將待測(cè)組分與雜質(zhì)分離幵來(lái)。常用的凈化方法有液液萃?。↙iquid Liquaid Extraction,LLE)和固

24、相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE)液液萃?。↙LE):是用選定的溶劑分離液體混合物中某種組分的過(guò)程。利用液體混合物中各組分在某溶劑中溶解度的差異最終達(dá)組分分離的目的。溶劑必須與被萃取的混合物溶液不相溶，具有選擇性的溶解能力，而且性質(zhì)穩(wěn)定。固相萃?。⊿PE):是一個(gè)包括液相和固相的物理萃取過(guò)程，通過(guò)固相萃取小柱實(shí)現(xiàn)。固相萃取的主要作用有：去除干擾雜質(zhì)、富集待測(cè)組分和根據(jù)分析需要改變待測(cè)組分的基質(zhì)。在固相萃取中，固相對(duì)分離物的吸附力比溶解分離物的溶劑更大。因此，當(dāng)樣品溶液通過(guò)吸附劑床時(shí)，待測(cè)組分便會(huì)被吸附在其表面，而其他成分通過(guò)吸附劑床。固相萃取一般包括活化萃取柱、上樣

25、、洗脫三步?；罨腿≈菫榱顺鋈ブ觾?nèi)雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境；上樣即將樣品轉(zhuǎn)移入柱，去除雜質(zhì)，富集待測(cè)組分；洗脫即用比吸附劑吸引力更強(qiáng)的溶劑將吸附于吸附劑床的待測(cè)組分洗脫下來(lái)。固相萃取通過(guò)選取不同的填料，基本能滿足各種組分的分析要求，應(yīng)用范圍廣泛。本次研究采用SAX-HLB串聯(lián)固相萃取小柱對(duì)土壤提取液進(jìn)行凈化和富集，柱主要作用為去除強(qiáng)陰離子雜質(zhì)，柱主要作用為富集抗生素。3.1.3濃縮方法待測(cè)組分經(jīng)過(guò)提取和凈化后經(jīng)常存在待測(cè)物溶劑與液相色譜分析不兼容、濃度低于檢測(cè)器的響應(yīng)范圍等問(wèn)題，無(wú)法直接進(jìn)行檢測(cè)。這就需要對(duì)樣品溶劑進(jìn)行進(jìn)一步處理，去除與液相色譜分析不兼容的組分，并對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行富集濃縮。常

26、見(jiàn)的濃縮方法為溶劑揮發(fā)法，其實(shí)現(xiàn)方式主要有減壓蒸溜和氣流吹蒸兩種。相應(yīng)常用裝置為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和氮吹儀。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮是在減壓加熱的情況下將液體快速蒸發(fā)掉，濃縮速度快且可以回收溶劑。氮吹濃縮是指用氮?dú)饬鲗⑷軇С鰳悠?，僅適合少量液體的濃縮。為了減小濃縮過(guò)程的損失，蒸發(fā)溫度不宜過(guò)高，吹蒸速度不宣過(guò)快，不能將樣品直接蒸干，蒸干會(huì)導(dǎo)致蒸汽壓高的組分被溶劑或氣流帶出，而極性高的組分也可能與樣品基質(zhì)或玻璃器皿結(jié)合的更加緊密，導(dǎo)致回收率的下降。本次研究采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)對(duì)萃取液進(jìn)行濃縮，氮吹對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮。3.2檢測(cè)方法 國(guó)內(nèi)外抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)發(fā)展十分迅速，定性定量的方法主要有微生物法、薄層色譜法（TLC)、酶聯(lián)

27、免疫法（ELISA)、高效液相色譜法（HPLC)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS)。微生物法主要根據(jù)抗微生物藥對(duì)特異微生物產(chǎn)生抑制作用這一特點(diǎn)來(lái)對(duì)環(huán)境中殘留的抗生素進(jìn)行定性定量的分析，這一方法曾是抗生素檢測(cè)的主導(dǎo)方法。由于存在靈敏度低、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、易受干擾等弊端，目前已不常用。薄層色譜法和酶聯(lián)免疫法通常常用來(lái)作為樣品的蹄選方法，在定量分析方面存在不足?，F(xiàn)在常用的檢測(cè)抗生素殘留的方法有高效液相色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。3.2.1高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC): 本世紀(jì)年代末年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)。高效

