血紅蛋白的提取和分離4

1、 體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過 程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生 物大分子的基本原理。物大分子的基本原理。 凝膠色譜法凝膠色譜法 電泳法電泳法 緩沖溶液緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理緩沖溶液的組成和作用機(jī)理 凝膠色譜法的原理和方法凝膠色譜法的原理和方法 樣品的處理樣品的處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。色譜柱填料的處理和

2、色譜柱的裝填。 血血 每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，亞鐵血紅素基團(tuán)， 此基團(tuán)可攜帶此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二 氧化碳，氧化碳，血紅蛋白因含有血紅蛋白因含有血紅素血紅素而而 呈呈紅色。紅色。 選用一定的選用一定的物理或化學(xué)物理或化學(xué)的方法分離具有不同物的方法分離具有不同物 理或化學(xué)性質(zhì)的理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子生物大分子。 根據(jù)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性各種特性的差異，如的差異，如分子的形狀和分子的形狀和 大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì) 和對(duì)其他分子的親和力和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分離等等，

3、可以用來分離不同種不同種 類類的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 大多數(shù)凝膠是由大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物多糖類化合物構(gòu)成的構(gòu)成的多孔多孔小小 球體，球體，內(nèi)部有許多貫穿的內(nèi)部有許多貫穿的通道通道。 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量的大的大 小，利用具有小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進(jìn)行分離。的凝膠，來進(jìn)行分離。 當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)分 子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)， 移動(dòng)速度較慢移動(dòng)速度較慢; ;而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入而相

4、對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入 凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移 動(dòng)速度較快。動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以 分離。分離。 分離蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì) 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)外加少量強(qiáng) 酸或強(qiáng)堿酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液的影響使原來溶液PHPH值基本保持值基本保持不變的混不變的混 合溶液。合溶液。 能夠抵制能夠抵制外界的酸和堿外界的酸和堿對(duì)溶液對(duì)溶液PHPH值值的影響，的影響， 維持維持PHPH基本不變。基本不變。 通常由通常由1 12 2 種

5、緩沖劑種緩沖劑溶解于水溶解于水 中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不 同同PHPH范圍內(nèi)范圍內(nèi)使用的緩沖液。使用的緩沖液。 , , 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PHPH環(huán)境，保證環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察( () )和科和科 學(xué)研究學(xué)研究( () ) 磷酸緩沖液磷酸緩沖液 帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。 許多重要的生物大分子，如多肽、許多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一

6、定的PHPH下，下， 這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用在電場(chǎng)的作用 下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的 電極移動(dòng)。電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分電泳利用了待分離樣品中各種分 子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從 而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳、凝膠電泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝膠電泳。凝膠電泳。 1 1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用、在測(cè)定蛋白質(zhì)

7、分子量時(shí)常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸 鈉（鈉（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝 膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,NN,N- -亞甲基雙丙亞甲基雙丙 烯酰胺在烯酰胺在引發(fā)劑引發(fā)劑和和催化劑催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的的作用下聚合交聯(lián)成的 具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)） 丙烯酰胺和交聯(lián)劑丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率遷移率取決取決 于

8、它所帶于它所帶凈電荷凈電荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。 （為了消除為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，凈電荷對(duì)遷移率的影響， 可以在凝膠中加入可以在凝膠中加入SDSSDS。 。由幾條肽鏈組成。由幾條肽鏈組成 的的蛋白質(zhì)復(fù)合體蛋白質(zhì)復(fù)合體在在SDSSDS的作用下會(huì)的作用下會(huì)， 因此測(cè)定的結(jié)果只是因此測(cè)定的結(jié)果只是。SDSSDS能與各能與各 種蛋白質(zhì)形成種蛋白質(zhì)形成，SDSSDS所帶負(fù)電荷所帶負(fù)電荷 的量大大超過了蛋白質(zhì)分子的量大大超過了蛋白質(zhì)分子。因而掩。因而掩 蓋了蓋了，使電泳遷移率完，使電泳遷移率完 全取決于分子的大小。全取決于分子的大小。 用用SDSSDS測(cè)定蛋白質(zhì)分

9、子量的方法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法 樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定 （一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟 （二）操作過程（二）操作過程 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白。動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白。 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的 分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。 1 1、采集血樣。、采集血樣。2 2、低速短時(shí)間離心、低速短時(shí)間離心 （速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一 同沉淀，達(dá)不到分離的