28、液相色譜儀由進(jìn)樣器、高壓輸液系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)分析與處理系統(tǒng)等部分構(gòu)成，常配備檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器（UV)和突光檢測(cè)器（FLD)。根據(jù)選用檢測(cè)器的不同分為高效液相色譜紫外檢測(cè)（HPLC-UV)和高效液相色譜焚光檢測(cè)法(HPLC-FLD)。高效液相色譜法具有靈敏度高，檢測(cè)迅速可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或半自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。目前己廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢、法檢等領(lǐng)域，并且在抗生素殘留檢測(cè)中也被廣泛應(yīng)用。3.2.2高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（High Performance Liquid Chromatography- mass spectrometry,HPLC-MS)： 具液相色譜的強(qiáng)分離能力，同

29、時(shí)又具有質(zhì)譜的高靈敏度和極強(qiáng)的定性鑒定能力，是目前檢測(cè)痕量抗生素發(fā)展最迅速的分析手段之一。主要有部件有高效液相色譜儀、進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、分析器、檢測(cè)器及數(shù)據(jù)采集及控制系統(tǒng)等。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，由離子源對(duì)其進(jìn)行離子化，之后，經(jīng)質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，最后由檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有分析范圍廣、分離能力強(qiáng)、定性分析結(jié)果可靠、檢測(cè)限低、分析時(shí)間快和自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)，幾乎可以檢測(cè)分析所有化合物。隨著聯(lián)用技術(shù)的趨成熟現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥等行業(yè)。高效液相色譜法僅能顯示色譜峰和保留值，不能提供待測(cè)組分的結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)保留時(shí)間定性僅適用與已知組分的定性分析，很

30、難對(duì)待測(cè)組分做出準(zhǔn)確的定性判斷。高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法不僅可以通過(guò)組分結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，并且在質(zhì)譜多反映檢測(cè)模式（MRM)下可以同時(shí)、專屬、靈敏地定量測(cè)定供試樣品中的多個(gè)組分。因此，本次研究選用HPLC-MS法對(duì)土壤中抗生素進(jìn)行分析檢測(cè)。 目前用加速溶劑萃取方法（ASE)提取動(dòng)物性食品抗生素殘留的研究已有報(bào)道22，但在土壤抗生素領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少。國(guó)外已有關(guān)于提取土壤抗生素的研究國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。在方法中，參數(shù)，尤其是溫度和循環(huán)次數(shù)是影響提取效率的關(guān)鍵因素。同時(shí)，萃取劑和分散劑的選用也是方法需要重點(diǎn)考慮的對(duì)象。已有報(bào)道中，對(duì)于萃取溫度、循環(huán)次數(shù)、萃取劑和分散劑的優(yōu)化只涉及其中一種或幾種，沒(méi)

31、有對(duì)四方面進(jìn)行全方位優(yōu)化，且存在提取抗生素種類單一的缺點(diǎn)。因此，本研究將針對(duì)上述四個(gè)方面對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，建立同時(shí)提取多組分抗生素的更加完善的方法。擴(kuò)胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)醋類抗生素是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用較廣的抗生素，在環(huán)境中往往同時(shí)存在，因此本研究以上述四類抗生素為目標(biāo)抗生素。已有的關(guān)于環(huán)境中抗生素的分析檢測(cè)方法的報(bào)道很多丨但多側(cè)重于某一類抗生素的檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)多類抗生素的方法尚需改進(jìn)和提高。此外，土壤中抗生素濃度較低，己有的及等方法檢測(cè)限較高且用時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足精確測(cè)量實(shí)際樣品中抗生素殘留的要求。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜可以同時(shí)是測(cè)定樣品中多個(gè)組分且靈敏度高，穩(wěn)定性好，成為本研究首選的檢

32、測(cè)方法。依據(jù)美國(guó)EPA Method1694（2007)方法建立色譜質(zhì)譜條件23，并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)化。美國(guó)EPA的液相色譜方法中流動(dòng)A為含有0.3%甲酸和0.1%甲酸銨的水溶液，B相為乙睛:甲醇=1:1 （V/V），在033 min采集時(shí)間里進(jìn)行流速和流動(dòng)相組合梯度變化的洗脫。本文將流動(dòng)相條件改變?yōu)榈榷认疵?，?.4%甲酸:乙睛=78:22 CV/V)，采集時(shí)間12 min，通過(guò)簡(jiǎn)化的色譜條件，能夠保證目標(biāo)物的離子化效率和靈敏度24。土霉素（oxytetracycline，OTC）、四環(huán)素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）及強(qiáng)力霉素（doxyc

33、ycline，DC）通過(guò)土壤基質(zhì)加標(biāo) 0.5 gg-1的4 組四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)樣品，比較了 Oasis-HLB、Oasis-HLB 與 MAX 串聯(lián)、Oasis-MAX 固相萃取柱的凈化效率和回收率，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，HLB 與 MAX 串聯(lián)固相萃取柱的凈化效果好于 HLB 和 MAX 單固相萃取柱的凈化效果，而MAX 單固相萃取柱的凈化效果好于 HLB 單柱效果，說(shuō)明土壤中有機(jī)質(zhì)干擾物主要通過(guò)陰離子交換柱來(lái)進(jìn)行去除。HLB 與MAX 串聯(lián)固相萃取柱的回收率要低于單柱，因此選取 Oasis-MAX 固相萃取柱用于凈化富集更優(yōu)24。（Oasis-HLB 固相萃取柱和 Oasis-WAX 固相萃取柱（W

34、ATERS 公司）4結(jié)果分析 與國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)抗生素的殘留監(jiān)測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作還很薄弱，而目前四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法更多集中于畜禽養(yǎng)殖農(nóng)產(chǎn)品、食物領(lǐng)域中25-27，急需高靈敏度、高選擇性的土壤中四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)方法。 ASE-HPLC-MS/MS 法測(cè)定土壤中四環(huán)素類抗生素殘留，該方法具有較高靈敏度，檢測(cè)限達(dá)到 gkg-1 痕量水平，樣品加標(biāo)回收率在 60.1%103.8%24。在空白土樣基質(zhì)溶液中加入 TC、OTC、CTC、DC 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制濃度為 0.002、0.005、0.010、0.050、0.1 和 0.5 gmL-1 的基質(zhì)加標(biāo)溶液，根據(jù)上述 1.5 小節(jié)

35、中儀器條件進(jìn)行分析，以峰面積與濃度作圖，得出4 個(gè)組分的線性方程和相關(guān)系數(shù)及線性范圍。結(jié)果表明，所測(cè)組分在表2中的濃度范圍內(nèi)有良好線性。方法檢測(cè)限計(jì)算采用空白樣品添加方法進(jìn)行，配置 TC、OTC、CTC、DC 的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，不斷稀釋后得到高于3倍信噪比的儀器檢測(cè)限和高于10倍信噪比的定量限，結(jié)果見(jiàn)表2,可見(jiàn)在該方法中：金霉素的線性范圍最廣檢出限定量限最高；強(qiáng)力霉素和土霉素的線性范圍一致檢出限和定量限也基本相同，前者略高;四環(huán)霉素的檢出限和定量限最小，回收率最大，線性范圍略比土霉素和強(qiáng)力霉素大。 表2 方法的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及精密度24菜田土壤樣品中TC

36、s 的總檢出率為 64%，3 種抗生素中土霉素檢出率最低為 18%，最高值達(dá)到105. 6 g /kg( 風(fēng)干基) ; 四環(huán)素檢出率為 36% ，最高值達(dá)到 196. 7 g /kg; 金霉素檢出率為 32% ，最高值達(dá)到 477. 8g/kg28。廣州、深圳等地菜地土壤中 3種四環(huán)素類單個(gè)化合物檢出率為 19. 4% 96.8%，平均含量為9.6 44.1 g/kg29; 東莞長(zhǎng)期使用養(yǎng)殖場(chǎng)糞肥的蔬菜基地土壤中 OTC 平均含量為 9. 0g/kg，CTC 平均含量為 5. 1 g/kg30。導(dǎo)致不同地區(qū)土壤調(diào)查結(jié)果差異明顯的原因很多，既有有機(jī)肥本身殘留水平的差異，也與不同作物、土壤施用有機(jī)