10、效果）同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3 3、吸取血漿：上層透明、吸取血漿：上層透明 的黃色血漿。的黃色血漿。4 4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.90.9的氯化鈉溶液洗滌。的氯化鈉溶液洗滌。5 5、低速離心、低速離心（低速短時(shí)間）（低速短時(shí)間） 6 6、重復(fù)、重復(fù)4 4、5 5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表 明洗滌干凈。明洗滌干凈。 加蒸餾水到加蒸餾水到原血液體積原血液體積，再加，再加 4040體積的體積的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力攪拌器磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枭铣浞謹(jǐn)嚢?010 分鐘（分鐘（加速細(xì)胞破裂加速細(xì)胞破裂）

11、, ,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離 心管內(nèi)，以心管內(nèi)，以2000r/min2000r/min的速度離心的速度離心10 10 minmin。第第1 1層（最上層（最上 層）：甲苯層（層）：甲苯層（無色透明無色透明）；第）；第2 2層層 （中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色白色 薄層固體薄層固體）；第）；第3 3層（中下層）：血紅層（中下層）：血紅 蛋白的水溶液層（蛋白的水溶液層（紅色透明液體紅色透明液體）；第）；第 4 4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅暗紅 色色）。）。用濾紙過濾

12、，除去脂溶用濾紙過濾，除去脂溶 性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后， 分出下層的分出下層的紅色透明液體紅色透明液體。 取取1ml1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將 透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l20mmol/l的的 磷酸緩沖液磷酸緩沖液中（中（pHpH為為7.07.0），透析），透析1212小時(shí)。小時(shí)。 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。 取長(zhǎng)取長(zhǎng)4040厘米，內(nèi)徑厘米，內(nèi)徑1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨兩端需用砂紙磨

13、平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆覆 蓋尼龍網(wǎng)，再用蓋尼龍網(wǎng)，再用100100目尼龍紗包好，插到玻璃管的目尼龍紗包好，插到玻璃管的一一端端。 ：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底 面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離 不徹底。不徹底。頂塞的制作：頂塞的制作：打孔打孔安裝玻璃管安裝玻璃管。組裝：組裝：將上將上 述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。 A A、材料

14、：、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-G- 7575）。）。B B、代表意義：、代表意義：“G G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨表示凝膠的交聯(lián)程度，膨 脹程度及分離范圍脹程度及分離范圍。7575表示凝膠的得水值，即每克凝表示凝膠的得水值，即每克凝 膠膨脹時(shí)吸水膠膨脹時(shí)吸水7.57.5克?？?。 配置凝膠懸浮液：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱計(jì)算并稱 取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后， 配成凝膠懸浮液。配成凝膠懸浮液。 A A、固定：、固定：將色譜柱將色譜柱 裝置固定在支架上。裝置固定在支架上。B B、裝填：、裝填：將凝膠懸浮液一次性將凝膠

15、懸浮液一次性 緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠 填裝均勻。填裝均勻。注意：注意：1 1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低 凝膠顆粒之間的空隙。凝膠顆粒之間的空隙。 2 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡 存在：存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序， 降低分離效果降低分離效果。 裝填完畢后，裝填完畢后， 立即用緩沖液洗脫瓶，在立即用緩沖液洗脫瓶，在 50cm50cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300ml300ml 的的20mmol/l20mmol/

16、l的的磷酸緩沖液磷酸緩沖液 （pHpH為為7.07.0）充分洗滌平衡充分洗滌平衡1212 小時(shí)小時(shí)。1 1、液面不要低、液面不要低 于凝膠表面，否則可能有氣于凝膠表面，否則可能有氣 泡混入，影響液體在柱內(nèi)的泡混入，影響液體在柱內(nèi)的 流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì) 的分離效果。的分離效果。2 2、不能發(fā)生洗、不能發(fā)生洗 脫液流干，露出凝膠顆粒的脫液流干，露出凝膠顆粒的 現(xiàn)象現(xiàn)象。 打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降 到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品加到色譜柱的頂端，滴加

17、 樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞 凝膠面。凝膠面。 加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝 膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)?shù)牧姿峋彌_液到適當(dāng) 高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集 流出液，每流

18、出液，每5ml5ml收集一試管，連續(xù)收集。收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如（在分離過程中，如 果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功）果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功） 正確的加樣操作：正確的加樣操作：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。2 2、 貼壁加樣。貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。 正確的加樣操作是：正確的加樣操作是：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。 2 2、貼壁加樣。、貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。 讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的讓血紅蛋白處在穩(wěn)定