37、肥數(shù)量差異巨大有關(guān)，與有機(jī)肥的分解速率以及抗生素在不同氣候、土壤條件和微生物群系的積累特點(diǎn)也有關(guān)31。天津土壤樣品中 TCs 的總檢出率為 64% 。三種抗生素中，OTC 檢出率最低( 18%) ，最高值達(dá)到105. 6 g/kg( 風(fēng)干基) ，平均9.4 g/kg; TC 檢出率為 36%，最高值達(dá)到 196.7 g/kg，平均 28.9g/kg; CTC 檢出率為 32% ，最高值達(dá)到 477. 8g/kg，平均 48. 9 g/kg。有 6 個(gè)菜田土壤樣品( 占調(diào)查樣品的 27. 3%) TCs 總量超過(guò)生態(tài)安全觸發(fā)線，存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。天津菜田土壤中的 TCs 的殘留主要由畜禽肥帶來(lái)

38、，調(diào)查土壤中抗生素殘留未隨種菜年限延長(zhǎng)而增加，溫室和大棚土壤的 TCs 殘留水平高于露地土壤30。奧地利的研究發(fā)現(xiàn)，雖然糞肥中CTC、OTC 和 TC 含量分別高達(dá) 46、29 和 23 mg /kg，但施用該糞肥土壤中檢測(cè)不到 OTC 和 TC，而 CTC含量卻高達(dá)391 g/kg32。不同蔬菜根際理化特征也有差異，導(dǎo)致了根際微生物種群結(jié)構(gòu)與功能不同，對(duì)不同抗生素的降解、吸收和積累特征不同，同一基地種植不同蔬菜，土壤中檢測(cè)出的 TCs 組成特征也會(huì)不同30。由于 TCs 在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中的使用普遍，雖然不同地區(qū)施用有機(jī)肥后土壤中 TCs 殘留特征和殘留水平不同，但是其檢出率卻普遍較高。5展望

39、隨著時(shí)代的進(jìn)步，越來(lái)越多的新技術(shù)將被發(fā)明并用用于土壤抗生素的檢測(cè)。此外，市場(chǎng)對(duì)蔬菜、瓜果等需求量和品質(zhì)要求的提高，對(duì)土壤環(huán)境的質(zhì)量更加重視。土壤中殘留的抗生素作為持久性有機(jī)污染物，它在生態(tài)環(huán)境，特別是“有機(jī)肥一土壤一農(nóng)作物”途徑中產(chǎn)生的影響，會(huì)對(duì)人類的健康造成嚴(yán)重危害。賀德春等33按照農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式種植小白菜與白蘿卜，證明四環(huán)素等抗生素在人工控制和自然條件下，均可從施肥土壤中向農(nóng)作物遷移，這種遷移途徑增加了抗生素通過(guò)食物鏈傳遞對(duì)人類健康產(chǎn)生危害的風(fēng)險(xiǎn)。目前，較多的研究停留在抗生素在糞肥、土壤和農(nóng)作物中的表面行為，但缺乏對(duì)機(jī)理方面的解釋。由此，針對(duì)目前的研究，還需要在以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究工作:(1

40、)需要探討土壤中各類抗生素的吸附、降解機(jī)理，使含抗生素的有機(jī)肥等在施入土壤前，將殘留抗生素降至最低或去除，切斷抗生素由肥料進(jìn)人土壤的途徑;(2)某些抗生素的降解產(chǎn)物同樣具有生態(tài)毒性，在進(jìn)行抗生素降解試驗(yàn)中，需對(duì)其降解產(chǎn)物有足夠重視;(3)某些農(nóng)作物(如紫花首蓓)可以主動(dòng)吸收部分抗生素，且會(huì)對(duì)某類抗生素進(jìn)行富集，在考慮使用具有此類功能的植物，進(jìn)行被抗生素污染土壤修復(fù)問(wèn)題的同時(shí)34，更應(yīng)該對(duì)此類植物成熟后，是否可以用作飼料添加物開(kāi)展研究工作，這對(duì)農(nóng)業(yè)及畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要意義。參考文獻(xiàn)1 史 奕，趙牧秋，王 俊，等.設(shè)施菜地土壤-植物系統(tǒng)中有機(jī)肥源抗生素的影響研究進(jìn)展J.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，

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