19、的pHpH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。 血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色 來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常 直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括： 。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋 白的釋放、離心等操作收集到白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液血紅蛋白溶液，即，即: :樣品的處理；

20、樣品的處理； 再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后 將相對(duì)分子質(zhì)量較大的將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去雜質(zhì)蛋白除去，即，即: :樣品樣品 的純化；最后經(jīng)的純化；最后經(jīng)進(jìn)行純度鑒定。進(jìn)行純度鑒定。 鑒定血紅蛋白純度。鑒定血紅蛋白純度。 3.方法步驟：（略）方法步驟：（略） 觀察你處理的血液樣品離心后觀察你處理的血液樣品離心后是否分層是否分層（見教科書圖（見教科書圖5-5- 1818），），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋 白的原因。白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)

21、間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋 巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白 的提取純度。的提取純度。 1 1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處 理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 2 2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜 柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此

22、可以在凝膠柱旁放一支 與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可 以加入大分子的有色物質(zhì)，以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖例如藍(lán)色葡聚糖20002000或紅色葡聚糖，或紅色葡聚糖， 觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色 譜柱的性能良好。譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體 以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的

23、如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的 話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨 著洗脫液緩慢流出；著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分 離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 教學(xué)反饋教學(xué)反饋 1凝膠色譜法是根據(jù)（凝膠色譜法是根據(jù)（ ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。）分離蛋白質(zhì)的有效方法。 A分子的大小分子的大小 B相對(duì)分子質(zhì)量的大小相對(duì)分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少帶電荷的多少 D溶解度溶解度 2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制

24、外界的影響來緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來 維持（維持（ ）基本不變。）基本不變。 A溫度溫度 B pH C滲透壓滲透壓 D氧氣濃度氧氣濃度 3電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷 （ ）的電極移動(dòng)。）的電極移動(dòng)。 A相同相同 B相反相反 C相對(duì)相對(duì) D相向相向 4. 哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（ ）與氧氣的）與氧氣的 運(yùn)輸有關(guān)。運(yùn)輸有關(guān)。 A血紅蛋白血紅蛋白 B肌紅蛋白肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白肌球蛋白 B B B A 5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（血液由血漿和各種

25、血細(xì)胞組成，其中（ ） 的含量最多。的含量最多。 A白細(xì)胞白細(xì)胞 B血小板血小板 C紅細(xì)胞紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗 凝血?jiǎng)獎(jiǎng)?）。）。 A. NaCl B.甲苯甲苯 C.蒸餾水蒸餾水 D.檸檬酸鈉檸檬酸鈉 7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后， 可以明顯看到試管中的溶液分為可以明顯看到試管中的溶液分為4層，層， 其中第其中第3層是（層是（ ） A無色透明的甲苯層無色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液血紅蛋白的水溶液 D其

26、他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物 C D C 選用一定的選用一定的物理或化學(xué)物理或化學(xué)的方法分離具有不同物的方法分離具有不同物 理或化學(xué)性質(zhì)的理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子生物大分子。 根據(jù)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性各種特性的差異，如的差異，如分子的形狀和分子的形狀和 大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì) 和對(duì)其他分子的親和力和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來分離等等，可以用來分離不同種不同種 類類的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率遷移率取決取決 于它所帶于它所帶凈電荷凈電荷的多少以及的多少以及

27、分子的大小分子的大小等因素。等因素。 （為了消除為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，凈電荷對(duì)遷移率的影響， 可以在凝膠中加入可以在凝膠中加入SDSSDS。 。由幾條肽鏈組成。由幾條肽鏈組成 的的蛋白質(zhì)復(fù)合體蛋白質(zhì)復(fù)合體在在SDSSDS的作用下會(huì)的作用下會(huì)， 因此測(cè)定的結(jié)果只是因此測(cè)定的結(jié)果只是。SDSSDS能與各能與各 種蛋白質(zhì)形成種蛋白質(zhì)形成，SDSSDS所帶負(fù)電荷所帶負(fù)電荷 的量大大超過了蛋白質(zhì)分子的量大大超過了蛋白質(zhì)分子。因而掩。因而掩 蓋了蓋了，使電泳遷移率完，使電泳遷移率完 全取決于分子的大小。全取決于分子的大小。 樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定 （一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟 （二）操作過程（二）操作過程 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動(dòng)